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家兔源致病性维罗纳气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

周军;任永军;汤承

【摘要】四川某兔场家兔爆发以咳嗽、打喷嚏和流鼻液等症状的疾病.为调查其病

因,分别无菌采集5只病兔和临床健康兔肺脏分离细菌,对分离出的4株优势菌进行

16SrDNAPCR扩增测序分析鉴定,并对分离的细菌进行药敏试验和小鼠致病性试

验.结果从发病家兔肺脏分离到4株维罗纳气单胞菌,而从临床外表健康家兔肺脏未

分离到该菌;本试验分离的4株维罗纳气单胞菌均对小鼠有致病性,能引起小鼠发病

并部分死亡;分离菌对大多数氟喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类药物敏感,对大部

分氨基糖苷类药物耐药.试验首次从家兔肺脏中分离到致病性维罗纳气单胞菌,并筛

选出敏感药物,为家兔呼吸道疾病的防控提供了参考.

【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2018(044)001

【总页数】5页(P19-23)

【关键词】兔;呼吸道疾病;维罗纳气单胞菌;药敏试验

【作者】周军;任永军;汤承

【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;四川省畜牧科

学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都610066;西南民族大学生命科

学与技术学院,四川成都610041

【正文语种】中文

【中图分类】S852.6

维罗纳气单胞菌(Aeromonasveronii)，属弧菌科气单胞菌属[1].其广泛分布于有

水环境中[2]，是畜禽肉品、水产品和蔬菜的重要污染源.该菌能感染人，引起腹泻

[3]、菌血症[4]、脓毒症[5]、呼吸道感染[6]等，给人类健康造成威胁.报道显示，

维罗纳气单胞菌可引起多种鱼类致病[7-15]，给水产养殖业带来了巨大的损失；此

外，2012年李伟杰等[16]从病死的狐狸病变肝脏组织中分离到该菌，并证明该菌

有致病性.维罗纳气单胞菌致病菌株多为温和生物型[17-18].其作为一种较为新型的

人-兽-鱼共患病原菌，备受关注，但未见引起家兔致病的报道.

2017年3月，四川某兔场家兔出现咳嗽、打喷嚏和流鼻液等呼吸道症状，该兔场

基础母兔存栏量为2600只，发病率约为20%，从发病至样本采集的半个月时间

里，家兔没有出现死亡.病兔剖检主要见肺脏有出血点和纤维性渗出物.为调查其病

因，本试验无菌采集病兔肺脏进行细菌分离和鉴定，并对分离菌进行药敏试验，旨

在为兔呼吸道疾病的防控提供依据.

1材料与方法

1.1临床样本、实验动物及质控菌株

随机取5只病兔和5只临床健康兔，送四川省高等学校重点实验室待检.实验动物

为昆明系小鼠(20～22g，雌性)购自成都达硕实验动物有限公司；药敏试验质控菌

株为大肠杆菌ATCC25922，由本实验室保存.

1.2培养基及试剂

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和全血琼脂平板均购自青岛高科

园海博生物技术有限公司；细菌16SrDNA通用引物由生工生物工程(上海)股份有

限公司合成；核酸提取、Taq酶等均购自大连TaKaRa公司；马血清购自郑州佰

安生物工程有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司.

1.3病兔肺脏组织的细菌分离

对送检的10只家兔均用乙醚麻醉后放血处死，无菌采集10只家兔的肺脏划线接

种于血琼脂平板上，37℃培养12～24h；挑取形态一致的单菌落转接于含5%马

血清TSA进行纯培养.观察分离菌在血琼脂平板上和TSA上的菌落特征，并进行革

兰氏染色镜检，观察镜检形态.

1.4分离菌的16SrDNA序列PCR扩增及测序鉴定

采用文献[19]报道的细菌16srDNA的通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR

反应体系:PCR-MIX12.5μL，上、下游引物各1μL，ddH2O8.5μL，DNA模板

2μL，共25μ反应条件:95℃预变性5min；95℃变性35s，55℃退火

60s，72℃延伸60s，共完成40个循环；最后72℃，延伸8min后结束PCR

扩增.将PCR扩增产物凝胶电泳检测，并送上海生工测序.

1.5分离菌的16SrDNA序列进化分析

在NCBI上用BLAST将测序获得的维罗纳气单胞菌序列同GenBank数据库中收

录的维罗纳气单胞菌序列进行同源性比对，并从GenBank中下载了17条不同国

家或地区、不同宿主、不同时间的维罗纳气单胞菌序列，运用Mega6.0软件构建

系统发育树.

1.6分离菌对小鼠的致病性试验

将分离的4株维罗纳气单胞菌接种于TSB中，37℃、150r/min空气浴振摇培养

12h，将4株菌培养物分别腹腔注射5只小鼠，注射剂量为0.2mL/只，空白对

照腹腔注射TSB，观察各分离菌对小鼠的致病性.

1.7药敏试验

按照世界卫生组织(WHO)推荐的K-B纸片法对4株维罗纳气单胞菌进行药敏试验.

用接种环挑取纯化的单菌落接种于TSB培养基中，37℃、150r/min空气浴振摇

培养12h，将培养后的菌液稀释至终浓度为1.5×108CFU/mL，取1mL菌液均匀

涂布于TSA平板上，待菌液吸收后贴上药敏纸片，37℃恒温培养12h.按照

NCCLS2009年标准，以耐药、中敏、敏感判定药敏试验结果.

2结果

2.1细菌分离情况

从5只病兔肺脏中分离到4株细菌，在TSA平板和血琼脂平板上生长旺盛，均呈

边缘整齐、光滑、中间隆起的灰白色菌落；在血琼脂平板上产生β溶血(见图1)；

革兰染色均为G-短杆菌，两端钝圆，且多呈单个排列(见图2).而外表健康家兔的

肺脏中未分离到细菌.

图1分离菌株菌落特征Fig.1Thecolonycharacteristicsofisolates

图2分离菌株革兰氏染色镜检Fig.2Gramstainsofisolates

2.2分离菌16SrDNAPCR扩增结果及同源性比对结果

分离菌16SrDNAPCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见1500bp左右

的特异性条带(见图3)，与预期目的片段大小相符.PCR产物测序结果与Gen-Bank

数据库比对，与维罗纳气单胞菌同源性为99.1%～100%.

图3分离菌株16SrDNA基因PCR扩增电泳图M:DL2000标准分子质量；1～

4:4个分离菌株Fig.316SrDNAPCRamplificationresultsof

isolatesM:DL2000DNAMaker；1～4:PCRamplificationproductsoffour

bacterialisolates

2.3分离菌系统进化分析

系统进化分析显示(见图4)，维罗纳气单胞菌聚为2个大支，4株分离株(编号为

1-1、2-1、3-1、5-1)与GenBank中登录的KC633849.1等15株中国分离株聚

为一支.

图4维罗纳气单胞菌16srDNA基因片段的邻近法进化树Fig.4Neighbor-

joiningconnsustreeforpartial16SrDNAgenefragmentofAeromonas

veronii

2.4分离菌对昆明小鼠的致病性

4株家兔源维罗纳气单胞菌分别腹腔注射小鼠后，均在注射菌后7～8h左右发病，

小鼠出现精神不振，扎堆等现象.注射菌后12～24h病情加重，小鼠表现出弓背、

运动迟缓、食欲不振、精神沉郁、呼吸轻微急促等症状.注射菌后24～48h4株维

罗纳气单胞菌对小鼠的致死率分别为1/5、2/5、2/5、3/5，剖解见肺脏出血.48h

后没有死亡的小鼠精神、食欲等均好转，出现耐过现象，对照组小鼠没有发病和死

亡，说明4株分离菌对试验昆明小鼠均有一定的致病性.

2.5药敏试验结果

对4株维罗纳气单胞菌运用临床常用的21种抗菌类药物进行药物敏感性试验，结

果见表1，4株分离菌均对头孢噻肟、头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑啉、左氧氟沙

星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、四环素、多西环素、氟苯尼考、哌拉西林敏

感，部分分离株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素、妥布霉素、阿米卡星、新霉素、

多粘菌素B耐药.

表14株维罗纳气单胞菌的药物敏感性结果Table1Drugnsitivityresultsof

fourAeromonasveroniiisolates抗生素Antibiotics敏感Sensitivity中敏

Middlensitivity耐药Resistance头孢噻肟Cefuroximeoxime4/400头孢他

啶Ceftazidime4/400头孢呋辛Cefuroxim4/400头孢唑啉Cephazolin2/4

2/40氨苄西林ampicillin01/43/4阿莫西林Amoxicillin02/42/4左氧氟沙星

Levofloxacin4/400环丙沙星Ciprofloxacin4/400诺氟沙星Norfloxacin4/4

00氧氟沙星Gatifloxacin4/400四环素tetracycline4/400金霉素

chlortetracycline3/41/40多西环素doxycycline4/400链霉素

streptomycin004/4妥布霉素Tobramycin01/43/4阿米卡星Amikacin0

2/42/4庆大霉素Gentamicin1/42/41/4新霉素neomycin1/41/42/4多粘

菌素BpolymyxinB004/4氟苯尼考Florfenicol4/400哌拉西林Piperacillin

4/400

3讨论

本试验首次从家兔肺脏分离得到维罗纳气单胞菌，并证明其对昆明小鼠有致病性.

维罗纳气单胞菌作为一种较为新型的人-兽-鱼共患病呼吸道病原菌，具有一定的公

共卫生学意义，应加强其防范.目前我国的家兔养殖方式正向着集约化和规模化转

变，饲养方式的变化，导致一些条件性致病菌的感染发病增加.家兔呼吸道疾病临

床症状多表现为流黏液性或脓性鼻涕，打喷嚏，呼吸困难等.其病因复杂，常见的

感染因素有致病性大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和支气管败血波

氏杆菌等[20].本试验从患病家兔肺脏分离到4株维罗纳气单胞菌，虽然维罗纳气

单胞菌不是家兔呼吸道常见病原菌，但研究发现其对试验动物昆明小鼠具有一定的

致病力.结合临床症状和细菌分离结果，引起该家兔养殖场本次发生呼吸道疾病的

病原菌为维罗纳气单胞菌.

抗生素是治疗细菌性疾病的主要措施，从目前国内外对维罗纳气单胞菌研究报道可

知，不同地区、不同动物来源的维罗纳气单胞菌的耐药性不尽相同[7-15].本研究

分离的4株维罗纳气单胞菌均对头孢噻肟、头孢他啶、头孢呋辛、头孢唑啉、左

氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、加替沙星、四环素、多西环素、氟苯尼考、哌拉

西林等12种药物敏感，部分分离株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素、妥布霉素、

阿米卡星、新霉素、多粘菌素B等7种药物耐药.该兔场通过选用敏感药物进行治

疗，其呼吸道疾病得到了控制.

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