抗GPRC5D抗体、其制备方法与用途与流程
抗gprc5d抗体、其制备方法与用途
1.本发明要求在2021年5月23日提交中国专利局、申请号为202110561818.0、申请名称为“抗gprc5d抗体、其制备方法与用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗gprc5d抗体、其制备方法与用途。
背景技术：
3.多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是全球仅次于非霍奇金氏淋巴瘤的第二常见血液肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％。根据who发布的全球癌症统计报告，2018年中国新发多发性骨髓瘤患者20,066例，死亡患者14,665例；5年累计发病人数44,643例。且患者的发病率和死亡率随着年龄增长而逐步上升。因此，随着我国人口老龄化程度不断加剧，患病总人数也将逐渐增多，临床需求巨大。近十年来，以沙利度胺及其衍生物来那度胺为代表的免疫调节剂和以硼替佐米为代表的小分子蛋白酶体抑制剂的应用，极大地提高了mm患者的缓解率和生存期。目前我国针对多发性骨髓瘤的方案可分为三类：免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗cd38单抗的靶向。免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂主要用于符合干细胞移植条件的患者在移植前接受的一线联合及移植后的维持。一线复发或难治性多发性骨髓瘤的二线方案则考虑使用2019年国家药监局(nmpa)有条件批准的通过进口注册上市的抗cd38单抗daratumumab。然而经过短周期的之后，再次复发病人便陷入无药可用的尴尬处境。因此，mm的复发性和难治性依旧困扰着人们，促使人们不断寻求新的靶点和方法应用于mm复发/难治性的情况中。
4.小分子抑制剂复发及生物药相关技术的快速发展，加速了针对mm靶向性疗法的研发。目前被fda批准的生物大分子靶向疗法包括靶向浆细胞表面蛋白cd38、信号淋巴细胞激活分子家族成员7(signaling lymphocytes activating molecule factor 7，slamf7)和b细胞成熟抗原(b cell maturation antigen，bcma)等三大靶点，获批的药物的类型主要包括：单抗和抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)。相较于cd38、slamf7靶点，bcma蛋白在mm细胞上的表达更特异性。2020年8月美国fda加速批准了靶向bmca的adc药物blenrep用于中位7线复发的患者，总体缓解率仍能达到31％，中位缓解持续时间(dor)大于6个月。此外，靶向bcma的car-t或cd3双特异性抗体通过介导t细胞起到的抗肿瘤疗效亦然显著。bcma药物研发赛道有包括蓝鸟、bms、安进、强生、再生原以及南京传奇等众多国际著名生物医药公司参与，竞争十分激烈。近年来在我国政府的大力引导下，中国生物医药行业也在迅速崛起，涌现出了多家布局mm的靶向性新药研发公司，但多是集中在cd38、bcma靶点的双抗和car-t方向，面临极大的国内外同质化竞争压力。此外，虽然靶向bcma的adc、双抗及car-t疗法已显示出了积极的临床效果，但有关bcma阴性(或低表达)及相关的后复发病例已见报道，突显多发性骨髓瘤亟需更多靶点。
5.g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptor，gpcr)是具有7个跨膜螺旋的蛋白
质受体，根据其序列的相似性以及与配基的结合情况，共分为5个亚家族，是人体内最大的蛋白质家族，也是重要的药物靶标。g蛋白偶联受体c5家族亚型d(gprc5d)是最早于2001年鉴定出的孤儿非典c类gpcr(brauner-osborne,h.,et al.cloning and characterization of a human orphan family c g-protein coupled receptor gprc5d.biochim biophys acta,2001.1518(3):p.237-48)。gpcr家族c组5受体(gprc5受体)共有4种亚型，即gprc5a、gprc5b、gprc5c和gprc5d，它们由视黄酸诱导表达，所以也称为视黄酸诱导的孤儿g蛋白偶联受体(inoue,s.,t.nambu,and t.shimomura,the raig family member,gprc5d,is associated with hard-keratinized structures.journal of investigative dermatology,2004.122(3):p.565-573)。
6.gprc5d先前已在多发性骨髓瘤患者的细胞中被鉴定发现，然而因为缺少蛋白表达谱研究，一直未被应用于临床开发。直至2019年的研究报道显示，gprc5d在多发性骨髓瘤的浆细胞中高表达，在正常组织中多不表达，仅在具有免疫赦免性的毛囊区域有表达(smith,e.l.,et al.,gprc5d is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed car t cells.science translational medicine,2019.11(485))。有研究报道，gprc5d的高表达与多发性骨髓瘤的不良预后相关(atamaniuk,j.,et al.,overexpression of g protein-coupled receptor 5d in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma.european journal of clinical investigation,2012.42(9):p.953-960)。此外，另一重要的发现是gprc5d的表达谱与bcma并不重叠，因此将可能成为bcma低/不表达或继bcma复发后的全新靶点。然而，由于gpcr蛋白属于7跨膜蛋白，结构复杂且抗原难以获取，特异性抗体较难获取，目前仅少数靶向gprc5d药物还处于临床试验阶段或者研发阶段。有鉴于此，本发明通过组合免疫方法与抗体库技术开发了具有更高活性、更高亲和力、更高特异性和更好效果的gprc5d药物，以进行相关疾病的诊断、研究和应用。
技术实现要素：
7.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗体，能够高特异性结合g蛋白偶联受体c5家族亚型d(gprc5d)。
8.本发明还提出与上述抗体相关的重组蛋白、药物组合物、多核苷酸、重组质粒和分离细胞。
9.本发明还提出上述抗体的制备方法。
10.本发明还提出上述抗体在制备抗癌药物中的应用。
11.本发明还提出上述抗体在制备抗体检测试剂盒中的应用。
12.根据本发明的第一方面实施方式的抗体，所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区：
13.所述重链可变区，其包含：由seq id no:44所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr1，由inpx1ngx2t(seq id no:99)的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr2，由arx3alryamdy(seq id no:100)氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr3；
14.所述轻链可变区，其包含：由qx4x5x6tx7(seq id no:101)的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr1，由sas的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr2，由qqx8x9x
10
x
11
pvt
(seq id no:102)的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr3；
15.其中，
16.x1:代表y、p、r、l、d、s、g、k、v、t、m和q的任一氨基酸，
17.x2:代表r和a的任一氨基酸，
18.x3:代表v和a的任一氨基酸，
19.x4:代表s和a的任一氨基酸，
20.x5:代表v和a的任一氨基酸，
21.x6:代表s、v、l、r、h、e、g、q、m和y的任一氨基酸，
22.x7:代表r、p、h、s、w、i、g、v和n的任一氨基酸，
23.x8:代表y和a的任一氨基酸，
24.x9:代表n和a的任一氨基酸，
25.x
10
:代表s和a的任一氨基酸，
26.x
11
:代表y和a的任一氨基酸。
27.根据本发明的第一方面实施方式的抗体，所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区：
28.所述重链可变区，其包含：由seq id no:29所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr1，由seq id no:30所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr2，由seq id no:31所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr3；
29.所述轻链可变区，其包含：由seq id no:47所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr1，由yas氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr2，由seq id no:48所示的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr3。
30.根据本发明实施方式的抗体，至少具有如下有益效果：本发明的抗体具有(1)结合活性好，与gprc5d蛋白较强的结合能力；(2)特异性强，与cd19、cd3、cd11b和cd14等抗体均不结和，能够更特异性靶向gprc5d从而减少脱靶带来的毒性，因此安全性更佳；(3)物种交叉反应性，与猴gprc5d具有交叉反应性，利于开展验证实验和便于后续有用途的产品开发；(4)抗体内吞作用，在细胞中具有内吞活性，适合adc药物的开发。
31.根据本发明的一些实施方式，所述为鼠源抗体、嵌合抗体或人源抗体。
32.在本发明中，人gprc5d基因cds区碱基序列如seq id no:3所示，氨基酸序列如seq id no:4所示。
33.在本发明中，所述抗体除重链可变区和轻链可变区的序列外，还包括含有lgg1的重链恒定区氨基酸序列和含有kappa的轻链恒定区氨基酸序列。
34.根据本发明的一些实施方式，所述重链可变区选自如seq id no:79、seq id no:81、seq id no:83、seq id no:85或seq id no:87所示的氨基酸序列；所述轻链可变区选自如seq id no:89、seq id no:91、seq id no:93、seq id no:95或seq id no:97所示的氨基酸序列。
35.根据本发明的一些优选的实施方式，所述重链可变区为seq id no:87所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区为seq id no:89所示的氨基酸序列。
36.根据本发明的一些实施方式，所述抗体包含以下i至iv中任一种性质：
37.i、所述抗体能够特异性结合g蛋白偶联受体c5家族亚型d；
38.ii、所述抗gprc5d抗体不与cd19、cd3、cd11b或cd14中的任一项相结合；
39.iii、所述抗gprc5d抗体特异性地结合人gprc5d并与猴gprc5d交叉反应；
40.iv、所述抗gprc5d抗体具有内吞活性。
41.在本发明中，上述抗体序列具有最佳的结合活性、反应特异性、物种交叉反应性和内吞活性。通过实施例实验可以证明本发明的抗gprc5d抗体对比现有技术抗体的蛋白结合水平明显增大；具有结合特异性，不与cd19、cd3、cd11b、cd14阳性细胞非特异性结合，更特异地靶向gprc5d，从而减少因脱靶而带来的毒性风险；具有物种交叉反应这一特点，有助于抗体在猴子体内进行毒性分析，有利于在相关动物中开展验证试验，进而有利于后续的用途的应用开发；有明显的内吞活性，更适合抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，adc)的药物进行后续开发。
42.在本发明中，与未经修饰的fc区相比，所述fc区的糖基化被修饰以增强fcγr结合。在一些实施方式中，所述fc区缺乏岩藻糖含量或具有降低的岩藻糖含量。
43.根据本发明第二方面的实施方式的重组蛋白、药物组合物、多核苷酸、载体或分离细胞：所述重组蛋白包含上述抗体；所述药物组合物包含上述抗体或上述重组蛋白；所述多核苷酸包含编码上述抗体或重组蛋白的核苷酸序列；所述载体包含上述多核苷酸；所述分离细胞产生上述抗体。
44.根据本发明的一些实施方式，所述重组蛋白还包含协助表达和/或纯化的标签序列。
45.根据本发明的一些实施方式，所述重组蛋白为双抗，即还包括能够与其他靶蛋白结合的抗体。进一步地，所述双抗还包括特异性结合cd3的抗体、特异性结合gprc5d不同表位的抗体。
46.根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物还包括上述双抗。
47.根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物还包括含有上述抗体的adc药物。进一步地，所述adc药物还包括连接臂和毒性分子。
48.根据本发明地一些实施方式，所述药物组合物还包括药学上可用的辅料。
49.根据本发明第三方面的实施方式的制备方法，包括以下步骤：培养上述分离细胞，从培养物中回收所述抗体。
50.在本发明中，具体的制备方法为：将编码上述抗gprc5d抗体的重链可变区序列克隆到含有igg1重链恒定区氨基酸序列的重组质粒1中，轻链可变区序列克隆到含有kappa轻链恒定区氨基酸序列的重组质粒2中，将重组质粒1和重组质粒2同时转染细胞并进行培养，从培养物中回收所述抗gprc5d抗体。
51.根据本发明第四方面的实施方式的应用，所述抗体可应用于抗癌药物和/或抗体检测试剂盒的制备中。
52.在本发明中，所述抗癌药物主要用于预防或癌症，其中所述癌症是表达gprc5d蛋白的乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、血液癌、淋巴瘤或恶性黑素瘤。进一步地，其中所述癌症是表达gprc5d蛋白的多发性骨髓瘤。
53.在本发明中，抗癌药物还包含与靶向其它靶点的抗体，如：cd3、bcma、cd38等构建成双特异性抗体，开发成各种具有调节肿瘤细胞作用的方法。
54.在本发明中，本发明的抗体还可以通过偶联其它类型的分子，如：毒素、核酸分子等，通过该抗体特异地将偶联的分子带到肿瘤细胞体内，从而调节肿瘤细胞的作用。例如，该抗体可用于癌症，通过干扰gprc5d-受体相互作用或其中抗体缀合至毒素，从而将毒素靶向gprc5d表达型癌症。
55.在本发明中，可对所述的gprc5d特异性抗体或抗原结合片段进行标记以用于所述方法或本领域技术人员已知的其它方法。例如，本发明所述的抗体或其抗原结合片段可用放射标记物、荧光标记物、表位标签、生物素、发团标记物、ecl标记物、酶、钌、111in-dota、111in-二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，或者聚组氨酸或本领域已知的类似此类标记物进行标记。
56.在本发明中，该抗体还可以开发成通过免疫手段，对组织细胞表面gprc5d表达量进行检测的方法。例如，该抗体还可用于检测生物样品诸如血液或血清中gprc5d的存在、用于定量分析生物样品诸如血液或血清中gprc5d的量、用于诊断gprc5d表达型癌症、用于确定患有癌症的受者的方法、或用于监测受者中gprc5d表达型癌症的进展等。
57.在本发明中，术语“抗体”具体包括狭义抗体，还包括“嵌合”抗体以及该抗体片段，其中部分重链和/轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚类抗体的对应序列相同或同源，而该链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚类抗体的对应序列相同或同源，只要其特异性结合靶抗原和/或显示所需的生物活性(美国专利号4,816,567，和morrison等,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855(1984))。其中，“狭义抗体”是指由抗原进入机体刺激b细胞分化增殖为浆细胞而合并分泌的一类能与相应抗原发生特异性结合并产生免疫效应的含有糖基的球蛋白。1964年世界卫生组织召开会议，将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。现代免疫学认为，抗体与免疫球蛋白是等同概念，只是抗体侧重于其生物学活性的描述，而免疫球蛋白侧重强调其化学结构。
58.免疫球蛋白的基本结构包含四条肽链：两条重链(heavy chain,h链)和两条轻链(light chain，l链)，轻链与重链由二硫键连接形成一个对称四肽链分子，成为免疫球蛋白分子单体，单体是构成所有免疫球蛋白的基本结构。每条重链和轻链分为氨基端(n端)和羧基端(c端)。通过对h链或l链的氨基酸序列比较分析发现：其n端序列变化很大，称此区为可变区(variable region，v区)；c端氨基酸相对稳定，变化很小，称此区为恒定区(constant region，c区)。可变区可分为高可变区(hypervariable region，hvr)和骨架区(framework region，fr)。重链可变区和轻链可变区的分别有3个hvr，从n端往c端，分别称为重链或轻链的hvr1、hvr2和hvr3。高可变区为抗体与抗原的结合位置，称为互补决定区(complementarity-determining region，cdr)，因此，重链或轻链的hvr1、hvr2和hvr3又称cdr1、cdr2和cdr3。
59.在本发明中，术语“双抗”，即“双特异性”抗体，指某一抗体，一般是单克隆抗体，具有至少两个不同抗原性表位的结合特性。在一个实施方式中，该表位来自相同抗原。在另一个实施方式中，该表位来自两个不同抗原。制备双特异性抗体的方法为本领域已知。例如，双特异性抗体可通过共同表达两种免疫球蛋白重/轻链对来重组生产。参见例如，milstein等，nature305:537-39(1983)。或者，可利用化学连接制备双特异性抗体。参见例如，brennan等，science229:81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段(例如，hollinger等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-48(1993),gruber等，j.immunol.152:5368
(1994))。
60.本发明中，术语“人源化抗体”指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体序列的抗体形式。该抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗体。通常，所述人源化抗体包含几乎所有的至少一个且通常两个可变区，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，全部或基本上全部的fr区是人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，一般是人免疫球蛋白的fc。参见例如，cabilly美国专利号4,816,567；queen等(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:10029-10033；和antibody engineering:a practical approach(《抗体工程：实践方法》)(牛津大学出版社(oxforduniversitypress)1996)。
61.本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
62.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
63.图1显示了淘选的单克隆scfv与hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞的结合；
64.图2显示了淘选的单克隆scfv与nci-h929细胞的结合；
65.图3显示了不同嵌合抗体与nci-h929细胞的结合力；
66.图4显示了人源化hts0370抗体与hek293-gprc5d-zsgreen1细胞的结合力；
67.图5显示了人源化hts0370抗体与nci-h929细胞的结合力；
68.图6显示了人源化hts0375抗体与hek293-gprc5d-zsgreen1细胞的结合力；
69.图7显示了人源化hts0375抗体与nci-h929细胞的结合力；
70.图8显示了人源化hts0370，hts0375抗体与cd19阳性的pbmc细胞的交叉反应性；
71.图9显示了人源化hts0370，hts0375抗体与cd3阳性的pbmc细胞的交叉反应性；
72.图10显示了人源化hts0370，hts0375抗体与cd11b阳性的pbmc细胞的交叉反应性；
73.图11显示了人源化hts0370，hts0375抗体与cd14阳性的pbmc细胞的交叉反应性；
74.图12显示了人源化hts0370，hts0375抗体与gprc5d蛋白结合的活性；
75.图13显示了人源化hts0370，hts0375抗体的内吞活性；
76.图14显示了人源化hts0370,hts0375抗体的物种交叉反应性；
77.图15显示了抗体的cdr区突变位点为x1的突变体的facs验证结果；
78.图16显示了抗体的cdr区突变位点为x2的突变体的facs验证结果；
79.图17显示了抗体的cdr区突变位点为x3的突变体的facs验证结果；
80.图18显示了抗体的cdr区突变位点为x4的突变体的facs验证结果；
81.图19显示了抗体的cdr区突变位点为x5的突变体的facs验证结果；
82.图20显示了抗体的cdr区突变位点为x6的突变体的facs验证结果；
83.图21显示了抗体的cdr区突变位点为x7的突变体的facs验证结果；
84.图22显示了抗体的cdr区突变位点为x8的突变体的facs验证结果；
85.图23显示了抗体的cdr区突变位点为x9的突变体的facs验证结果；
86.图24显示了抗体的cdr区突变位点为x
10
的突变体的facs验证结果；
87.图25显示了抗体的cdr区突变位点为x
11
的突变体的facs验证结果；
88.图26显示了构建的gprc5a、gprc5b、gprc5c三种过表达细胞系的过表达效果；
89.图27显示了抗体与gprc5a、gprc5b、gprc5c三种过表达细胞系的结合反应性；
90.图28显示了gprc5d-a1～a4四种嵌合分子的结构示意；
91.图29显示了gprc5d-a1～a4四种嵌合分子过表达细胞系的过表达效果；
92.图30显示了抗体与gprc5d-a1～a4四种嵌合分子过表达细胞系的结合反应性。
具体实施方式
93.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
94.在本发明的下述实施例中，所使用的载体信息如下：
95.ptt5-higg1.ch载体能够合成人的igg1的恒定区序列(seq id no:97)，通过ecori/hindiii酶切位点构建至ptt5载体(购买自淼灵生物)而获得；
96.ptt5-hkappa.cl载体能够合成人的kappa链的恒定区序列(seq id no:98)，通过ecori/bamhi酶切位点构建至ptt5载体(购买自淼灵生物)而获得。
97.实施例1.人gprc5d表达载体及稳转细胞株的制备
98.1-1.人gprc5d表达载体plvx-hugprc5d-ires-zsgreen1和ptt5-hugprc5d的制备
99.从ncbi数据库中获取编码人gprc5d基因cds区碱基序列(nm_018654.1)，设计pcr引物1(seq id no:1)和2(seq id no:2)，并选择gprc5d高表达的mm.1s(购自南京模式动物研究所)，nci-h929(atcc)两种多发性骨髓瘤(mm)细胞系的cdna作为模板，进行pcr扩增，pcr产物用bamhi/ecori消化后连接至plvx-ires-zsgreen1(购自clonetech)和ptt5载体(购自淼灵生物)中，转染dh5a，挑取单克隆进行测序。经测序验证序列正确，即成功构建表达目的质粒的菌株plvx-hugprc5d-ires-zsgreen1和ptt5-hugprc5d。在液体lb培养基中培养含有目的质粒的菌种，并使用天根生化科技(北京)有限公司无内毒素质粒大提试剂盒(dp117)，按照说明书常规步骤提取质粒dna。
100.人gprc5d基因cds区碱基序列如seq id no:3所示，氨基酸序列如seq id no:4所示。
101.1-2.过表达人gprc5d抗原的hek293稳转细胞株制备
102.选取生长状态良好的对数增长期的hek293细胞(购自atcc)，在培养皿(10cm)中接种8e6细胞，dmem中添加10％胎牛血清，37℃、5％co2培养箱内培养，细胞融合率(显微镜下观察到的细胞密度)达到70％～80％左右时转染。使用转染试剂pei共转染三质粒pspax2(购自clonetech)、pmd2.g(购自clonetech)和plvx-hugprc5d-ires-zsgreen1。收集转染后48小时-72小时的病毒液，0.45μm针头滤器过滤病毒去除残留的细胞，按照moi为10感染目的细胞hek293(购自atcc)，dmem加10％胎牛血清培养。病毒感染24小时后换液，获得稳定高表达hgprc5d的稳转细胞池。构建的细胞通过流式使用et150的阳性抗体检测人gprc5d表达阳性率，阳性率在98％以上，与gfp的阳性率完全一致，同时检测到zsgreen与抗原的共高表达，hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞株构建成功。
103.实施例2.单克隆抗体的制备和抗体的筛选
104.2-1.免疫接种和血清效价检测
105.选择8只6周龄spf级balb/c雌性健康小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)，随机分为a、b两组，分别在第0、7、14、21、28、35、42、49天进行免疫。a组使用hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞株进行免疫，每只小鼠腹腔注射2
×
107细胞；b组使用gprc5d表达质粒ptt5-hgprc5d进行免疫，每只小鼠通过基因于背部皮下接种20μg质粒。在第34天、41天、48天及55天对小鼠进行眼眶采血，通过流式细胞仪(facs)常规方法检测小鼠免疫血清效价。简言之，96孔v型微孔板中每孔加入5
×
105个hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞或内源表达细胞nci-h929(atcc)，1500r/min离心1min，弃上清。将免疫血清用pbs按1:50稀释后，4倍梯度稀释8个浓度，50μl/孔加入至微孔板中，冰上孵育30min后，每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，重复洗板2次。加入apc标记的羊抗鼠igg(jackson，货号115-605-164，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。最后用pbs洗板2次后每孔加入150μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。挑选效价最高且连续两次免疫血清效价趋于平稳的小鼠a1与b1，在构建抗体库前3天用2
×
107个hek293-gprc5d-zsgreen1细胞腹腔注射进行一次冲击免疫。
106.2-2.噬菌体抗体库的构建
107.取冲击免疫的balb/c小鼠a1与b1，取脾脏细胞，参照文献(krebber,a.,bornhauser,s.,burmester,j.,honegger,a.,willuda,j.,bosshard,h.r.,and pl
ü
ckthun,a.(1997).reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.journal of immunological methods 201,35-55.)的方法构建小鼠免疫噬菌体库，简言之利用trizol裂解液裂解后，提取细胞的总rna，反转cdna，利用特异性的抗体重链引物和轻链引物，扩增抗体的可变区基因，克隆到噬菌体展示载体上，转入宿主大肠杆菌细胞tg1。通过ngs测序，利用库容、克隆阳性率、重轻链配对、cdr3的分布、噬菌体展示率等质控指标评价抗体库的多样性和有效性。抗体库库容在1x108以上，克隆插入阳性率在90％以上，scfv展示率在60％以上，ngs测序显示抗体库多样性丰富，可用于后续筛选。
108.2-3.噬菌体库的筛选及鉴定
109.首先使用hek293细胞预处理噬菌体，每个抗体库的噬菌体投入量为1
×
10
10
，然后使用hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞对预处理过的噬菌体上清进行富集淘选，先用pbs洗去未结合的噬菌体，再用0.1m的hcl-glycine洗脱结合在细胞上的噬菌体，之后用tris-hcl中和洗脱液，取噬菌体侵染对数生长期的大肠杆菌tg1，制备噬菌体用于下一轮淘选。逐渐增加每轮的筛选洗涤次数，富集度达到上一轮10倍以上时，终止淘选。
110.挑选终止淘选后的噬菌体侵染的tgl单克隆，接种于96孔板中，培养基为2yt/2％glucose/(100μg/ml ampicilline)。37℃，220rpm培养6小时后4000rpm离心10min，使用2yt/(100μg/ml ampicilline)/(1μm iptg)培养基30℃，220rpm过夜培养诱导scfv。4000rpm离心10min取诱导上清，通过流式细胞仪常规方法检测scfv与hek293-gprc5d-zsgreen1细胞的结合活性。简言之，96孔v型微孔板中每孔加入2.5
×
105个hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞，同时混入50％的hek293细胞，1500r/min离心1min，弃上清。将15μl scfv上清中补加35μl pbs，50μl/孔加入至微孔板中，冰上孵育30min，每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，重复洗板2次。加入apc标记的小鼠抗6
×
his抗体(金斯瑞，货号a01802，1：800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板2次后每孔加入100μl pbs重悬
细胞，用cytoflex进行检测(beckman)，与hek293-gprc5d-zsgreen1细胞mfi值高于hek293对照组2倍以上的选为阳性克隆进行内源细胞h929的结合验证，挑选双结合阳性克隆进行测序。阳性scfv对照bmk-et150-8根据专利us20180118803中的et150-8 scfv序列构建。细胞结合的结果如图1和图2所示。通过结合活性的分析，优选了6个单链抗体(single-chain variable fragment，scfv)，分别命名为hts0370、hts0371、hts0372、hts0373、hts0374、hts0375，并对此6个scfv单链抗体进行后续的研究。经序列测定后，该6个抗体vh，vl序列及其cdr序列如下表1-4所示。
111.表1
112.scfv单链抗体氨基酸序列表vhvlhts0370seq id no:5seq id no:6hts0371seq id no:7seq id no:8hts0372seq id no:9seq id no:10hts0373seq id no:11seq id no:12hts0374seq id no:13seq id no:14hts0375seq id no:15seq id no:16
113.表2
114.scfv单链抗体核苷酸序列表vhvlhts0370seq id no:17seq id no:18hts0371seq id no:19seq id no:20hts0372seq id no:21seq id no:22hts0373seq id no:23seq id no:24hts0374seq id no:25seq id no:26hts0375seq id no:27seq id no:28
115.表3
116.抗体重链cdr序列表hcdr1hcdr2hcdr3hts0370seq id no:29seq id no:30seq id no:31hts0371seq id no:32seq id no:33seq id no:34hts0372seq id no:35seq id no:36seq id no:37hts0373seq id no:38seq id no:39seq id no:40hts0374seq id no:41seq id no:42seq id no:43hts0375seq id no:44seq id no:45seq id no:46
117.表4
118.[0119][0120]
实施例3.嵌合抗体的制备及结合活性检测
[0121]
3-1.嵌合抗体重链表达载体ptt5-higg1的构建
[0122]
将hts0370、hts0371、hts0372、hts0373、hts0374和hts0375的重链可变区序列在生工生物工程(上海)股份有限公司常规合成，并通过同源重组的方式克隆到含有igg1重链恒定区氨基酸序列的ptt5-higg1.ch载体中，获得嵌合抗体重链表达载体ptt5-hts0370.vh-higg1、ptt5-hts0371.vh-higg1、ptt5-hts0372.vh-higg1、ptt5-hts0373.vh-higg1、ptt5-hts0374.vh-higg1和ptt5-hts0375.vh-higg1。
[0123]
3-2.嵌合抗体轻链表达载体ptt5-vl的构建
[0124]
将hts0370、hts0371、hts0372、hts0373、hts0374和hts0375的轻链可变区序列在生工生物工程(上海)股份有限公司常规合成，并通过同源重组的方式分别克隆到含有抗体κ轻链恒定区氨基酸序列cl的ptt5-hkappa.cl载体中，获得嵌合抗体轻链表达载体ptt5-hts0370.vl-hkappa、ptt5-hts0371.vl-hkappa、ptt5-hts0372.vl-hkappa、ptt5-hts0373.vl-hkappa、ptt5-hts0374.vl-hkappa和ptt5-hts0375.vl-hkappa。
[0125]
3-3.嵌合抗体的表达纯化
[0126]
收集生长状态良好的对数增长期的293f细胞(购自thermofisher)接种至250ml细胞培养瓶中并在50ml培养基中培养，pei共转染轻重链表达质粒各25μg。收集转染后培养第7天的细胞上清，离心并使用0.45μm滤器过滤，protein a介质纯化抗体并通过透析方法将抗体置换至pbs ph7.2缓冲液中。通过nanodrop测定吸光度来确定抗体浓度和纯度，并通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳和考马斯染来检查纯度。将通过ptt5-hts0370.vh-higg1和ptt5-hts0370.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0370”，将通过ptt5-hts0371.vh-higg1和ptt5-hts0371.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0371”，将通过ptt5-hts0372.vh-higg1和ptt5-hts0372.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0372”，将通过ptt5-hts0373.vh-higg1和ptt5-hts0373.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0373”，将通过ptt5-hts0374.vh-higg1和ptt5-hts0374.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0374”，将通过ptt5-hts0375.vh-higg1和ptt5-hts0375.vl-hkappa的组合得到的抗体命名为“xw.hts0375”。
[0127]
3-4.嵌合抗体结合活性检测
[0128]
通过facs的方法，检验实施例3-3中获得的嵌合抗体与过表达人gprc5d的hek293-gprc5d-zsgreen1稳转细胞及内源表达细胞nci-h929(atcc)的结合活性，阳性参照抗体的抗体序列来自专利us20180118803中et150-8，构建嵌合表达载体并制备嵌合抗体xw.et150-8。检测方法简述如下，每孔加入5
×
105个hek293-gprc5d-zsgreen1细胞或者nci-h929于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。梯度稀释嵌合抗体，每孔50μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。加入apc标记的羊抗人igg(jackson，货号109-605-098，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。经graphpad 8.0.2分析，xw.hts0370、xw.hts0371、xw.hts0372、xw.hts0373、xw.hts0374和xw.hts0375与内源表达细胞系nci-h929结合活性明显高于阳性对照抗体xw.et150-8，结果
如图3所示。6个所得嵌合抗体及对照抗体的半最大效应浓度ec50如表5所示。
[0129]
表5
[0130]
抗体ec50xw.hts03706.782xw.hts0371148.5xw.hts03724.817xw.hts03739.167xw.hts03744.625xw.hts03754.307xw.et150-814.55
[0131]
ec50值越低反应出的抗体结合活性越好，根据上表可知，除xw.hts0371外，其余5个嵌合抗体的结合活性均优于对照。
[0132]
经过轻、重链germline分析和序列的比对，发现hts0372～375抗体序列相近，可能是由同一b细胞克隆分化而来，不仅该组克隆与hts0370、hts0371之间，而且hts0370与hts0371之间的序列germline完全不同，cdr区域的差异较大。结合抗体结合细胞ec50的数据，筛选出结合最好的xw.hts0370和xw.hts0375两株克隆的序列进行后续的人源化改造。
[0133]
实施例4.鼠源grpc5d抗体的人源化
[0134]
4-1.人源化设计方案
[0135]
根据通常称作的cdr移植方法对鼠抗人hts0370和hts0375抗体进行人源化改造。简言之，使用imgt/v-quest工具(http://www.imgt.org/imgt_vquest/input)分析hts0370,hts0375抗体vh和vk碱基序列，确定抗体轻链和重链的cdr区序列。使用igblast tool工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析hts0370和hts0375抗体的氨基酸序列，获得hts0370和hts0375抗体最接近的人种系vh和vk序列。将hts0370和hts0375抗体的cdr分别移植到选定的vh和vk人种系序列的框架区中，该序列即为人源化的抗体序列。对hts0370和hts0375抗体vh的人种系vh进行分析，选择5个不同的序列，将hts0370和hts0375抗体vh的cdr分别移植到这5个序列的框架区中，各得到5条重链序列可变区。以相同的方法对hts0370和hts0375的轻链分别进行cdr移植，各得到5条轻链可变区序列。
[0136]
轻重链人源化的序列见序列表6-7：
[0137]
表6
[0138]
hts0370人源化序列氨基酸序列核苷酸序列370-h1seq id no:59seq id no:60370-h2seq id no:61seq id no:62370-h3seq id no:63seq id no:64370-h4seq id no:65seq id no:66370-h5seq id no:67seq id no:68370-l1seq id no:69seq id no:70370-l2seq id no:71seq id no:72370-l3seq id no:73seq id no:74370-l4seq id no:75seq id no:76
370-l5seq id no:77seq id no:78
[0139]
表7
[0140]
hts0375人源化序列氨基酸序列核苷酸序列375-h1seq id no:79seq id no:80375-h2seq id no:81seq id no:82375-h3seq id no:83seq id no:84375-h4seq id no:85seq id no:86375-h2bseq id no:87seq id no:88375-l1seq id no:89seq id no:90375-l2seq id no:91seq id no:92375-l3seq id no:93seq id no:94375-l4seq id no:95seq id no:96
[0141]
4-2.人源化抗体的制备
[0142]
将hts0370,hts0375重链人源化序列在生工生物工程(上海)股份有限公司常规合成，并通过同源重组的方式分别克隆到含有igg1重链恒定区氨基酸序列的ptt5-higg1.ch载体中，获得嵌合抗体重链表达质粒；将hts0370、hts0375轻链人源化序列在生工生物工程(上海)股份有限公司常规合成，并通过同源重组的方式分别克隆进入ptt5-hkappa.cl载体中。将生长状态良好的对数增长期的293f细胞接种至250ml细胞培养瓶中并在50ml培养基中培养，pei共转染轻重链表达质粒各25μg。收集转染后培养第7天的细胞上清，离心并使用0.45μm滤器过滤，protein a介质纯化抗体并通过透析方法将抗体置换至pbs ph7.2缓冲液中。通过nanodrop测定吸光度来确定抗体浓度和纯度，并通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳和考马斯染来检查纯度。各种重轻链组合对应的抗体名称见列表8-9：
[0143]
表8
[0144]
抗体名称vh编号vl编号zw.hts0370z01370-h1370-l1zw.hts0370z02370-h1370-l2zw.hts0370z03370-h1370-l3zw.hts0370z04370-h1370-l4zw.hts0370z05370-h1370-l5zw.hts0370z06370-h2370-l1zw.hts0370z07370-h2370-l2zw.hts0370z08370-h2370-l3zw.hts0370z09370-h2370-l4zw.hts0370z10370-h2370-l5zw.hts0370z11370-h3370-l1zw.hts0370z12370-h3370-l2zw.hts0370z13370-h3370-l3zw.hts0370z14370-h3370-l4zw.hts0370z15370-h3370-l5
zw.hts0370z16370-h4370-l1zw.hts0370z17370-h4370-l2zw.hts0370z18370-h4370-l3zw.hts0370z19370-h4370-l4zw.hts0370z20370-h4370-l5zw.hts0370z21370-h5370-l1zw.hts0370z22370-h5370-l2zw.hts0370z23370-h5370-l3zw.hts0370z24370-h5370-l4zw.hts0370z25370-h5370-l5
[0145]
表9
[0146][0147][0148]
4-3.人源化抗体结合活性检测
[0149]
通过facs的方法，检验实施例4-2中获得的人源化抗体与gprc5d过表达细胞系和内源表达细胞nci-h929(atcc)的结合活性。检测方法简述如下，每孔加入5
×
105个nci-h929细胞于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。梯度稀释人源化抗体，每孔50μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。加入apc标记的羊抗人igg(jackson，货号109-605-098，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。经graphpad 8.0.2分析，hts0370人源化后的多个序列与gprc5d过表达的293细胞以及内源细
胞nci-h929都表现出较好的结合活性(结果如图4和图5所示)。hts0370人源化后的多个序列及对照与gprc5d过表达的293细胞以及内源细胞nci-h929的ec50值如表10-11所示。
[0150]
表10
[0151] ec50293t_gprc5d_zw.hts0370z023.513293t_gprc5d_zw.hts0370z032.829293t_gprc5d_zw.hts0370z041.594293t_gprc5d_zw.hts0370z163.812293t_gprc5d_zw.hts0370z181.802293t_gprc5d_zw.hts0370z221.094293t_gprc5d_zw.hts0370z233.887293t_gprc5d_xw.hts03702.930293t_gprc5d_zw.bmk.et150-84.102
[0152]
表11
[0153][0154][0155]
根据上述两个表格结果，从与gprc5d过表达的293细胞以及内源细胞nci-h929都表现出较好的结合活性的角度，选出了两种结合活性均较好的由hts0370人源化得到的人源化抗体：zw.hts0370z02，zw.hts0370z03，zw.hts0370z04，zw.hts0370z16，zw.hts0370z18，zw.hts0370z22，zw.hts0370z23。其中，综合两个结果，选定zw.hts0370z22为最佳，并对其进行后续研究。hts0375人源化后的序列及对照与gprc5d过表达的293细胞以及内源细胞nci-h929的ec50值如表12-13所示。
[0156]
表12
[0157] ec50293t_gprc5d zw.hts0375z561.936293t_gprc5d xw.ht03751.936293t_gprc5d_zw.bmk.et150-8λ1.719
[0158]
表13
[0159] ec50h929zw.h0375z560.9438
h929xw.h03750.2424h929zw.bmk.et150-8λ10.59
[0160]
类似地，优选出经过同样方法人源化hts0375后所得到的zw.hts0375z56分子综合结合活性最佳，进入后续研究，结果如图6和图7所示。
[0161]
实施例5：抗体与各种血细胞的组织交叉反应性检测
[0162]
通过流式的方法，使用fitc-cd3，fitc-cd14，fitc-cd19，percpcy5.5-cd11b分别代表t细胞，单核细胞，b细胞，nk细胞，粒细胞的体，使用生物素化的实施例4中4-2部分中获得的人源化抗体，进行双抗体染，使用pe-sa的抗体进行待检测gprc5d抗体的二抗标记。简言之，每孔加入1
×
106个人pbmc细胞(购自上海妙顺生物)于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。加入1μg/孔的待检测gprc5d人源化抗体，每孔50μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。加入pe-sa(bd，货号554061，pbs 1:20稀释)，每孔25μl，同时加入各种pbmc血细胞的抗体，终浓度参考抗体的说明书，体积25μl，全部混匀后，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。经仪器自带软件分析，人源化抗体与这5种类型的血细胞均不结合，但是来自现有技术中的xw.et150-8抗体与cd11b所代表的粒细胞和cd14所代表的单核细胞，均有非特异性结合，提示此抗体可能存在严重的副作用。人源化抗体及对照分别与cd19、cd3、cd11b、cd14阳性细胞非特异性结合的结果如图8至图11所示。根据结果可知，人源化分子zw.hts0370z22与zw.hts0375z56与cd19、cd3、cd11b、cd14阳性的各种细胞均无非特异性结合，相比之下etc150与cd11b、cd14的细胞有非特异性结合作用。由于hts0370，hts0375分子及其衍生出的嵌合抗体及人源化抗体具有相同的cdr，即相同的表面抗原结合位点，因此，该结果显示hts0370，hts0375及相同cdr衍生的其他抗体形式，将更特异地靶向gprc5d，从而减少因脱靶而带来的毒性风险。
[0163]
实施例6：抗体与gprc5d蛋白结合的结合能力
[0164]
通过elisa的方法，检测检验实施例4中4-2部分中获得的人源化抗体与gprc5d的vlp类蛋白(kactusbiosystems)的结合活性。检测方法简述如下，稀释gprc5d的vlp类蛋白的浓度为1μg/ml，铺到384孔酶标板过夜，第二天弃去蛋白，使用80μl 3％的牛奶(溶解于pbs)进行封闭2小时，使用80μl的pbst(1
‰
的tween20)洗涤3次，之后将4-2中获得的人源化抗体进行梯度稀释后，每孔25μl加入到已经封闭结束的酶标板中，室温反应1小时，之后弃去抗体，使用80μl的pbst(1
‰
的tween20)洗涤5次，加入25μl的hrp标记的羊抗人的二抗(sino biological，货号ssa002，1:10000)，室温孵育1小时，之后弃去抗体，使用80μl的pbst(1
‰
的tween20)洗涤7次。加入25μl的tmb显液显10分钟，加入2m的hcl终止反应后，30分钟内完成读数。阳性参照抗体gc5b596的抗体序列来自专利us10562968中的seq90和seq96，经graphpad 8.0.2分析，人源化抗体与gprc5d的vlp类蛋白结合，其结合活性较gc5b596更好，结果如图12所示。对比前面人源化抗体的细胞结合活性结果可知，hts0375人源化抗体zw.hts0375z56与hts0370人源化抗体zw.hts0370z22的蛋白结合水平差异较细胞结合的差异明显增大。
[0165]
实施例7：抗体与人、猴gprc5d细胞系结合的物种交叉反应性
[0166]
将构建好的猴子的gprc5d的细胞，通过facs的方法，检验实施例4中4-2部分中获得的人源化抗体与过表达猴gprc5d的hek293-gprc5d稳转细胞的结合活性，阳性参照抗体
gc5b596的抗体序列来自专利us10562968中的seq90和seq96。检测方法简述如下，每孔加入5
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105个hek293-gprc5d细胞于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。梯度稀释人源化抗体，每孔50μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。加入apc标记的羊抗人igg(jackson，货号109-605-098，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。经graphpad 8.0.2分析，zw.hts0370z22、zw.hts0375z56与猴表达细胞系结合活性明显高于阳性对照抗体，结果如图13所示。人源化抗体具有物种交叉反应这一特点，会有助于抗体在猴子体内进行毒性分析，有利于在相关动物中开展验证试验，进而有利于后续的用途的应用开发。
[0167]
实施例8：抗体的内吞作用
[0168]
使用facs的方法，使用nci-h929的细胞，检验实施例4中4-2部分中获得的人源化抗体的内吞活性，阳性参照抗体gc5b596的抗体序列来自专利us10562968中的seq90和seq96，另一阳性参考抗体根据专利us20180118803中的et150-8 scfv序列构建。检测方法简述如下，分装4份5
×
105个nci-h929细胞于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。加入饱和的1μg/ml的待检测抗体，每孔200μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μlpbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。用200μl的pbs重悬，取出1份放入37℃细胞培养箱中，放置2小时，另分装2份分别相同条件放置1小时，0.5小时，余下的最后一份放置在冰上，待时间结束后，全部放在4℃，一起离心1500r/min后，加入apc标记的羊抗人igg(jackson，货号109-605-098，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)。经graphpad 8.0.2分析，zw.hts0370z22、zw.hts0375z56有明显的内吞活性，其中zw.hts0370z22的内吞活性明显，而阳性对照抗体gc5b596没有内吞活性，结果如图14所示。提示zw.hts0370z22、zw.hts0375z56比阳性对照更适合adc的药物进行后续开发，zw.hts0370z22潜力更佳。
[0169]
实施例9：抗体的cdr区突变
[0170]
分别将375h2b和375-l1一起构建在噬菌类载体上构建单链抗体的野生型模板。基于该模板对单链抗体的cdr区进行突变。通过对hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3区使用kabat数据库分析氨基酸保守性和突变情况后，分别对hcdr2，hcdr3，lcdr1和lcdr3进行限定位点的点突变。cdr区突变所用引物见表14，其中s＝g/c，n＝a/g/c/t。
[0171]
表14.cdr区突变所用引物
[0172]
x1-fggatggggctgatcaaccctnnsaatggcaggacaatctacaax1-rttgtagattgtcctgccattsnnagggttgatcagccccatccx2-fatcaacccttacaatggcnnsacaatctacaaccaaaagx2-rcttttggttgtagattgtsnngccattgtaagggttgatx3-fgtatactactgcgcccgtnnsgccttaagatatgctatgx3-rcatagcatatcttaaggcsnnacgggcgcagtagtatacx4-facatgcaaagcctctcaannsgtatacacgaatttggctx4-ragccaaattcgtgtatacsnnttgagaggctttgcatgtx5-ftgcaaagcctctcaaagcnnstacacgaatttggcttggx5-rccaagccaaattcgtgtasnngctttgagaggctttgca
x6-faaagcctctcaaagcgtannsacgaatttggcttggttcx6-rgaaccaagccaaattcgtsnntacgctttgagaggctttx7-ftctcaaagcgtatacacgnnsttggcttggttccaacagx7-rctgttggaaccaagccaasnncgtgtatacgctttgagax8-facgtactattgccaacagnnsaacagctacccggtaactx8-ragttaccgggtagctgttsnnctgttggcaatagtacgtx9-rtactattgccaacagtatnnsagctacccggtaactttcx9-rgaaagttaccgggtagctsnnatactgttggcaatagtax10-ftattgccaacagtataacnnstacccggtaactttcgggx10-rcccgaaagttaccgggtasnngttatactgttggcaatax11-ftgccaacagtataacagcnnsccggtaactttcgggcaax11-rttgcccgaaagttaccggsnngctgttatactgttggca
[0173]
采用快速高保真酶primestar max dna polymerase(takara公司，cat#r045a)和各cdr区引物分别对4个cdr区进行全质粒pcr扩增，pcr扩增产物胶回收后经dpn i酶切和乙醇沉淀后转入宿主大肠杆菌细胞tg1，即得到突变体。将突变体以实施例2.3的诱导方法和检测方法进行facs验证，突变体的验证结果如图15-25所示。通过选取与野生型结合能力一致的突变体确认最终的氨基酸位点。确认的序列如seq id no:99-102所示。
[0174]
其中，重链互补决定区hcdr2为inpx1ngx2t(seq id no:99)的氨基酸序列，由图15和图16的结果表明，x1可选自y、p、r、l、d、s、g、k、v、t、m和q的任一氨基酸，x2可选自r和a的任一氨基酸。重链互补决定区hcdr3为arx3alryamdy(seq id no:100)氨基酸序列，由图17的结果表明，x3可选自v和a的任一氨基酸。轻链互补决定区lcdr1为qx4x5x6tx7(seq id no:101)的氨基酸序列，由图18-21的结果表明，x4可选自s和a的任一氨基酸，x5可选自v和a的任一氨基酸，x6可选自s、v、l、r、h、e、g、q、m和y的任一氨基酸，x7可选自r、p、h、s、w、i、g、v和n的任一氨基酸。轻链互补决定区lcdr3为qqx8x9x
10
x
11
pvt(seq id no:102)的氨基酸序列，由图22-25的结果表明，x8可选自y和a的任一氨基酸，x9可选自n和a的任一氨基酸，x
10
可选自s和a的任一氨基酸，x
11
可选自y和a的任一氨基酸。
[0175]
实施例10：抗体与旁系同源蛋白的交叉结合反应
[0176]
为了验证所述抗体结合特异性，通过比对gprc5d与旁系同源蛋白的同源关系，发现其与同家族的gprc5a、gprc5b、gprc5c三个蛋白的同源关系最近，约20～40％的相似性。为了检测本发明抗体的结合特异性，本发明构建了三种基因的过表达细胞系，过表达细胞的构建方法如实施例1-2所述。通过标签抗体facs实验验证了细胞的过表达效果。通过抗体结合这几种细胞的facs结果可知，人源化hts0375z56、hts0370z22分子不交叉结合相关蛋白，表明抗体与同家族相近的旁系基因无交叉反应性，结合特异性较好，结果如图26和图27所示。
[0177]
实施例11：抗体结合gprc5d区域的鉴定
[0178]
因gc5b596,et150.8和候选hts0375z56、hts0370z22分子都不与gprc5a分子(gprc5d同源关系最近的分子)结合，因而我们分别构建了嵌合了四种不同gprc5a胞外区的gprc5d过表达细胞株：gprc5d-a1、gprc5d-a2、gprc5d-a3、gprc5d-a4，用来验证抗体的结合区域。所述四种嵌合分子的示意图如图28所示，过表达细胞的构建方法如实施例1-2所述。
构建的细胞系通过标签抗体facs检测了其过表达效果，结果如图29所示，所有分子都有较好的过表达效果。在此基础上，我们分别检测了人源化与对照抗体同这四种细胞的结合能力。简言之：将5
×
105个gprc5d-a1～a4的过表达细胞于96孔v型微孔板中，1500r/min离心1min，弃上清。加入饱和的1μg/ml的待检测抗体，每孔200μl，冰上孵育30min。然后每孔加入150μl pbs，1500r/min离心1min，弃上清，重复洗板4次。加入apc标记的羊抗人igg(jackson，pbs 1:800稀释)，每孔50μl，冰上孵育30min。用pbs洗板4次后每孔加入100μl pbs重悬细胞，用cytoflex进行检测(beckman)，结果如图30所示。结果表明：1)et150.8主要结合在grpc5d的n末端胞外区，而其它三个分子不结合n末端的胞外区；2)gc5b596抗体结合到除n端外的三个胞外区；3)hts0375z56、hts0370z22分子主要是通过靠近c-末端二段胞外区结合，与其它分子的结合区域不相同。
[0179]
gprc5d-a1的核苷酸序列为：
[0180]
atggctacaacagtccctgatggttgccgcaatggcctgaaatccaagtactacagactttgtgataaggctgaagcttggggcatcgtcctagaaacgtccctggccatacttggcatcgtggtcacaattctgctactcttagcatttctcttcctcatgcgaaagatccaagactgcagccagtggaatgtcctccccacccagctcctcttcctcctgagtgtcctggggctcttcggactcgcttttgccttcatcatcgagctcaatcaacaaactgcccccgtacgctactttctctttggggttctctttgctctctgtttctcatgcctcttagctcatgcctccaatctagtgaagctggttcggggttgtgtctccttctcctggacgacaattctgtgcattgctattggttgcagtctgttgcaaatcattattgccactgagtatgtgactctcatcatgaccagaggtatgatgtttgtgaatatgacaccctgccagctcaatgtggactttgttgtactcctggtctatgtcctcttcctgatggccctcacattcttcgtctccaaagccaccttctgtggcccgtgtgagaactggaagcagcatggaaggctcatctttatcactgtgctcttctccatcatcatctgggtggtgtggatctccatgctcctgagaggcaacccgcagttccagcgacagccccagtgggacgacccggtcgtctgcattgctctggtcaccaacgcatgggttttcctgctgctgtacatcgtccctgagctctgcattctctacagatcgtgtagacaggagtgccctttacaaggcaatgcctgccccgtcacagcctaccaacacagcttccaagtggagaaccaggagctctccagagcccgagacagtgatggagctgaggaggatgtagcattaacttcatatggtactcccattcagccgcagactgttgatcccacacaagagtgtttcatcccacaggctaaactaagcccccagcaagatgcaggaggagtagaattcggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacg；
[0181]
gprc5d-a1的核酸氨基酸序列为：
[0182]
mattvpdgcrnglkskyyrlcdkaeawgivletslailgivvtillllaflflmrkiqdcsqwnvlptqllfllsvlglfglafafiielnqqtapvryflfgvlfalcfscllahasnlvklvrgcvsfswttilciaigcsllqiiiateyvtlimtrgmmfvnmtpcqlnvdfvvllvyvlflmaltffvskatfcgpcenwkqhgrlifitvlfsiiiwvvwismllrgnpqfqrqpqwddpvvcialvtnawvflllyivpelcilyrscrqecplqgnacpvtayqhsfqvenqelsrardsdgaeedvaltsygtpiqpqtvdptqecfipqaklspqqdaggvefgkpipnpllgldst；
[0183]
gprc5d-a2的核苷酸序列为：
[0184]
atgtacaaggactgcatcgagtccactggagactattttcttctctgtgacgccgaggggccatggggcatcattctggagtccctggccatacttggcatcgtggtcacaattctgctactcttagcatttctcttcctcatgcgaaagatccaagactgcagccagtggaatgtcctccccacccagctcctcttcctcctgagtgtcctggggctcttcggactcgcttttgccttcatcatcgagctcgacgggagcacagggcccacacgctttctctttggggttctctttgctctctgtttctcatgcctcttagctcatgcctccaatctagtgaagctggttcggggttgtgtctccttctcctggacgacaattctgtgcattgctattggttgcagtctgttgcaaatcattattgccactgagtatgtgactctca
tcatgaccagaggtatgatgtttgtgaatatgacaccctgccagctcaatgtggactttgttgtactcctggtctatgtcctcttcctgatggccctcacattcttcgtctccaaagccaccttctgtggcccgtgtgagaactggaagcagcatggaaggctcatctttatcactgtgctcttctccatcatcatctgggtggtgtggatctccatgctcctgagaggcaacccgcagttccagcgacagccccagtgggacgacccggtcgtctgcattgctctggtcaccaacgcatgggttttcctgctgctgtacatcgtccctgagctctgcattctctacagatcgtgtagacaggagtgccctttacaaggcaatgcctgccccgtcacagcctaccaacacagcttccaagtggagaaccaggagctctccagagcccgagacagtgatggagctgaggaggatgtagcattaacttcatatggtactcccattcagccgcagactgttgatcccacacaagagtgtttcatcccacaggctaaactaagcccccagcaagatgcaggaggagtagaattcggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacg；
[0185]
gprc5d-a2的氨基酸序列为：
[0186]
mykdciestgdyfllcdaegpwgiileslailgivvtillllaflflmrkiqdcsqwnvlptqllfllsvlglfglafafiieldgstgptrflfgvlfalcfscllahasnlvklvrgcvsfswttilciaigcsllqiiiateyvtlimtrgmmfvnmtpcqlnvdfvvllvyvlflmaltffvskatfcgpcenwkqhgrlifitvlfsiiiwvvwismllrgnpqfqrqpqwddpvvcialvtnawvflllyivpelcilyrscrqecplqgnacpvtayqhsfqvenqelsrardsdgaeedvaltsygtpiqpqtvdptqecfipqaklspqqdaggvefgkpipnpllgldst
[0187]
gprc5d-a3的核苷酸序列为：
[0188]
atgtacaaggactgcatcgagtccactggagactattttcttctctgtgacgccgaggggccatggggcatcattctggagtccctggccatacttggcatcgtggtcacaattctgctactcttagcatttctcttcctcatgcgaaagatccaagactgcagccagtggaatgtcctccccacccagctcctcttcctcctgagtgtcctggggctcttcggactcgcttttgccttcatcatcgagctcaatcaacaaactgcccccgtacgctactttctctttggggttctctttgctctctgtttctcatgcctcttagctcatgcctccaatctagtgaagctggttcggggttgtgtctccttctcctggacgacaattctgtgcattgctattggttgcagtctgttgcaaatcattattgccgaatatattgtcctgaccatgaataggaccaacgtcaatgtcttttctgagctttccgctcctcgtcgcaatgaagacgtggactttgttgtactcctggtctatgtcctcttcctgatggccctcacattcttcgtctccaaagccaccttctgtggcccgtgtgagaactggaagcagcatggaaggctcatctttatcactgtgctcttctccatcatcatctgggtggtgtggatctccatgctcctgagaggcaacccgcagttccagcgacagccccagtgggacgacccggtcgtctgcattgctctggtcaccaacgcatgggttttcctgctgctgtacatcgtccctgagctctgcattctctacagatcgtgtagacaggagtgccctttacaaggcaatgcctgccccgtcacagcctaccaacacagcttccaagtggagaaccaggagctctccagagcccgagacagtgatggagctgaggaggatgtagcattaacttcatatggtactcccattcagccgcagactgttgatcccacacaagagtgtttcatcccacaggctaaactaagcccccagcaagatgcaggaggagtagaattcggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacg；
[0189]
gprc5d-a3的氨基酸序列为：
[0190]
mykdciestgdyfllcdaegpwgiileslailgivvtillllaflflmrkiqdcsqwnvlptqllfllsvlglfglafafiielnqqtapvryflfgvlfalcfscllahasnlvklvrgcvsfswttilciaigcsllqiiiaeyivltmnrtnvnvfselsaprrnedvdfvvllvyvlflmaltffvskatfcgpcenwkqhgrlifitvlfsiiiwvvwismllrgnpqfqrqpqwddpvvcialvtnawvflllyivpelcilyrscrqecplqgnacpvtayqhsfqvenqelsrardsdgaeedvaltsygtpiqpqtvdptqecfipqaklspqqdaggvefgkpipnpllgldst；
[0191]
gprc5d-a4的核苷酸序列为：
[0192]
atgtacaaggactgcatcgagtccactggagactattttcttctctgtgacgccgaggggccatgggg
catcattctggagtccctggccatacttggcatcgtggtcacaattctgctactcttagcatttctcttcctcatgcgaaagatccaagactgcagccagtggaatgtcctccccacccagctcctcttcctcctgagtgtcctggggctcttcggactcgcttttgccttcatcatcgagctcaatcaacaaactgcccccgtacgctactttctctttggggttctctttgctctctgtttctcatgcctcttagctcatgcctccaatctagtgaagctggttcggggttgtgtctccttctcctggacgacaattctgtgcattgctattggttgcagtctgttgcaaatcattattgccactgagtatgtgactctcatcatgaccagaggtatgatgtttgtgaatatgacaccctgccagctcaatgtggactttgttgtactcctggtctatgtcctcttcctgatggccctcacattcttcgtctccaaagccaccttctgtggcccgtgtgagaactggaagcagcatggaaggctcatctttatcactgtgctcttctccatcatcatctgggtggtgtggatctccatgctcctgcctgactttgaccgcaggtgggatgacaccatcctcagctccccggtcgtctgcattgctctggtcaccaacgcatgggttttcctgctgctgtacatcgtccctgagctctgcattctctacagatcgtgtagacaggagtgccctttacaaggcaatgcctgccccgtcacagcctaccaacacagcttccaagtggagaaccaggagctctccagagcccgagacagtgatggagctgaggaggatgtagcattaacttcatatggtactcccattcagccgcagactgttgatcccacacaagagtgtttcatcccacaggctaaactaagcccccagcaagatgcaggaggagtagaattcggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacg；
[0193]
gprc5d-a4的氨基酸序列为：
[0194]
mykdciestgdyfllcdaegpwgiileslailgivvtillllaflflmrkiqdcsqwnvlptqllfllsvlglfglafafiielnqqtapvryflfgvlfalcfscllahasnlvklvrgcvsfswttilciaigcsllqiiiateyvtlimtrgmmfvnmtpcqlnvdfvvllvyvlflmaltffvskatfcgpcenwkqhgrlifitvlfsiiiwvvwismllpdfdrrwddtilsspvvcialvtnawvflllyivpelcilyrscrqecplqgnacpvtayqhsfqvenqelsrardsdgaeedvaltsygtpiqpqtvdptqecfipqaklspqqdaggvefgkpipnpllgldst。
[0195]
上述实验结果显示，与现有已公开抗体相比本发明公布的抗体至少具有以下优点：1)cdr序列差异大，与gprc5d抗原结合表位不同；2)结合活性好；3)特异性更强，安全性好；4)具备物种交叉反应性，便于用途产品的开发。
[0196]
同时本发明的抗体还可以与靶向其它靶点的抗体，如：cd3、bcma、cd38等构建成双特异性抗体，开发成各种具有调节肿瘤细胞作用的方法。另外，该技术发明的抗体还可以通过偶联其它类型的分子，如：毒素、核酸分子等，通过该抗体特异地将偶联的分子带到肿瘤细胞体内，从而调节肿瘤细胞的作用。此外，本技术发明的抗体还可以开发成通过免疫手段，对组织细胞表面gprc5d表达量进行检测的方法。
[0197]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
技术特征：
1.一种抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区：所述重链可变区，其包含：由seq id no:44所示的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr1，由inpx1ngx2t的氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr2，由arx3alryamdy氨基酸序列组成的重链互补决定区hcdr3；所述轻链可变区，其包含：由qx4x5x6tx7的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr1，由sas的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr2，由qqx8x9x
10
x
11
pvt的氨基酸序列组成的轻链互补决定区lcdr3；其中，x1:代表y、p、r、l、d、s、g、k、v、t、m和q的任一氨基酸，x2:代表r和a的任一氨基酸，x3:代表v和a的任一氨基酸，x4:代表s和a的任一氨基酸，x5:代表v和a的任一氨基酸，x6:代表s、v、l、r、h、e、g、q、m和y的任一氨基酸，x7:代表r、p、h、s、w、i、g、v和n的任一氨基酸，x8:代表y和a的任一氨基酸，x9:代表n和a的任一氨基酸，x
10
:代表s和a的任一氨基酸，x
11
:代表y和a的任一氨基酸。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源抗体。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区选自如seq id no:79、seq id no:81、seq id no:83、seq id no:85或seq id no:87所示的氨基酸序列；所述轻链可变区选自如seq id no:89、seq id no:91、seq id no:93、seq id no:95或seq id no:97的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区为seq id no:87所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区为seq id no:89所示的氨基酸序列。5.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述包含以下i至iv中任一种性质：i、所述抗体能够特异性结合g蛋白偶联受体c5家族亚型d；ii、所述抗体不与cd19、cd3、cd11b或cd14中的任一项相结合；iii、所述抗体特异性地结合人gprc5d并与猴gprc5d交叉反应；iv、所述抗体具有内吞活性。6.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含如权利要求1或2所述的抗体。7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的抗体或如权利要求6所述的重组蛋白。8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码如权利要求1或2所述抗体或如权利要求6所述的重组蛋白的核苷酸序列。
9.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求8所述的多核苷酸。10.一种分离细胞，其特征在于，所述细胞产生如权利要求1或2所述的抗体或如权利要求6所述的重组蛋白。11.一种抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求10所述的分离细胞，从培养物中回收所述抗体。12.权利要求1或2的抗体或权利要求6所述的重组蛋白在制备癌症的药物或药物组合物中的应用；优选的，所述癌症为多发性骨髓瘤。13.权利要求1或2的抗体或权利要求6所述的重组蛋白在制备抗体检测试剂盒中的应用。
技术总结
本发明公开了抗GPRC5D抗体、其制备方法与用途，所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID O:44(HCDR1)、SEQ ID O:99(HCDR2)和SEQID O:100(HCDR3)所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID O:101(LCDR1)、SAS(LCDR2)和SEQ ID O:102(LCDR3)所示的氨基酸序列；或，所述重链可变区包含SEQ ID O:29(HCDR1)、SEQ ID O:30(HCDR2)和SEQ ID O:31(HCDR3)所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID O:47(LCDR1)、YAS(LCDR2)和SEQ ID O:48(LCDR3)所示的氨基酸序列。所述抗GPRC5D抗体具有较强的结合活性、反应特异性、物种交叉反应性和内吞活性，适应于后续癌症等相关疾病的和产品开发。开发。开发。
