一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体及其应用的制作方法
一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体及其和应用。
背景技术：
2.t细胞的激活不仅通过t细胞受体的抗原刺激介导，还通过某些共刺激分子诱导共刺激信号，共刺激分子肿瘤坏死因子(tnf)超家族的les在调节免疫应答和诱导双向信号方面发挥重要作用。肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)和肿瘤坏死因子超家族(tnfsf)的成员ox40(cd 134)和ox40l(cd 252)在t细胞的增殖和存活中发挥着重要作用，在肿瘤、感染性、炎症和自身免疫性疾病中也均有异常表达。
3.ox40，又名tnfrsf4(tumor necrosis factor receptor superfamily,member 4)，具有协同刺激功能，是一种50kd的糖蛋白，有一个细胞质尾部，一个跨膜结构域和细胞外区域。主要在表达于激活的cd4+和cd8+t细胞表面，和ox40l结合可以刺激cd8+t细胞的活化。通过ox40/ox40l信号的共激活效应，t细胞的功能，包括细胞因子的产生、增殖和t细胞的存活等作用将被进一步加强。ox40抗体激活剂(agonist)可降低肿瘤内tregs，提高抗肿瘤活性。目前公开的数据显示，有多种ox40的抗体药物已经进入临床研究阶段，后续越来越多的ox40抗体药物将会进入到临床阶段，ox40靶点药物研发市场具有很大的开发潜力，和其抗体有相似功能的ox40/ox40l核酸适配体用于肿瘤免疫的可行性也被广泛研究。
4.核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。
5.基于selex的筛选原理，ox40/ox40l核酸适配体用于肿瘤免疫的可行性也被广泛研究。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些ox40的核酸适配体序列，并在小鼠模型上验证了其抗肿瘤增殖的能力，发现ox40/ox40l核酸适配体和ox40/ox40l抗体具有相似的抗肿瘤免疫功效。然而这些ox40/ox40l的核酸适配体存在一些缺点，例如，有些核酸适配体的靶标是鼠源ox40/ox40l蛋白，实际应用受限；有些核酸适配体分子量大，针对ox40蛋白的结合亲和力不太高、特异性不好、稳定性不高等。因此，本领域对具有针对人源ox40/ox40l蛋白的结合亲和力更高的核酸适配体存在需求。
技术实现要素：
6.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合ox40蛋白的核酸适配体、核酸适配体的缀合物、核酸适配体的衍生物及其应用。
7.本发明提出的一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的至少一种：
8.(1)seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列，其中：
9.seq id no:1是
10.tccagcactccacgcataacccacacaccgtgtctgccctccggtccccgcattaggttatgcgtgcgacggtgaa，
11.seq id no:2是
12.tccagcactccacgcataactcccgctccgatcgcgtgcgttgacaccgtgtccgggttatgcgtgcgacggtgaa，
13.seq id no:3是
14.tccagcactccacgcataaccacatcggtcgggctgctcgaggcttgcgcaaaccagttatgcgtgcgacggtgaa，
15.seq id no:4是
16.tccagcactccacgcataacccccccctgcaccccaggtcttccgcgcccggacgagttatgcgtgcgacggtgaa；
17.(2)与seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列具有60％以上同源性且特异性结合ox40蛋白的dna序列，优选可以是70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上、99％以上；
18.(3)由seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列转录且特异性结合ox40蛋白的rna序列。
19.另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合高表达ox40蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
20.在另一方面，本发明还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光标记物，例如放射性物质、性物质、生物素、、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合高表达ox40蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
21.换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与高表达ox40蛋白的结合。
22.作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种核酸适配体的衍生物，其是将所述核酸适配体或者所述核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成硫代磷酸酯骨架而得，或者是将所述核酸适配体或者所述核酸适配体的缀合物改造成的肽核酸，条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与高表达ox40蛋白结合。
23.本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指rna和dna核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
24.本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成dna分子类似物，于1991年由nielsen等首次报道。用n-2-(氨乙基)-甘氨酸(n-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(pna)没有如dna或rna上的磷酸基团，因此pna与dna之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于dna与dna之间的结合强度。
[0025][0026]
为一个总的发明构思，本发明还提供了所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：
[0027]
(1)纯化ox40蛋白或检测ox40蛋白；
[0028]
(2)表达ox40的细胞、组织或活体定位成像；
[0029]
(3)捕获表达ox40的细胞或外泌体；
[0030]
(4)肿瘤中的免疫疗法。
[0031]
作为一个总的发明构思，本发明还提供了所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或所述的核酸适配体的衍生物在制备用于靶向肿瘤的药物中的用途。
[0032]
在一个实施方案中，本发明的核酸适配体、其缀合物或其衍生物，优选本发明的核酸适配体可以用于ox40蛋白纯化或检测，检测受试者肿瘤组织中ox40的表达量。
[0033]
作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种试剂盒，包含所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或所述的核酸适配体的衍生物；优选地，所述试剂盒包含seq id no:1-4所示的任意一个或两个核酸适配体、其缀合物或其衍生物；更优选地，所述试剂盒包含seq id no:1-4所示的任意一个或两个核酸适配体。
[0034]
作为一个总的发明构思，本发明还提供了所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或所述的核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的应用，其中所述试剂盒用于选自由以下各项组成的组中的任意一项：
[0035]
(1)纯化ox40蛋白或检测ox40蛋白；
[0036]
(2)表达ox40的细胞、组织或活体定位成像；
[0037]
(3)捕获表达ox40的细胞或外泌体；
[0038]
(4)抑制肿瘤增殖、转移；
[0039]
(5)激活淋巴细胞、促进细胞因子释放。
[0040]
本发明使用体外指数富集的配基系统进化(selex)技术，筛选得到了特异性结合高表达ox40蛋白的核酸适配体。具体的，本发明人设计并合成了一个随机单链dna文库和相应的引物，用来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合高表达ox40蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合ox40蛋白的核酸适配体，并检测了它们与ox40蛋白的结合能力。
[0041]
本发明的有益效果如下：
[0042]
本发明所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物高度特异性结合ox40蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。
附图说明
[0043]
图1为本发明实施例1筛选得到的ox40-29与ox40蛋白的亲和力检测数据(spr数据)。
[0044]
图2为本发明实施例1筛选得到的ox40-92与ox40蛋白的亲和力检测数据(spr数据)。
[0045]
图3为本发明实施例1筛选得到的ox40-10与ox40蛋白的亲和力检测数据(spr数据)。
[0046]
图4为本发明实施例1筛选得到的ox40-61与ox40蛋白的亲和力检测数据(spr数据)。
[0047]
图5为ox40-92的点杂交实验结果。
具体实施方式
[0048]
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0049]
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
[0050]
实施例1：特异性结合ox40蛋白的ssdna核酸适配体的筛选
[0051]
1、合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：
[0052]
随机单链dna文库：
[0053]5’‑
tccagcactccacgcataac-36n-gttatgcgtgcgacggtgaa-3’[0054]
其中，“36n”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0055]
引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0056]
表1引物及其序列
[0057][0058]
其中，引物名称中的s代表正向引物，引物名称中a代表反向引物，序列中的19个a表示由19个腺苷酸(a)组成的polya尾，“spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。三种“spacer 18”的结构式如下式i-iii所示。在上述3’端引物中所用的“spacer 18”结构式如式i所示。
[0059][0060]
引物分别用mes缓冲液(mes：100mm，nacl：150mm，kcl：1mm，mgcl2：1mm，cacl2：1mm；ph6.0，25℃)配制成100μm的贮存液，于-20℃保存备用。
[0061]
2、磁珠法筛选
[0062]
采用磁珠法筛选，共计筛选六轮，每一轮的筛选流程见表2。
[0063]
表2 ox40蛋白适配体筛选流程
[0064]
[0065][0066]
具体筛选方法如下：
[0067]
1)羧基磁珠固定ox40蛋白
[0068]
取50μl羧基磁珠(invitrogen,dynabeads
tm
myone
tm
carboxylic acid，#65012)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好的nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用mes缓冲液清洗2遍后备用。
[0069]
取80μl的ox40蛋白(该ox40蛋白以(ncbi reference sequence:np_054862.1的第18-132位氨基酸的基因序列为模板，进行分子克隆，并使用大肠杆菌表达)(浓度为0.1mg/ml)，加入ph 3.0的甘氨酸盐酸溶液20μl混匀，加入到上述的活化磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育50min，ox40蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。
[0070]
偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1m乙醇胺ph8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10min，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μl mes清洗4遍，标记为mb-ox40。
[0071]
2)反筛
[0072]
用连有bsa蛋白的磁珠(标记为mb-bsa)进行反筛，偶联bsa蛋白的方法同偶联ox40蛋白相同。bsa蛋白浓度为0.5mg/ml，用ph4.0的10mm naac溶液稀释。每一轮磁珠筛选在进行以ox40蛋白为靶标的正筛之前都先用bsa反筛蛋白磁珠进行反筛，反筛步骤如下：制备的单链核苷酸文库经变复性后，与50μl mb-bsa磁珠孵育，垂直旋转仪上25℃孵育30min。置于磁力架上，收集上清，上清作为单链核苷酸文库与mb-ox40磁珠进行正筛。
[0073]
3)磁珠筛选
[0074]
取1od随机单链核苷酸文库，14000rpm离心10分钟，将文库离心到管底，用mes缓冲液溶解至10μm，分装到pcr管进行变复性处理。处理过程如下：pcr仪设定程序95℃保持10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，然后在25℃保持5分钟。将得到的处理后的文库加入到50μl的mb-bsa磁珠，混匀后在垂直混合仪上25℃孵育30分钟。置于磁力架上，收集上清，标记为pool-，上清作为单链核苷酸文库与mb-ox40磁珠进行正筛。
[0075]
反筛后的文库加入到50μl mb-ox40磁珠，在垂直混合仪上25℃孵育50分钟。置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl mes清洗磁珠4次。清洗后的磁珠加入200μl mes沸水浴10min，收集上清，标记为elution-ox40。
[0076]
以elution-ox40中的核酸分子为模板，用乳浊液pcr(epcr)进行扩增。方法如下：将全部模板elution-ox40加入2ml pcr mix中混匀，加入4倍体积的epcr微液滴生成油，涡旋制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/管加入到pcr管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共35个循环，4℃保存。epcr微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(aptamy)生物科技有限公司(货号：epo100)，pcr mix的配方见表3。
[0077]
表3 epcr mix配方
[0078]
试剂总体积1000μlddh2o866μl10*pfu酶buffer100μldntpmix(10mm)20μl正向引物lib18s1-fam(100μm)5μl反向引物lib18a2-ploya(100μm)5μlpfu酶4μl(200u)
[0079]
扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的epcr产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的pcr扩增产物，按体积比1：1加入tbe/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟使dna变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400v电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的fam标记的链与反向的链分开，7m尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表4。
[0080]
表4变性聚丙烯酰胺凝胶配方
[0081]
成分用量尿素3.78g40％聚丙烯酰胺1.8ml5*tbe1.8mlddh2o2.25ml10％aps60μltemed15μl
[0082]
切胶回收fam标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，ex(nm)：495，em(nm)：517检测我们需要的带有fam标记的ssdna；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlep管中并捣碎，加入1ml ddh2o后沸水浴10分钟将胶中的ssdna转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，方法为：加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到dna单链用3kd的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库；
[0083]
磁珠法重复筛选6轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中用spr检测dna单链文库对ox40蛋白识别能力的变化，当dna单链文库对ox40蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的dna单链文库与靶标的结合能力高于筛选起始投入的文库，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。
[0084]
所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链dna文库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛磁珠的用量。
[0085]
3、分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体，将得到的富集文库产物经克隆测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测亲和力。
[0086]
在后续检测中，确定了4条序列具有很强的结合能力，将4条序列进行截短之后分别得到了seq id no:1-4所示的核酸适配体，且验证后具有理想的结合ox40蛋白的亲和力，
将它们分别命名为ox40-29、ox40-92、ox40-10和ox40-61。
[0087]
实施例2：表面等离子共振(spr)检测ox40核酸适配体与ox40蛋白的亲和力
[0088]
1.将上海生工合成核酸适配体ox40-29(seq id no:1)、ox40-92(seq id no:2)、ox40-10(seq id no:3)和ox40-61(seq id no:4)，分别用mes缓冲液稀释成：0.390625、1.5625、12.5、25、50nm；以及0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5nm。
[0089]
2.将实施例1中制备的ox40蛋白偶联到bsa芯片表面：先用50mm naoh清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用将等体积的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)两个试剂混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/min。将ox40蛋白用ph 4.0的10mm醋酸钠稀释至终浓度为50μg/ml后进样，进样体积50μl，流速5μl/min，ox40蛋白偶联量为5000ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μl/min，进样50μl。
[0090]
3.检测：使用表面等离子共振仪(ge healthcare，型号：biacore t200)设定动力学检测参数，进样30μl/min*3min，解离30μl/min*5min，再生1m nacl30μl/min*0.5min，将稀释好各个浓度的核酸适配体ox40-29和ox40-92依次进样。
[0091]
亲和力检测数据见图1(ox40-29)和图2(ox40-92)，这些数据说明ox40-29和ox40-92用spr仪均检测到与ox40蛋白有很强的结合，kd值分别为3.438nm和0.9944nm。
[0092]
实施例3:斑点杂交鉴定ox40-92核酸适配体与ox40蛋白的亲和力
[0093]
1.取10cm
×
5cm的硝酸纤维素膜(购自millipore)，将ox40蛋白分别用mes稀释成如下浓度：0.5/0.17/0.05/0.017/0.005mg/ml。点样1ul到硝酸纤维素膜上，自然风干。同时将对照蛋白(cd172)稀释到0.5mg/ml，点样到膜上，自然风干。
[0094]
2.待干燥后，用10％bsa在室温封闭6小时，封闭结束后用mes清洗3次，吸净，洗时放置在摇床上，每次10分钟。
[0095]
3.将生物素修饰的核酸适配体ox40-92，稀释到1um，变复性处理：95℃10分钟变性，然后立即冰浴5分钟，再室温平衡10分钟。
[0096]
4.变复性后的核酸适配体和硝酸纤维素膜上的蛋白摇床室温孵育2小时。
[0097]
5.孵育结束后用mest(含0.5
‰
tween20)洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
[0098]
6.加入hrp-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号a0303)用mes按照1:10000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。
[0099]
7.mest洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
[0100]
8.以a液：b液＝1:1(v/v)的比例加入显液(beyoecl star特超敏ecl化学发光试剂盒，购自碧云天，货号p0018a，a液和b液为试剂盒自带溶液)，在室温显1分钟。
[0101]
9.成像系统观察拍照：使用仪器为ge医疗生命科学部的imagequant
tm
las 4000数字成像系统。
[0102]
结果如图5所示，实验组显明显，对照cd172蛋白没有显。这说明生物素修饰的核酸适配体ox40-92可以用于膜杂交ox40蛋白的检测，并且不结合对照蛋白cd172，图5也包含各蛋白浓度梯度变化的情况以及对照蛋白的情况。可以看出，随着ox40蛋白浓度的降低，显的斑点颜变浅，这说明ox40-92可以用于膜杂交ox40蛋白的检测，而且灵敏度较高。本发明得到的适配体与cd172蛋白没有结合。
[0103]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种特异性结合ox40蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的至少一种：(1)seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列，其中:seq id no:1是tccagcactccacgcataacccacacaccgtgtctgccctccggtcc ccgcattaggttatgcgtgcgacggtgaa，seq id no:2是tccagcactccacgcataactcccgctccgatcgcgtgcgttgacacc gtgtccgggttatgcgtgcgacggtgaa，seq id no:3是tccagcactccacgcataaccacatcggtcgggctgctcgaggcttg cgcaaaccagttatgcgtgcgacggtgaa，seq id no:4是tccagcactccacgcataacccccccctgcaccccaggtcttccgcg cccggacgagttatgcgtgcgacggtgaa；(2)与seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列具有60％以上同源性且特异性结合ox40蛋白的dna序列；(3)由seq id no:1-4中任意一个所示的dna序列转录且特异性结合ox40蛋白的rna序列。2.根据权利要求1所述的特异性结合ox40蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合ox40蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。3.一种核酸适配体的缀合物，其特征在于，其是在权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接其他用于标记、检测、诊断或的物质而得，且所述核酸适配体的缀合物特异性结合ox40蛋白；优选地，所述其他用于标记、检测、诊断或的物质为荧光标记物,优选为fam、放射性物质、性物质、生物素、、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记中的至少一种。4.一种核酸适配体的衍生物，其特征在于，其是将权利要求1或2所述核酸适配体或者权利要求3所述核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成硫代磷酸酯骨架而得，或者是将权利要求1或2所述核酸适配体或者权利要求3所述核酸适配体的缀合物改造成的肽核酸，且所述核酸适配体的衍生物特异性结合ox40蛋白。5.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：(1)纯化ox40蛋白或检测ox40蛋白；(2)表达ox40的细胞、组织或活体定位成像；(3)捕获表达ox40的细胞或外泌体；(4)肿瘤中的免疫疗法。6.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在制备用于靶向肿瘤的药物中的用途。
7.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物。8.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的应用，其中所述试剂盒用于选自由以下各项组成的组中的任意一项：(1)纯化ox40蛋白或检测ox40蛋白；(2)表达ox40的细胞、组织或活体定位成像；(3)捕获表达ox40的细胞或外泌体；(4)抑制肿瘤增殖、转移；(5)激活淋巴细胞、促进细胞因子释放。
技术总结
本发明公开了一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体，包括以下三种序列中的至少一种：(1)SEQ ID O:1-4中任意一个所示的DA序列；(2)与SEQ ID O:1-4中任意一个所示的DA序列具有60％以上同源性且特异性结合OX40蛋白的DA序列；(3)由SEQ ID O:1-4中任意一个所示的DA序列转录且特异性结合OX40蛋白的RA序列。本发明还公开了上述核酸适配体、其缀合物和衍生物的应用。本发明所提供的核酸适配体、其缀合物和衍生物高度特异性结合OX40蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。易于保存和标记。易于保存和标记。
