PDGF-D在调控干细胞增殖和/或分化中的应用
pdgf-d在调控干细胞增殖和/或分化中的应用
技术领域
1.本发明属于干细胞培养领域，具体地，涉及pdgf-d在调控干细胞增殖和/或分化中的应用。
背景技术：
2.干细胞(stem cell，sc)是一类具有自我更新能力和多分化潜能的细胞，即在体外培养可以无限增殖；同时可以多向分化，被诱导分化为几乎所有类型的细胞。因此，干细胞在再生医学和组织修复方面具有广阔的应用前景和利用价值。
3.血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,pdgf)是生长因子家族的重要成员之一，可促进多种细胞，如血管细胞，神经元细胞等的生长，分化和迁移。pgdf家族包含四个亚型(pdgf-a、-b、-c和-d)和两个酪氨酸激酶受体pdgfr-α/β。其中，pdgf-d是中山眼科中心李旭日博士与其同事于2001年发现的新的pdgf家族成员，其由348个氨基酸组成，在n端有一个cub蛋白质结构域，c端有一个core domain结构域。cub结构域在空间上阻断了受体的结合，因而起初会以未活化的前体形式分泌，而后胞外蛋白酶如尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)及蛋白裂解酶识别并水解cub结构域，从而剩下的core domain结构域就可结合和激活pdgf受体和下游通路。pdgf蛋白均可通过二硫键可形成5个同源或异源二聚体，包括pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd，它们可通过与细胞膜上两种血小板衍生因子受体α、β(pdgfrα、β)不同程度地结合并激活其酪氨酸激酶，从而激活下游信号通路。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供pdgf-d在调控干细胞增殖和/或分化中的应用，以通过作用于干细胞的erk信号通路调控干细胞的增殖、分化活动。
5.根据本发明的一个方面，提供pdgf-d在调控干细胞增殖和/或分化中的应用。
6.进一步地，pdgf-d具有促进干细胞分化的作用。
7.进一步地，干细胞的分化方向为朝血管内皮细胞方向分化。
8.根据本发明的一个方面，一种利用pdgf-d促进干细胞分化的方法：利用pdgf-d通过激活pdgfrβ,进而激活干细胞中的erk信号通路。
9.可选地，包括上调干细胞的pdgf-d表达水平的操作步骤。
10.可选地，包括向干细胞的培养基中添加pdgf-dd蛋白的操作步骤。
11.进一步地，干细胞的分化方向为朝血管内皮细胞方向分化。
12.进一步地，erk信号通路被激活的表现为磷酸化erk1/2的表达水平上调。
13.进一步地，干细胞为胚胎干细胞。
14.根据本发明的一个方面，一种用于促进干细胞分化的添加剂：添加剂的活性成分包括pdgf-dd蛋白和/或pdgf-d基因的激动剂。
15.根据本发明的另一个方面，提供一种提高胚胎干细胞的增殖能力的方法：包括下
调pdgf-d的表达水平的步骤。
16.进一步地，包括通过抗原抗体免疫反应抑制pdgf-d的表达；或，包括通过基因沉默抑制pdgf-d的表达；或，包括通过采用pdgf-d抑制剂抑制pdgf-d信号通路的表达，pdgf-d抑制剂选自pdgf-d受体pdgfrβ抑制剂、pdgf-d配体抑制剂中的至少一种。
17.根据本发明的另一个方面，提供一种用于提高干细胞的增殖能力的组合物：组合物中的活性成分包括pdgf-d抑制剂，pdgf-d抑制剂选自pdgf-d配体抑制剂、pdgf-d受体抑制剂、pdgf-d下游信号通路抑制剂中的至少一种。
18.进一步地，pdgf-d配体抑制剂包括靶向pdgf-d的核酸效应分子或单克隆抗体中的至少一种。
19.进一步地，pdgf-d受体抑制剂包括pdgfrβ抑制剂。pdgfrβ抑制剂可选自靶向pdgfrβ的中和抗体或通过基因沉默对pdgfrβ表达进行抑制。
20.进一步地，pdgf-d下游信号通路抑制剂包括mapk/erk通路抑制剂。
21.进一步地，mapk/erk通路抑制剂包括pd0325901。
22.生长因子对干细胞的调控是非常精细的，pdgf-d在干细胞中通过结合pdgfrβ受体从而激活下游erk通路调控细胞干性，本发明通过调节pdgf-d的表达，从而实现了对胚胎干细胞的增殖、分化活动的有效调控。
23.心血管疾病是目前全球致死率和致残率最高的疾病之一，其与血管内皮细胞的数目减少、功能紊乱密切相关。由于血管内皮细胞增殖能力有限，无法自我更新，因此使用干细胞分化为血管内皮细胞成为目前研究和临床应用的重点方向。尽管目前已有多种方法诱导干细胞分化为血管内皮细胞，但其效率、纯度等仍未尽如人意。不同组织的血管内皮细胞具有异质性；血管内皮细胞在发育和形成过程、干细胞向内皮细胞分化过程中也会出现不同的细胞亚型，表达不同的分子标记物。本发明探明了干细胞定向分化为血管内皮细胞过程中关键的重要蛋白和机制，利用pdgf-d可促进胚胎干细胞向血管内皮细胞方向的分化。
附图说明
24.图1为实施例1中诱导mescs细胞内皮分化的rt-qpcr检测结果；
25.图2为实施例2中mescs增殖实验的shctrl、shpdgfd细胞数量的柱形统计图，其中，在同组对照数据中，位于左侧的柱形图对应shctrl的细胞数量，位于右侧的柱形对应shpdgfd的细胞数量；
26.图3为实施例2中mescs增殖实验的shctrl稳定细胞系、shpdgfd稳定细胞系二次铺板实验培养结果，其中，在柱形统计图的同组对照数据中，位于左侧的柱形对应shctrl的细胞数量，位于右侧的柱形对应shpdgfd的细胞数量；
27.图4为实施例2中mescs分化实验的光镜拍照及碱性磷酸酶染结果；
28.图5为实施例2中mescs分化实验中关于干细胞多能性标志物的rt-qpcr检测结果，其中，在同组对照数据中，位于左侧的柱形图对应shctrl的标志物rna表达量，位于右侧的柱形对应shpdgfd的标志物rna表达量；
29.图6为实施例2中mescs分化实验的western blot检测结果；
30.图7为实施例2中mescs分化实验中关于血管内皮细胞相关分子标记物的qrt-pcr检测结果，其中，在同组对照数据中，位于左侧的柱形图对应shctrl的标志物rna表达量，位
于右侧的柱形对应shpdgfd的标志物rna表达量；
31.图8为实施例2中稳定敲pdgf-d组mescs(shpdgfd)的go分析结果；
32.图9为对实施例2中的shctrl、shpdgfd进行gsea分析的统计结果；
33.图10为实施例3中对实验小鼠胚胎的心脏进行切片染的取样区域；
34.图11为对应图10的样本切片染的观察视图以及对应的cd31的区域密度统计图；
35.图12为实施例3中对实验小鼠胚胎的脑部进行切片染的取样区域；
36.图13为对应图12的样本切片染的观察视图以及对应的cd31的区域密度统计图；
37.图14为实施例4中的畸胎瘤形成实验的畸胎瘤组织实物图；
38.图15为实施例4中的畸胎瘤形成实验的畸胎瘤组织切片后的he染图；
39.图16为实施例4中的畸胎瘤形成实验的qrt-pcr检测结果，其中，在同组对照数据中，位于左侧的柱形图对应shctrl的标志物rna表达量，位于右侧的柱形对应shpdgfd的标志物rna表达量；
40.图17为实施例5中参试细胞的内皮细胞标记物ang2、vegf-a、vegfr-2、tie2的qrt-pcr检测结果；
41.图18为实施例5中参试细胞的sox2、ve-cadherin、cd133的qrt-pcr检测结果；
42.图19为实施例6中利用加入了外源pdgf-d的培养基培养mescs的western blot检测结果；
43.图20为实施例6中利用加入了外源pdgf-d的培养基培养mescs的qrt-pcr检测结果；
44.图21为实施例6中利用pdgf-dd蛋白刺激小鼠胚胎干细胞后的western blot检测结果；
45.图22为实施例6中利用pdgf-dd蛋白和pdfgrβ中和抗体共同作用于小鼠胚胎干细胞后的western blot检测结果；
46.图23为实施例6中的小鼠胚胎干细胞的磷酸酶染效果图。
具体实施方式
47.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
48.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
49.以下实施例所采用的物料及方法概述如下：
50.1、实验所需物料
51.(1)细胞
52.小鼠胚胎干细胞系e14及hek 293t细胞：来自申请人实验室。
53.(2)质粒
54.小鼠pdgfd基因4inl shrna慢病毒载体：plent-pdgfd-4in1-shrna，购于vigene biosciences公司；
55.阴性对照载体：plent-4in1 shrna-gfp-puro(插入的是无义序列)，购于vigene biosciences公司；
56.慢病毒包装质粒pspax2和pmd2g均购于addgene公司。
57.(3)抗体和蛋白
58.本实施例所涉及的抗体和蛋白的详细信息如表1所示。
59.表1 本实施例所采用的抗体和蛋白
60.[0061][0062]
(4)shrna序列
[0063]
本实施例所采用的shrna的序列编码如表2所示。
[0064]
表2 shrna序列编码
[0065][0066]
[0067]
2、胚胎干细胞系的制备
[0068]
(1)小鼠胚胎干细胞的复苏及培养
[0069]
1)配制小鼠胚胎干细胞完全培养基：knockout dmem 500ml+15％fbs+0.1mm mem-neaa+1％p/s+2mm l-glutamine+0.1mm 2-me+1000u/ml lif，4℃保存。
[0070]
2)0.1％gelatin的配制：将0.1g gelatin粉末溶解于100ml ddh2o中，混合均匀，高温灭菌，常温保存。
[0071]
3)配制10
×
pbs：磷酸二氢钾(kh2po4)2.7g+磷酸氢二钠(na2hpo4)14.2g+氯化钠(nacl)80g+氯化钾(kcl)2.0g，加双蒸水定容至1l，混匀，高温灭菌后常温保存。使用时，用灭菌双蒸水稀释成1
×
pbs。
[0072]
4)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置约30min；
[0073]
5)用负压泵吸走gelatin溶液，向培养皿中加适量培养基；
[0074]
6)离心管中预热5ml培养基或pbs；
[0075]
7)从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃恒温水浴槽中，快速解冻；
[0076]
8)将悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心，3min，吸走上清；
[0077]
9)重悬细胞并转移至干净的培养皿，放入co2培养箱中培养。待细胞贴壁后，每两天换一次液；
[0078]
10)显微镜下观察，当细胞克隆长大，细胞密度长至80％～90％时可传代。待传2-3代后，细胞可用于实验。
[0079]
(2)小鼠胚胎干细胞的传代
[0080]
1)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置30min；
[0081]
2)用负压泵吸走gelatin溶液；
[0082]
3)用1
×
pbs漂洗细胞2次；
[0083]
4)加0.25％胰蛋白酶消化细胞，在室温孵育约30s后，轻轻摇晃培养皿，显微镜下见细胞克隆松散；
[0084]
5)加培养基终止消化，按1:3-1:6的比例，将细胞铺到新的培养皿中，摇匀细胞悬液后，将培养皿放回37℃co2培养箱中培养。
[0085]
3、细胞rna提取，反转cdna及qrt-pcr
[0086]
1)取生长至80％密度的细胞，弃培养液，用pbs洗1次，加入500μl trizol裂解细胞，转移至1.5ml离心管中；
[0087]
2)加入100μl，用力摇晃20s，静置3min后4℃离心10min，12000rpm；
[0088]
3)将上清吸取到新的离心管中，不要吸到中间层；按1:1的比例向上清中加入异丙醇，混匀，静置10min后4℃离心10min；
[0089]
4)弃上清，加入1ml 75％的乙醇；
[0090]
5)4℃离心5min，弃上清，加入1ml 75％乙醇，4℃离心5min后，弃上清，将离心管倒立于干净的吸水纸上，待管底的白沉淀变透明，加入50μl ddh2o，-20℃保存；
[0091]
6)获得的总rna，利用fastking rt kit with dnase(tiangen)试剂盒合成cdna；
[0092]
7)以合成好的cdna为模板，参照sybr green(roche)试剂盒，在abi quantstudio 6 flex device(life technologies)pcr仪上进行基因表达水平的检测：
[0093]
8)以gapdh为内参基因，用delta-delta ct法对各基因的表达进行计算。各基因的
引物序列在primerbank网站上获取。
[0094]
4、western blot实验
[0095]
1)配制液体：
[0096]
①
10
×
running buffer：依次加入144g甘氨酸、10g sds粉末、30.3g tris粉末，加ddh2o定容至1升。使用时需稀释成1
×
running buffer；
[0097]
②5×
sds loading buffer：依次加入sds粉末4g、溴酚蓝20mg、dtt 3.085g、tris-hcl(1m ph 6.8)10ml、甘油20ml，加ddh2o定容至40ml；
[0098]
③
10
×
transfer buffer：依次加入30.3g tris粉末、144g甘氨酸，加ddh2o定容至1l。使用时稀释成1
×
transfer buffer，即10
×
transfer buffer 100ml+甲醇200ml+蒸馏水700ml。
[0099]
2)配制分离胶和浓缩胶
[0100]
①
按照表3的配方配制8％分离胶(10ml)：
[0101]
表3 8％分离胶配方
[0102]
成分含量ddh2o4.6ml30％acrylamide2.7ml1.5m ph 8.8 tris-hcl2.5ml10％aps100μl10％sds100μltemed4μl
[0103]
②
按照表4的配方配制5％的浓缩胶浓缩胶(5ml)：
[0104]
表4 5％的浓缩胶浓缩胶
[0105]
成分含量ddh2o3.4ml30％acrylamide0.83ml0.5m ph 6.8 tris-hcl0.63ml10％aps5μl10％sds5μltemed4μl
[0106]
3)蛋白凝胶电泳：取出电泳槽，组装蛋白凝胶电泳装置，小心地拔掉梳子，向电泳槽中加入1升1
×
sds running buffer，向上样孔中依次加入蛋白marker及样品。插上装置电源，设置程序：恒压100v，1.5h，开始电泳，直到溴酚蓝接近分离胶下缘时，停止电泳。
[0107]
4)转膜：取出pvdf膜和滤纸，甲醇浸泡pvdf膜30s。拆除电泳装置，取出凝胶，按照顺序组装好转膜夹(即“三明治”样结构)，组装过程中要注意赶走气泡。组装转膜装置，加入转膜液，设置转膜程序：恒流250ma，1.5h-2h，开始转膜。
[0108]
5)封闭：转膜结束后，取出pvdf膜并放入配制好的封闭液中，在室温摇床上封闭1h；
[0109]
6)孵育一抗：用1
×
tbst洗膜数次，至牛奶冲洗干净为止，用封闭液配制好一抗，并放入pvdf膜，孵育盒放入4℃冷库的摇床上过夜孵育；
[0110]
7)用1
×
tbst洗膜三次，10min每次；
[0111]
8)用封闭液按1：5000比例配制二抗，并放入pvdf膜，孵育盒置于摇床上，在室温下孵育1h；
[0112]
9)同上步骤清洗pvdf膜。
[0113]
10)显影、曝光：在避光环境中，配制化学显液液，并将pvdf膜放入化学显液中，正面朝上，孵育1-3分钟。将pvdf膜放入蛋白凝胶曝光系统中，正面朝上并滴加几滴发光液(避免膜放干)，曝光，拍照，记录和保存结果。
[0114]
5、慢病毒包装法建立稳定细胞株(以6孔板为例)
[0115]
1)配制hek 293t细胞完全培养基：dmem培养基500ml+10％fbs+1％p/s，4℃保存。
[0116]
2)接种hek 293t细胞于6孔板中，当细胞密度达到80％后，换成无双抗的培养基；
[0117]
3)准备转染试剂及质粒:
[0118]
a液：opti-mem 100μl(50μl
×
2)，慢病毒包装质粒pspax2和pmd2g各2μg轻轻混匀。
[0119]
b液：opti-mem 500μl(250μl
×
2)，lipo2000 20μl(10μl
×
2)，轻轻混匀，室温静置5min。
[0120]
4)将a液均分到两个ep管中，分别加入shctrl、shpdgfd质粒各2μg，并分别加入200μl
[0121]
opti-mem，室温放置5min；
[0122]
5)将b液均分到步骤3)中的ep管内，轻轻混匀，在室温下孵育15min；
[0123]
6)将4)中混合液轻柔地滴加到6孔板中，随后将孔板放入37℃co2培养箱培养；
[0124]
7)6h后更换新鲜无双抗的培养基；
[0125]
8)转染24h、48h后，分别用5ml的注射器吸取上清，再用直径0.45μm滤器过滤上清至15ml离心管中；
[0126]
9)准备要侵染的细胞：将e14细胞常规消化，细胞计数后，以2*105/孔的密度接种于6孔板中；
[0127]
10)将步骤7)中过滤的上清滴加到孔板中，锡箔纸包裹孔板，离心600g，90min；
[0128]
11)吸走上清，加入新鲜培养基，重悬细胞，将细胞铺均匀后，放入37℃co2培养箱培养；
[0129]
12)转染72h后，换液，并加入嘌呤霉素(5μg/ml)进行药筛，未被感染的细胞将死亡；
[0130]
13)每天换液，并加入嘌呤霉素药筛，至细胞不再死亡为止；
[0131]
14)扩增细胞，冻存保种及进行后续试验。
[0132]
6、集落形成及碱性磷酸酶(ap)染
[0133]
1)在一个6孔板的细胞培养板中，以2x105的细胞/孔的密度铺入小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，培养基为含10％胎牛血清的高糖dmem。
[0134]
2)第二天，等饲养层细胞达到90％的密度后，加入10μg/ml的丝裂霉素进行处理，终止细胞的分裂。放入培养箱处理3小时后，取出用pbs洗1次，换上常规胚胎干细胞培养基。
[0135]
3)小鼠胚胎干细胞进行消化、中和和重悬，细胞计数后以1000个细胞/孔的密度分别铺入6孔板的细胞培养板中。
[0136]
4)培养板置于培养箱中培养7天，每2天换一次培养基。第7天，进行ap染实验。根
据vector blue alkaline phosphatase substrate kit(sk-5300，vector laboratories)说明书的要求进行试剂的配制，然后将细胞培养基全部吸走，pbs洗1次后，按1.5ml/孔的体积将染剂加入到细胞中，避光孵育10分钟。
[0137]
5)弃染剂，加pbs洗1次，加适量pbs后放在倒置显微镜观察拍照，观察染蓝的克隆状态及着程度，判断细胞的自我更新状态。
[0138]
7、小鼠胚胎干细胞的非定向诱导分化
[0139]
1)-lif培养的诱导分化：在小鼠胚胎干细胞培养液中不添加lif因子(-lif培养液)，并用这种培养液持续培养小鼠胚胎干细胞4天，可诱导小鼠胚胎干细胞向三胚层分化，每天收集样品。
[0140]
2)拟胚体(embryo id body，eb)形成实验：常规消化、收集小鼠胚胎干细胞，离心后，用去lif去2i(-lif-2i)的培养基重悬细胞，细胞计数后，以1
×
106/皿的密度将细胞接种于细菌培养皿中，-lif-2i的培养基培养。按不同时间点(0，3，6，9天)，在光镜下观察拟胚体大小、形态并拍照保存，收集蛋白和rna样品。
[0141]
8、胚胎干细胞增殖实验
[0142]
1)常规消化shctrl及shpdgfd胚胎干细胞，细胞计数后，向12孔板中每孔分别接种
[0143]1×
104/个细胞；
[0144]
2)培养板放入37℃co2培养箱中常规培养；
[0145]
3)培养72h和96h后，分别消化细胞，并进行细胞计数，统计、比较细胞数目。
[0146]
9、畸胎瘤形成实验
[0147]
1)准备细胞：用10cm培养皿各养三盘shctrl及shpdgfd胚胎干细胞，待克隆长大、长满，常规消化细胞，分别收集有10
×2×
106个细胞的悬液(每只裸鼠注射2
×
106个细胞，共8只裸鼠，考虑注射过程中细胞的损失，需多准备两只裸鼠所需的细胞)；
[0148]
2)1000rpm，离心3min，弃上清；
[0149]
3)1ml pbs重悬细胞(每只裸鼠注射100μl细胞悬液)，将细胞悬液转移至ep管，用锡箔纸包裹ep管(避免动物房传递窗中紫外线照射，使细胞失活)；
[0150]
4)注射小鼠胚胎干细胞(在动物房屏障区操作)：
[0151]
a.连接小鼠呼吸麻醉机装置，加入异氟烷，开启机器；
[0152]
b.将裸鼠放入呼吸机所连的密闭笼盒中；
[0153]
c.待裸鼠麻醉后，将其取出，口鼻放入呼吸机连接的软管中，进行持续麻醉；
[0154]
d.用1ml注射器抽吸100μl细胞悬液，注意抽吸前需轻弹ep管，混匀悬液，避免细胞沉降到管底；
[0155]
e.用镊子夹起裸鼠耳后皮肤，皮下注射细胞悬液，停顿大概30s后抽针，左侧注射shctrl胚胎干细胞，右侧注射shpdgfd胚胎干细胞，依次注射完8只裸鼠；
[0156]
5)每周观察裸鼠生长状态，4周后，取出裸鼠，麻醉后，依次摆好拍照；
[0157]
6)将裸鼠安乐死，取出皮下畸胎瘤组织，称重，拍照；
[0158]
7)剪下少量畸胎瘤组织，用于后续的rna提取及western blot等实验；
[0159]
8)将畸胎瘤组织放入4％pfa固定，固定液体积是组织体积10倍以上；
[0160]
9)送至servicebio生物科技公司进行石蜡切片及he染。
[0161]
10、基因芯片测序分析
[0162]
用shrna稳定敲低e14细胞系中pdgf-d的表达，构建shpdgf-d及对照组shctrl细胞系，大量扩增细胞，每个样品收集不少于106个细胞的沉淀，加入1ml trizol裂解液，每组准备三个重复样品。将收集的trizol样品送到上海康成生物工程公司进行基因芯片测序分析。测序数据结果会传到geo数据库。
[0163]
实施例1
[0164]
本实施例对mescs进行拟胚(embryoid body，eb)培养模拟体内胚胎发育以诱导mescs向内皮分化。在mescs的内皮分化过程中，分别在0，4，7天收样，进行rt-qpcr检测。如图1所示，随着mescs内皮分化程度加深，rt-qpcr检测到pdgf-d表达更加强烈，与内皮标记物ve-cadherin和vegfr2一致。由此说明，pdgf-d有利于mesc向血管分化。
[0165]
实施例2
[0166]
采用常规的小鼠胚胎干细胞、pdgf-d稳定敲低的小鼠胚胎干细胞分别构建对照组(shctrl)、pdgf-d稳定敲低组(shpdgfd)以开展本实施例的培养增殖实验。
[0167]
1、mescs增殖实验
[0168]
将参试的细胞分别以10000/孔的密度接种于12孔板中，在接种后的72h、96h，分别统计shctrl、shpdgfd的细胞数量。如图2所示，与shctrl相比，shpdgfd的细胞数量明显更多，说明敲低pdgf-d的表达能够显著增强了mescs的细胞增殖能力。
[0169]
采用shctrl、shpdgfd的稳定细胞系进行二次铺板实验。将细胞以200，400，800/孔的密度分别接种于6孔板中，7天后进行碱性磷酸酶染(碱性磷酸酶活性是胚胎干细胞自我更新能力的表型之一)，比较mescs形成克隆的大小和数量，从而判断干细胞克隆形成能力的强弱。结果显示，敲低pdgf-d的表达后，克隆数目明显增多，克隆大小更大，说明抑制pdgf-d的表达能明显增强mescs克隆形成的能力(图3)。综上所述，可得出抑制pdgf-d的表达能够维持mescs自我更新以及增殖能力。
[0170]
2、mescs分化实验
[0171]
用+lif的培养基培养shctrl、shpdgfd稳定细胞系，2天后在光镜下拍照并进行碱性磷酸酶染(碱性磷酸酶活性是胚胎干细胞自我更新能力的表型之一)，结果如图4所示，在shctrl中，细胞克隆变扁平，碱性磷酸酶活性低，细胞分化严重，而在shpdgfd中，细胞克隆形态立体、边角圆润，碱性磷酸酶活性高。用rt-qpcr检测(图5)胚胎分化各胚层标志物的表达，与shctrl相比，shpdgfd的胚胎分化的三个胚层的标志物表达均受到明显抑制。说明当pdgf-d敲低后，mescs的多能性增强。western blot检测干细胞多能性标志物，western blot实验结果(图6)进一步验证，以hsp90作为内参，pdgf-d敲低后，sox2的表达明显升高，而细胞分化的标志物的表达明显下降，这表明，抑制pdgf-d的表达有利于维持mescs自我更新。
[0172]
进一步地，对本实施例培养得到的shctrl、shpdgfd稳定细胞系进行rt-qpcr检测，以统计细胞中血管内皮细胞相关分子标记物cd133,cd34,cd31和vegf-a的表达。如图7所示，与shctrl细胞相比，shpdgfd细胞的cd133,cd34,cd31和vegf-a的表达均显著下降，由此说明pdgf-d敲低会抑制血管内皮细胞方向的分化。
[0173]
为了探明pdgf-d调控小鼠胚胎干细胞的分子作用机制，通过对mescs进行了基因芯片数据分析，以探索在小鼠胚胎干细胞中，稳定敲低pdgf-d后，pdgf-d对全基因组转录的影响。设置1.5倍的差异为标准，且p《0.05，进行差异转录本分析，筛选和确定本实施例构建
的shctrl、shpdgfd之间存在明显差异表达基因。利用gene ontology(go分析)、gsea方法对shpdgf-d后下调的基因进行分析，go分析(图8)发现pdgf-d敲低后下调的基因与血管新生、发育及血管内皮细胞分化具有密切联系，gsea分析(图9)发现pdgf-d敲低后下调的基因与促血管新生经典通路vegf有密切相关性。上述数据提示pdgf-d能够促进血管内皮细胞的分化。
[0174]
实施例3
[0175]
本实施例建立由pdgf-d全身敲除小鼠作为实验对象构成的实验组以及由前述pdgf-d全身敲除小鼠同窝的野生型小鼠作为实验对象构成的对照组，以探讨pdgf-d对血管发育的作用。
[0176]
对同窝的野生型(wt)和pdgf-d敲除(ko)小鼠e12.5天胚胎中心脏和脑部的血管染情况进行比对：图10展示了对实验小鼠e12.5天胚胎的心脏进行切片染的取样区域视图，利用cd31对样本进行染和统计，如图11所示，pdgf-d敲除后，胚胎心脏中cd31的密度下降，证明心脏血管减少；图12展示了对实验小鼠e12.5天胚胎的脑部进行切片染的取样区域视图，利用cd31对样本进行染和统计，如图13所示，pdgf-d敲除后，胚胎脑中cd31的密度下降，证明脑血管减少。综上，在ko小鼠中，心脏和脑的血管密度(cd31阳性)均比野生型要低，说明pdgf-d的敲除会抑制血管的发育。
[0177]
实施例4
[0178]
为了在动物体内验证胚胎干细胞的分化潜能，本实施例按照以下步骤设置体内畸胎瘤形成实验：分别将2
×
106个shctrl、shpdgfd细胞注射到裸鼠两侧耳后皮下间隙，裸鼠存在免疫缺陷，具有多向分化潜能的小鼠胚胎干细胞在裸鼠体内可分化成不同胚层的组织，形成畸胎瘤。
[0179]
4周之后取出畸胎瘤组织，如图14所示，与对照组相比，在注射shpdgfd mescs的裸鼠中，畸胎瘤的大小明显偏小。对畸胎瘤组织进行石蜡切片和he染，观察结果如图15所示，pdgf-d敲低后血管的管腔组织数目比对照组要明显下降(见图15中箭头所指示的位置)。qrt-pcr分析显示(图16)，在pdgf-d稳定敲低mescs中，中胚层(血管从中胚层分化而来)标记物(hand1、brachyury、eomes)以及血管内皮细胞标记物(cd31、cdc42、ve-cadherin等)的表达均明显下调。综上所述，敲低pdgf-d的表达可抑制胚胎干细胞朝血管内皮细胞分化。
[0180]
实施例5
[0181]
设置本实施例的目的在于探究过量pdgf-d对mescs自我更新的影响。
[0182]
采用常规的小鼠胚胎干细胞、pdgf-d过表达的小鼠胚胎干细胞分别构建对照组细胞系(ctrl)、pdgf-d过表达的细胞系(pdgf-d oe)以开展本实施例的培养增殖实验。
[0183]
对对照组细胞系和pdgf-d过表达的细胞系进行qrt-pcr检测，检测结果如图17所示，据此说明pdgf-d过表达可促进小鼠胚胎干细胞中内皮细胞标记物ang2、vegf-a、vegfr-2、tie2的表达水平升高，证明pdgf-d可促进胚胎干细胞向内皮细胞方向分化。
[0184]
此外，如图18所示，与ctrl相比，在pdgf-d oe中，sox2的表达下调，而血管内皮细胞标记物ve-cadherin和cd133的表达上调，但若加入mapk/erk通路的抑制剂pd0325901后，sox2的水平会回升，而血管内皮细胞标记物的表达会下降。上述实验结果说明，pdgf-d是通过erk通路调控mescs自我更新和血管内皮分化的。
[0185]
实施例6
[0186]
本实施例通过在mescs的培养基中加入外源的pdgf-dd蛋白，以探究过量的外源pdgf-dd蛋白对mescs的影响。
[0187]
在外源加入pdgf-dd蛋白后处理24h和48小时后，以tubulin为内参，western blot结果(图19)显示sox2的表达下降。qrt-pcr检测结果(图20)表明，同样在加入pdgf-dd蛋白处理mescs 4天后sox2和nanog的表达逐天下降。说明外源加入pdgf-dd蛋白可降低mescs自我更新的维持能力。
[0188]
在无血清无lif的培养条件下，用pdgf-dd蛋白刺激小鼠胚胎干细胞，在刺激15min、30min、60min对参试细胞进行western blot测试和碱性磷酸酶染实验。western blot实验结果(图21)显示，从15min开始，pdgf-dd蛋白刺激明显地激活了小鼠胚胎干细胞erk信号通路，磷酸化erk1/2的表达明显升高，与此一致的是，pdgfrβ受体在y1021、y751的两个磷酸化位点也同时被激活，这两个pdgfrβ受体的磷酸化位点是已经被证实的可被pdgf-d激活的位点。而加入pdgf-dd蛋白刺激的同时加入pdfgrβ中和抗体，磷酸化erk1/2的表达降低，如图22所示。碱性磷酸酶染实验(碱性磷酸酶活性是胚胎干细胞自我更新能力的表型之一)中显示，在对照组中细胞圆润，碱性磷酸酶活性高，分化程度低，pdgf-d过表达后碱性磷酸酶活性低，细胞分化严重。在过表达同时加入mapk/erk通路的抑制剂pd0325901，碱性磷酸酶活性高，细胞分化程度降低，如图23所示。综上，我们可以得出结论，pdgf-d可通过激活pdgfrβ,进而激活小鼠胚胎干细胞中的erk信号通路。
[0189]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
技术特征：
1.pdgf-d在调控干细胞增殖和/或分化中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：pdgf-d具有促进干细胞分化的作用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述干细胞的分化方向为朝血管内皮细胞方向分化。4.一种利用pdgf-d促进干细胞分化的方法，其特征在于：利用pdgf-d通过激活pdgfrβ,进而激活干细胞中的erk信号通路。5.如权利要求4所述利用pdgf-d促进干细胞分化的方法，其特征在于：所述干细胞为胚胎干细胞。6.一种用于促进干细胞分化的添加剂，其特征在于：所述添加剂的活性成分包括pdgf-dd蛋白和/或pdgf-d基因的激动剂。7.一种提高胚胎干细胞的增殖能力的方法，其特征在于：包括下调pdgf-d的表达水平的步骤。8.一种用于提高干细胞的增殖能力的组合物，其特征在于：所述组合物中的活性成分包括pdgf-d抑制剂，所述pdgf-d抑制剂选自pdgf-d配体抑制剂、pdgf-d受体抑制剂、pdgf-d下游信号通路抑制剂中的至少一种。9.如权利要求8所述用于提高干细胞的增殖能力，其特征在于：所述pdgf-d受体抑制剂包括pdgfrβ抑制剂。10.如权利要求8所述用于提高干细胞的增殖能力，其特征在于：所述pdgf-d下游信号通路抑制剂包括mapk/erk通路抑制剂。
技术总结
本发明提供PDGF-D在调控干细胞增殖和/或分化中的应用。利用PDGF-D在干细胞中结合PDGFRβ受体从而激活下游Erk通路调控细胞干性，本发明通过调节PDGF-D的表达，从而实现了对胚胎干细胞的增殖、分化活动的有效调控。分化活动的有效调控。分化活动的有效调控。
