一种基于定量核磁共振氢谱技术的乌头类中药质量控制方法
1.本发明属于中药材质量控制技术领域，具体涉及一种基于定量核磁共振氢谱技术的乌头类中药质量控制方法。
背景技术：
2.乌头类中药主要包括乌头(aconitum carmichaelii debx.)植物的干燥母根和子根、北乌头(aconitum kusnezoffii reichb.)植物的干燥块根，这些药材又被分别称为川乌、附子和草乌。其中，川乌经炮制后称为制川乌。附子经不同的炮制方法后称为盐附子、黑顺片、白附片、炮附片、淡附片。草乌经炮制后称为制草乌。制川乌、盐附子、黑顺片、白附片、炮附片、淡附片、制草乌是临床上广泛使用的一类乌头类中药，有回阳救逆、温肾助阳、祛寒止痛的功效，用于肾阳不足、畏寒肢冷、风寒湿痹等症。
3.乌头类中药主要含有单酯型和双酯型生物碱成分，这些成分是乌头类中药的有效成分，但也是其主要毒性成分。草乌、川乌和附子在炮制成饮片的过程中，其含有的双酯型和单酯型生物碱成分会发生大量降解。但研究发现，即使采用同一炮制工艺，由于药材来源等各种因素影响，这些中药材产品中的单酯型和双酯型生物碱含量会有较大差异。因此，基于安全性及产品质量的把控，对乌头类中药产品中的总双酯型生物碱和总单酯型生物碱的含量测定对相关产品的生产和质量控制具有极为重要的意义。
4.相关技术中，已报道的乌头类中药中单酯型和双酯型生物碱的测定方法有毛细管电泳、高效液相―紫外、高效液相―蒸发光散射、高效液相―质谱等。但这些方法所测定的双酯型生物碱仅限于(aconitne)、新(mesaconitne)、次(hypaconitne)，单酯型生物碱仅限于苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine)、苯甲酰新乌头原碱(benzoylmesaconine)、苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine)，使用单一某种方法对于乌头类中药中单酯型和双酯型生物碱的测定并不全面。如去氧(deoxyactonitine)、10-羟基(10-oh-actonitine)等也是其生物活性/毒性物质，但在采用上述方法对乌头类中药进行质量控制时并未考虑它们的贡献，从而经常导致中毒事件的发生。另外，这些方法的分析时间通常较长，如《中国药典》中乌头类中药的定量分析采用的hplc方法，分析时间长达65～70分钟，不利于大量样品的快速分析。
5.因此，开发一种能够快速且全面检测乌头类中药中单酯型和双酯型生物碱的测定方法对于乌头类中药加工生产以及质量控制都具有极为重要的意义。
技术实现要素：
6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于定量核磁共振氢谱(qhmnr)测定乌头类中药中总单酯型生物碱和总双酯型生物碱的方法，从而用于乌头类中药的质量控制。
7.本发明的第一个方面，提供一种同时检测乌头类中药中单酯型生物碱和双酯型生物碱的方法，包括如下步骤：
8.使用乙酸乙酯对乌头类中药进行萃取，将萃取液干燥后溶解于氘代丙酮中，调节ph至1.0～2.0，测定核磁共振氢谱数据，计算得到单酯型生物碱和双酯型生物碱含量；
9.其中，单酯型生物碱在核磁共振氢谱中的定量峰(h-14)为4.89～4.93ppm或4.95～4.99ppm；
10.双酯型生物碱在核磁共振氢谱中的定量峰(h-15)为4.72～4.77ppm或4.55～4.63ppm。
11.核磁共振波谱技术在天然产物的结构鉴定方面具有独特的优势，由于核磁共振氢谱(hnmr)中氢的积分面积与数目成正比，因此可以用于复杂基质中特定成分的定量分析。发明人发现，基于核磁共振氢谱定量分析无需相应的标准品，因此非常适合乌头类中药中多种双酯型生物碱和单酯型生物碱的同时定量。
12.在本发明的一些实施方式中，所述乌头类中药经过前处理得到；所述前处理包括粉碎，过筛，酸液处理，超声，离心和碱化中的至少一种。
13.在本发明的一些实施方式中，前处理为依次进行的粉碎，过筛，酸液处理，超声，离心和碱化。
14.在本发明的一些实施方式中，所述粉碎，过筛为对乌头类中药进行粉碎至可通过2号或3号筛进行过筛的粉末状。
15.在本领域中，2号筛孔径850
±
29μm，24目；3号筛孔径355
±
13μm，50目。
16.在本发明的一些实施方式中，所述酸液包括盐酸。
17.在本发明的一些实施方式中，所述盐酸为0.5～1.0％hcl(v/v)的水溶液。
18.在本发明的一些实施方式中，所述盐酸为1％hcl(v/v)的水溶液。
19.在本发明的一些实施方式中，所述酸液与乌头类中药的料液比为5～20ml：1g。
20.在本发明的一些实施方式中，所述酸液与乌头类中药的料液比为50ml：3g。
21.在本发明的一些实施方式中，所述酸液处理的具体操作为：将乌头类中药粉末与酸液混合。
22.在本发明中，发明人考虑到单酯型和双酯型生物碱具有弱碱性，因此可以采用酸性水溶液提取。
23.在本发明的一些实施方式中，所述超声为：对乌头类中药粉末与酸液的混合溶液进行超声处理。
24.在本发明的一些实施方式中，所述超声的条件为：功率250～350w，频率35～45khz；室温提取30min。
25.在本发明中，术语“室温”，也指“常温”，如无特殊说明，具体指约为25℃的温度条件，其中，在本发明中涉及数值的“约”的含义为误差
±
5℃。
26.在本发明的一些实施方式中，所述离心条件为：3000～5000rpm下离心5～15min。
27.在本发明的一些实施方式中，所述离心条件为：4000rpm下离心10min。
28.在本发明的一些实施方式中，所述碱化为：采用碱液调节体系ph至碱性。
29.在本发明的一些实施方式中，所述碱化为：采用碱液调节体系ph至9～10。
30.在本发明的一些实施方式中，所述碱化为：采用碱液调节体系ph至9.5～9.8。
31.在本发明的一些实施方式中，所述碱化采用的ph调节剂为碱性溶液。
32.在本发明的一些实施方式中，所述碱性溶液包括氨水。
33.发明人发现，在溶液体系被调节至碱性时，类成分更易被乙酸乙酯萃取出来，从而实现对它们的富集。
34.在本发明的一些实施方式中，所述前处理的具体操作为：将乌头类中药粉碎成粉末状，过2号或3号筛，按照5～20ml：1g乌头类中药的料液比加入0.5～1.5％盐酸酸化，超声，离心，取上清液加氨水调节ph至9～10。
35.在本发明的一些实施方式中，所述萃取液为乙酸乙酯层溶液。
36.在本发明的一些实施方式中，所述萃取液与酸液的体积比为2～5:1。
37.在本发明的一些实施方式中，所述乌头类中药包括乌头或乌头类植物的药用部位和/或其制品。
38.在本发明的一些实施方式中，所述核磁共振氢谱数据采集条件包括：
39.扫描次数：1～64次；光谱宽度：7～20.5ppm；脉冲角度：30～90
°
。
40.在本发明的一些实施方式中，所述核磁共振氢谱数据采集条件为：
41.辐照频率600mhz；探针温度298k；关闭旋转；扫描次数1～64次；光谱宽度7～20.5ppm；开启自动过滤器；驰豫延时10s；脉冲角度30～90
°
；脉冲宽度9.62μs。
42.在本发明的一些实施方式中，所述方法具体为：
43.取经上述前处理后的乌头类中药(调整ph后的上清液)，使用乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯层溶液，浓缩干燥后加入氘代丙酮，用氯化氘调节ph至1.0～2.0，滤膜过滤后测定核磁共振氢谱数据，计算得到单酯型生物碱和双酯型生物碱含量。
44.在本发明的一些实施方式中，所述氘代丙酮的体积为0.5～2ml。
45.在本发明中，发明人通过优化氘代试剂及其酸碱度，最终确定单酯型和双酯型生物碱在酸性氘代丙酮中的h-14或h-15信号分别为其特征性信号，并且在该信号下不会被其他信号干扰，可以实现总单酯型生物碱和总双酯型生物碱的准确定量。本发明与目前测定方法相比，不仅操作简单、耗时较短，还无需要相应的对照品，从而解决了对照品难以获得、不稳定等问题。此外，该质量控制方法测定的单酯型和双酯型生物碱更加全面，使得对乌头类中药的评价更加准确。
46.本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的方法在如下(1)～(3)中任一项中的应用；
47.(1)乌头类中药质量控制；
48.(2)乌头类中药鉴定；
49.(3)乌头类中药成分分析；
50.其中，所述成分为单酯型生物碱和/或双酯型生物碱。
51.本发明的有益效果是：
52.1.本发明中提供了一种操作简单、耗时较短(例如：以常规采集16次计算，每个样品仅需3min 48s采样时间)、无需相应对照品(仅需要配制一个准确浓度的次即可对其他双酯型或单酯型生物碱进行准确定量)的更准确进行乌头类中药质量控制的方法，loq(定量限)以s/n大于30及准确度介于90～110％计算，为0.2mm；以s/n大于3及准确度介于85～115％计算，为0.07mm，具有极高的检测准确性。
53.2.本发明中的方法可以相对传统方法，实现更多的单酯型和双酯型生物碱检测，以达到更精确、更全面的控制乌头类中药质量的目的。且方法适用范围广，可用于多种乌头
类中药的质量控制。
附图说明
54.图1为本发明实施例中的白附片的1h-nmr图谱中总单酯型生物碱(mdas)和总双酯型生物碱(ddas)的定量峰。
具体实施方式
55.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
56.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
57.实施例1
58.在本实施例中，选择以盐附子作为乌头类中药检测样品进行检测，具体步骤为：
59.将盐附子粉碎成粉末状，过2号筛(孔径850
±
29μm，24目)。取约3g盐附子粉末进行检测。将盐附子粉末置于带有塞子的50ml锥形瓶中，加入50.0ml含有1％hcl(v/v)的盐酸水溶液，在功率300w，频率40khz，室温超声提取30min。在4000rpm下离心10min。取25ml上清液，加入浓氨水溶液使其ph为9.5。将调整ph后的上清液转移至250ml分离漏斗中，用70ml乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯层，浓缩干燥后溶解与2ml氘代丙酮中。用氯化氘溶液(用氘代甲醇将35％氯化氘稀释10倍得到)将ph值调节至2.0，通过0.22μm膜过滤使用布鲁克avance 600核磁共振波谱仪对样品采集1h-nmr数据。
60.qhnmr数据采集条件为：辐照频率600mhz；探针温度298k；关闭旋转；扫描次数16次；光谱宽度20.5ppm；开启(八次)自动过滤器；采集时间3min 48s；驰豫延时10s；脉冲角度30
°
；脉冲宽度9.62μs。
61.峰值设置为：总单酯型生物碱定量峰h-14(4.89～4.93ppm)，总双酯型生物碱定量峰h-14(4.95～4.99ppm)。
62.结合eretic 2功能根据采集得到的数据计算总单酯型生物碱和总双酯型生物碱含量。
63.结果发现，本实施例中的盐附子中，总双酯型生物碱的含量为0.0069％，总单酯型生物碱的含量为0.0238％，符合中国药典要求，说明该盐附子产品合规，无质量和安全性问题。
64.实施例2
65.在本实施例中，选择以白顺片作为乌头类中药检测样品进行检测，具体步骤为：
66.将白顺片粉碎成粉末状，过2号筛(孔径850
±
29μm，24目)。取约3g白顺片粉末进行检测。将白顺片粉末置于带有塞子的50ml锥形瓶中，加入50.0ml含有1％hcl(v/v)的盐酸水溶液，在功率300w，频率40khz，室温超声提取30min。在4000rpm下离心10min。取25ml上清液，加入浓氨水溶液使其ph为9.8。将调整ph后的上清液转移至250ml分离漏斗中，用75ml乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯层，浓缩干燥后溶解与2ml氘代丙酮中。用氯化氘溶液(用氘代甲醇将35％氯化氘稀释10倍得到)将ph值调节至1.0，通过0.22μm膜过滤使用布鲁克
avance 600核磁共振波谱仪对样品采集1h-nmr数据。
67.qhnmr数据采集条件为：辐照频率600mhz；探针温度298k；关闭旋转；扫描次数16次；光谱宽度20.5ppm；开启(八次)自动过滤器；采集时间3min 48s；驰豫延时10s；脉冲角度30
°
；脉冲宽度9.62μs。
68.峰值设置为：总单酯型生物碱定量峰h-14(4.89～4.93ppm)，总双酯型生物碱定量峰h-14(4.95～4.99ppm)。
69.结合eretic 2功能根据采集得到的数据计算总单酯型生物碱和总双酯型生物碱含量。
70.结果发现，本实施例中的白顺片中，总双酯型生物碱的含量为0.0049％，总单酯型生物碱的含量为0.0146％，符合中国药典要求，说明该白顺片产品合规，无质量和安全性问题。
71.实施例3
72.在本实施例中，选择以制草乌作为乌头类中药检测样品进行检测，具体步骤为：
73.将制草乌粉碎成粉末状，过2号筛(孔径850
±
29μm，24目)。取约3g制草乌粉末进行检测。将制草乌粉末置于带有塞子的50ml锥形瓶中，加入50.0ml含有1％hcl(v/v)的盐酸水溶液，在功率300w，频率40khz，室温超声提取30min。在4000rpm下离心10min。取25ml上清液，加入浓氨水溶液使其ph为9.8。将调整ph后的上清液转移至250ml分离漏斗中，用65ml乙酸乙酯萃取三次。合并乙酸乙酯层，浓缩干燥后溶解与2ml氘代丙酮中。用氯化氘溶液(用氘代甲醇将35％氯化氘稀释10倍得到)将ph值调节至1.0，通过0.22μm膜过滤使用布鲁克avance 600核磁共振波谱仪对样品采集1h-nmr数据。
74.qhnmr数据采集条件为：辐照频率600mhz；探针温度298k；关闭旋转；扫描次数16次；光谱宽度20.5ppm；开启(八次)自动过滤器；采集时间3min 48s；驰豫延时10s；脉冲角度30
°
；脉冲宽度9.62μs。
75.峰值设置为：总单酯型生物碱定量峰h-14(4.89～4.93ppm)，总双酯型生物碱定量峰h-14(4.95～4.99ppm)。
76.结合eretic 2功能根据采集得到的数据计算总单酯型生物碱和总双酯型生物碱含量。
77.结果发现，本实施例中的白顺片中，总双酯型生物碱的含量为0.0091％，总单酯型生物碱的含量为0.018％，符合中国药典要求，说明该白顺片产品合规，无质量和安全性问题。
78.实施例4
79.为了进一步测试本发明中的qhnmr方法的检测准确性，发明人分别以次和苯甲酰新乌头原碱标准品配制不同浓度的标准品溶液(次浓度分别为5.5546、1.8515、0.6172、0.2057、0.0686mm；苯甲酰新乌头原碱浓度分别为5.6113、1.8704、0.6235、0.2078、0.0693mm)，采用上述实施例中的qhnmr数据采集条件进行检测，检测结果如表1所示。
80.其中，扫描次数分别设置为16和32次，理论值为配制得到的次和苯甲酰新乌头原碱标准品溶液中的次和苯甲酰新乌头原碱浓度。
81.表1次和苯甲酰新乌头原碱qhnmr方法的准确度
[0082][0083][0084]
可以发现，本发明中的qhnmr方法对于次和苯甲酰新乌头原碱均具有极好的检测效果，即使在0.07mm的极低浓度下，其检测准确率依然可以达到85％以上，相比现有的检测技术具有更好的检出率。
[0085]
实施例5
[0086]
在本实施例中，以含有次的白附片(向白附片样品中添加高(0.2300mg)、中(0.1150mg)、低(0.0575mg)质量的次标准品)作为检测样品进行检测，参考《中国药典》中的方法测试本发明中的qhnmr方法对样品的加样回收率。
[0087]
同时，以未添加次的白附片样品作为空白对照，采用同样的方法测定其总双酯型生物碱含量。回收量定义为添加标准品所测得总双酯型生物碱与未添加标准品所测得总双酯型生物碱的差值。回收量与添加标准量的比值即为回收率。
[0088]
结果如表2和图1所示。
[0089]
表2次的加样回收率
[0090][0091][0092]
图1为未添加次的白附片样品的检测图谱，可以发现，本发明中的方法能够
准确检测到特定的目标峰。从在白附片中的次标准品的回收率中，可以看出本发明中的方法能够有效回收目标物，即便在极低加入量的基础上，回收率依然可以保持90％以上，具有极好的回收效果。
[0093]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种同时检测乌头类中药中单酯型生物碱和双酯型生物碱的方法，包括如下步骤：使用乙酸乙酯对乌头类中药进行萃取，将萃取液干燥后溶解于氘代丙酮中，调节ph至1.0～2.0，测定核磁共振氢谱数据，计算得到单酯型生物碱和双酯型生物碱含量；其中，单酯型生物碱在核磁共振氢谱中的定量峰为4.89～4.93ppm或4.95～4.99ppm；双酯型生物碱在核磁共振氢谱中的定量峰为4.72～4.77ppm或4.55～4.63ppm。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乌头类中药经过前处理得到；所述前处理包括粉碎，过筛，酸液处理，超声，离心和碱化中的至少一种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸液包括盐酸。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸液与乌头类中药的料液比为5～20ml：1g。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取液为乙酸乙酯层溶液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取液与酸液的体积比为2～5:1。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱化为：采用碱液调节体系ph至碱性，优选调节体系ph至9～10。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乌头类中药包括乌头或乌头类植物的药用部位和/或其制品。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱数据采集条件包括：扫描次数：1～64次；光谱宽度：7～20.5ppm；脉冲角度：30～90
°
。10.权利要求1～9任一项所述的方法在如下(1)～(3)中任一项中的应用；(1)乌头类中药质量控制；(2)乌头类中药鉴定；(3)乌头类中药成分分析；其中，所述成分为单酯型生物碱和/或双酯型生物碱。
技术总结
本发明公开了一种基于定量核磁共振氢谱技术的乌头类中药质量控制方法，包括如下步骤：使用乙酸乙酯对乌头类中药进行萃取，将萃取液干燥后溶解于氘代丙酮中，调节pH至1.0～2.0，测定核磁共振氢谱数据，通过定量峰计算得到单酯型生物碱和双酯型生物碱含量。本发明中的方法简单、快捷、无需相应对照品，定量限可达到0.2mM。且相对可以实现更多的单酯型和双酯型生物碱检测，适用范围广，能更全面的评估和控制乌头类中药质量。类中药质量。
