乙肝用抗体的制作方法
1.本发明属于抗体技术领域，涉及一种结乙肝用抗体，以及该抗体在与乙肝病毒感染相关的疾病中的用途。
背景技术：
2.病毒性乙型肝炎(hbv)感染呈世界性流行，但不同地区hbv感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染hbv，其中2.4亿人为慢性hbv感染者，每年约有65万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hcc)2。全球肝硬化和hcc患者中，由hbv感染引起的比例分别为30％和45％。我国肝硬化和hcc患者中，由 hbv感染引起的比例分别为60％和80％。我国是慢性乙肝的人口大国，流调显示目前尚有超过7％的人为乙肝感染者，总人数接近1亿人。截至2015年底，只有9％的乙型肝炎感染者得到了检测和诊断；在诊断为乙型肝炎感染的患者中，仅有8％接受了(中国肝炎防治基金会数据)。他们不仅需要长期甚至终身，为家庭、社会带来巨大负担，而且还有发展成肝硬化、肝癌的危险。据测算，我国有2800万慢性乙肝患者，每年新增近百万肝硬化病人和约30万肝癌病人。按照慢性肝炎患者5％的就诊率和肝硬化、肝癌患者95％的就诊率推算，我国每年用于乙肝相关的直接医疗费用达到800亿元-1200亿元。
3.乙肝患者经抗病毒后，虽可降低体内病毒载量，延缓严重疾病进程，但很多人不能完全清除乙肝病毒。乙肝患者需要长期服药，患者经济负担严重。根据中国疾控动态公布的数据显示，慢性肝炎患者的年平均诊疗费用占家庭年均总收入的56.24％，代偿性肝硬化占 81.53％，失代偿性肝硬化占157.21％，肝癌占96.76％。沉重的经济负担造成很多患者或者放弃或者导致家庭因病返贫。此外，从近十余年肝病的诊疗费用演变过程看，肝病的诊疗费用呈现逐年递增势态，每年增幅10％～20％左右，个人承担部分也随之增加。
4.研究显示血液中大量存在的由hbsag组成的假病毒颗粒是抑制免疫系统使感染肝细胞无法清除的主要原因。依靠某种技术降低血液中hbsag水平10-100倍，可激活人体自身的t 细胞免疫，使得机体自身免疫系统可开始有效杀伤被感染干细胞。因此有效降低血液中由 hbsag水平不但是乙肝重要的治愈标准之一更是乙肝清除被感染细胞的前提。
5.最新的临床研究结果显示,经过核苷酸类似物病毒dna清除的患者如果hbsag低于某个水平(如hbsag《1500iu/ml)其干扰素清除hbsag的几率可超过50％，远大于我们通常认为的干扰素治愈率只有5-10％的比例。
6.但由于目前缺少有效降低hbsag的药物，绝大部分患者(超过90％)hbsag水平均超过这个指标，导致干扰素无法治愈这些病人(这就是干扰素治愈率只有5-10％的原因)。这些新的临床证据对降低hbsag的方法有了更现实更迫切的需要。
7.目前研究发现降低表面抗原主要有3种途径：抑制hbsag的表达(sirna)、阻止hbsag 从细胞释放(naps)、hbsag抗体。而前两种路径由于安全性问题已受阻。因此，需要开发 hbsag抗体以获得能降低表面抗原的药物。
8.确定了用抗体技术降低hbsag水平的研究方向。经过筛选我们已经获得了多株抗
体，动物模型研究结果显示可有效降低hbsag水平。
9.发明概述
10.本发明的目的之一在于提供与人表面抗原(hbsag)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，体内外实验证明本发明所述抗体可有效降低hbsag水平。
11.一方面，本发明提供的一种与人乙肝表面抗原(hbsag)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含如下组成的重链可变区(hvr)和轻链可变区(lvr)，其中，重链可变区包含如下高变区(hcdr)的氨基酸序列：
12.第一方面，本发明涉及：
13.一种特异性结合乙肝表面抗原(hbsag)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区 (vh)序列和轻链可变区(vl)序列，其中：
14.所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：
15.hcdr1:x1x2x3x4x5x6x7x8x9x10，
16.hcdr2：x11x12x13x14x15x16x17t，
17.hcdr3：ax20x21x22x23x24x25x26x27x28x29x30x31x32dx34；
18.所述轻链可变区包含如下所示的cdr氨基酸序列：
19.lcdr1:qdisny，
20.lcdr2：aas，
21.lcdr3：qqsynipt；
22.本发明第一方面所述的抗体或片段，hcdr1中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、 x9、x10依次选自下述的任一种组合：g、g、s、i、n、r、g、g、y、y；g、g、s、s、缺失、缺失、n、g、y、y；g、y、s、f、a、缺失、缺失、n、y、g；g、y、r、f、t、缺失、缺失、s、n、g；g、g、s、v、l、缺失、缺失、s、y、f；g、g、y、l、s、缺失、缺失、n、y、a；g、y、t、f、t、s、缺失、缺失、s、y、a；k、v、t、f、s、缺失、缺失、n、y、a；g、f、t、f、s、缺失、缺失、s、y、p；g、y、t、f、t、缺失、缺失、s、y、a；g、y、t、f、t、缺失、缺失、d、y、g；g、y、t、f、t、缺失、缺失、 k、y、t；g、g、s、i、s、缺失、缺失、g、y、h；g、y、t、f、t、缺失、缺失、g、 y、y。
23.hcdr2中x11、x12、x13、x14、x15、x16、x17依次选自下述的任一种组合：i、y、 h、s、g、缺失、s；i、h、y、r、g、缺失、s；i、s、s、y、n、g、q；i、s、t、y、k、g、n；v、h、t、n、g、缺失、d；i、s、a、y、n、g、n；i、n、t、g、n、d、t；i、 s、g、s、g、g、s；i、n、a、a、n、g、d；i、n、a、g、n、g、n；i、n、p、n、s、 g、g；i、n、p、y、t、g、a；i、s、y、s、g、缺失、s；i、n、p、n、s、g、n。
24.hcdr3中x20、x21、x22、x23、x24、x25、x26、x27、x28、x29、x30、x31、 x32、x34依次选自下述的任一种组合：r、g、p、s、a、v、缺失、缺失、缺失、t、f、p、 f、y；r、g、l、n、g、g、缺失、缺失、缺失、t、y、a、f、i；r、g、l、s、d、y、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、d、r、g、g、s、g、s、缺失、缺失、y、a、f、 i；r、g、l、n、g、g、缺失、缺失、缺失、t、y、a、f、i；r、d、g、g、s、y、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、d、d、s、s、g、缺失、缺失、缺失、w、y、y、m、v； k、a、d、p、y、y、缺失、缺失、缺失、y、y、g、m、v；r、a、g、r、y、y、缺失、缺失、缺失、y、y、g、m、v；s、q、r、p、d、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、 h、r、d、y、a、缺失、缺失、缺失、a、y、a、m、v；r、g、d、y、d、s、l、t、缺失、缺失、y、a、f、i。
25.本发明第一方面所述的抗体或片段，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、 x10、x11、x12、x13、x14、x15、x16、x17、x20、x21、x22、x23、x24、x25、x26、 x27、x28、x29、x30、x31、x32、x34依次选自表1中的任一种组合：
26.表1：
27.28.[0029][0030]
本发明所述的抗体或其片段，具体地，其是由本发明表1变量所述的重链hcdr(hcdr1、 hcdr2及hcdr3)组合，与轻链lcdr1、lcdr2、lcdr3组成，其中：
[0031]
lcdr1的氨基酸序列为qdisny(seq id no1)，lcdr2的氨基酸序列为aas(seq idno:2)，lcdr3的氨基酸序列为qqsynipt(seq id no:3)。
[0032]
本发明的第二方面，在于本发明第一方面所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，在所述抗体在各cdr区的两侧还包含框架区(fr)。
[0033]
在一些实施方案中，所述框架区为人抗体框架区。在一些实施方案中，所述框架区为人抗体通用框架区。在一些实施方案中，所述框架区为人抗体通用框架区，并且包含一个或多个(例如1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3个)氨基酸取代。在一些实施方案中，所述框架区为人抗体通用框架区或与人通用框架区具有70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性。
[0034]
5、根据权利要求1-4中任意一权利要求所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中vh序列选自：seq id no：4-16；vl序列选自：seq id no：17或18。
[0035]
7、根据权利要求1-6中任意一权利要求所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中vh序列与vl序列选自如下任一组：
[0036]
seq id no：4与seq id no：19，seq id no：5与seq id no：19，seq id no：6 与seq id no：20，seq id no：7与seq id no：19，seq id no：8与seq id no：19， seq id no：9与seq id no：19，seq id no：10与seq id no：19，seq id no：11与 seq id no：19，seq id no：12与seq id no：19，seq id no：13与seq id no：19， seq id no：14与seq id no：19，seq id no：15与seq id no：19，seq id no：16 与seq id no：19，seq id no:17与seq id no：21，seq id no：18与seq id no：21，或与上述vh序列或vl序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
[0037]
表2抗体名称及对应的可变氨基酸序列
[0038]
[0039][0040]
本发明所述的抗体或抗原结合片段，其中所述hvr的恒定区选自igg系列，所述igg 系列，可以是人的，也可以是其它动物源的，如鼠源，igg可以是选自如igg1、igg2、igg3 或igg4，优选igg1；所述lvr的恒定区选自κ或λ链，优选κ链。
[0041]
本发明的第三方面，提供了及一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。
[0042]
适合的可药用载体，包括但不限于：抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、羟基苯酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂和/或佐剂。例如，适合的载体可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能补充了在肠外施用药物组合物中常见的其它材料。中兴缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它的示例性载体。本领域那些技术人员将容易地分辨可以在本发明中使用的药物组合物和剂量形式中使用的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于，药物可用的弱酸、弱碱或其混合物。缓冲液组分还包括水溶性材料，如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血栓、门冬氨酸、谷氨酸及其盐。
[0043]
药物组合物和可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳浊液、固体或者脱水或冷冻干燥的粉末保存在无菌小瓶中。这些组合物可以作为即可使用的形式、使用前需要复原的冷冻干燥形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可用形式存储。
[0044]
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段；一种表达载体，含有本发明所述核酸分子，以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞，优选真核细胞。
[0045]
本发明第四方面，提供了一种制备与人hbsag特异性结合的抗体或其抗原结合片
75 的凝胶过滤；除去污染物如igg的蛋白asepharose柱。
[0056]
另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或乙肝病毒感染的相关疾病或病症。
[0057]
本发明的第五方面，提供了一种预防或人乙肝病毒感染的相关疾病或病症的方法，包括给药受试者权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
[0058]
本发明的第六方面，提供了一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者本发明所述的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中，该制品或药盒进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或乙肝病毒感染的其它药物。在一个优选实施方案中，所述其它药物为核苷类抗病毒药物、干扰素或核酸类药物。
[0059]
合适的容器包括例如安瓿、针剂药水瓶、注射器等。容器可由多种物质(如玻璃或塑料) 形成，容器盛有或容纳对于由小的组合物并且可以具有无菌接入端(例如该容器可以是静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶)。组合物中的至少一种活剂是本发明抗体或抗原结合片段。标签或药品说明书表明该组合物在关于抗体和提供的任何其它药物的用药量的间隔时间的具体指导下被用于遭受代谢相关的疾病、病症或症状的个体的代谢相关疾病、病症或症状。该制品还可以包括第二容器、所述第二容器包含药用稀释缓冲液、加注射用抑菌水、磷酸盐缓冲液、ringer氏溶液和葡萄糖溶液。该制品还可以包括从商业和使用者角度看是需要的其它物质，包括其它缓冲、稀释剂、过滤器、针头和注射器。使用“药品说明书”通常包括在产品的商业包装中的说明书，其包含关于指示、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其它产品和/或关于使用这些产品的警告等的信息。
[0060]
制品还可以包括其它组分，制品的每种组分可以包装在单个容器内并且可以将所有多个容器放置在单个包装内。
[0061]
发明详述
[0062]
1.定义：
[0063]
本文所述“抗体”由四条肽链即由二硫键互联的两条重链(h)和两条轻链(l)组成的免疫球蛋白分子，每条重链包含重链可变区(hvr或vh)和重链恒定区，重链恒定区包含 ch1、ch2和ch3三个结构域，每条轻链包括轻链可变区(lvr或vl)和轻链恒定区，轻链恒定区包含一个结构域(cl1)，vh和vl区可进一步分成被称为互补决定区(cdr)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(fr)的区域，每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按下列次序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、 fr4。本文中，重链恒定区可选自igg1、igg2、igg3或igg4，优选igg4，而轻链恒定区选自κ或λ。
[0064]
术语“可变区”在本文中用于描述抗体的某些部分在抗体序列间有差异且涉及特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的区域。然而，变异性通常不是均匀分布于抗体的整个可变区的。它典型的集中于轻链和重链可变区中称作互补决定区(cdr)或高变区的三个区段。可变区中相对比较保守的部分称作框架区(fr)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个fr，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个 cdr连接。每条链中的cdr通过fr非常接近的保持在一起，并与另一条链的cdr一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出
多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
[0065]
术语“互补决定区”、“高变区”和“cdr”指抗体轻链或重链的可变区中存在的高变区或互补决定区(cdr)的一个或多个(参见，kabat，e.a.等人， sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.，(1987))。这些术语包括kabat等人定义的高变区(“sequences ofproteinsofimmunologicalinterest，”kabate.，等人，usdept.ofhealth andhumanservices，1983)或抗体三维结构中的高变环(chothia和lesk， j mol.biol.196901-917(1987))。每条链中的cdr通过构架区保持紧密靠近，并且与来自其它链的cdr一起促进抗原结合位点的形成。
[0066]
术语“构架区”和“fr”指抗体轻链和重链的可变区内构架区的一个或多个(参见，kabat， e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，nationalinstitutesofhealth，bethesda， md.，(1987))。这些术语包括抗体轻链和重链中位于氨基末端和第一cdr之间的那些氨基酸序列，介于cdr之间的那些以及第三cdr和恒定区起点之间的那些氨基酸序列。
[0067]
cdr和fr残基可以根据标准序列定义(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinteres,nationalinstitutesofhealth，bethesdamd.(1987))和结构定义 (chothia和lesk，j.mot.biol.196：901-217(1987))来确定。
[0068]
在本发明中，所述cdr和fr根据immunogenetics(imgt)编号系统(参见,例如, lefranc m.p.the imgt unique numbering for immunoglobulins,t-cell receptors,and ig-likedomains.the immunologist 7,132-136,1999(1999)))进行确定。
[0069]
抗体对抗原或表位的“亲和力”是本领域很好理解的术语，并且表示抗体对表位结合的程度或强度。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(kd 或kd，它可以被定义为抗体的解离速率与结合速率的比率，即，k
off
/k
on
)、表观平衡解离常数(kd
′
或kd
′
)和ic50(实现竞争测定中50％抑制所需的量)；人源化抗体的相对亲和力也可以通过与例如相关的鼠或嵌合抗体比较来确定。对于本发明目的而言，亲和力是结合抗原或表位的具体抗体体的平均亲和力。抗体的亲和力可以使用酶联免疫吸附测定(elisa)或荧光激活的细胞分选(facs)测定来测量，本文实施例采用了elisa方法测定本发明抗体与il-4r 的亲和力，参见实施例所述。
[0070]
2.本发明抗体的制备方法
[0071]
本发明抗体可以通过任何可用的方法生产，例如重组表达技术。编码与恒定区可操作连接的轻链和重链可变区的核酸可以被插入表达载体。轻链和重链可以在相同或不同表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的dna区段可以被可操作连接至确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结合的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。在一个实施方案中，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的原核启动子系统。一旦载体被引入适当的宿主，宿主被保持在适合高水平表达核苷酸序列和收集并纯化抗体的条件下。
[0072]
表达载体可以是在任何宿主生物体中可复制的，作为附加体或作为宿主染体dna的整合部分。在一个实施方案中，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测经预期dna序列转化的那些细胞。
[0073]
表达载体可用于从任何宿主细胞表达本发明的抗体，包括原核宿主细胞(例如大
肠杆菌)、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、植物宿主细胞和昆虫宿主细胞。
[0074]
在一个实施方案中，使用大肠杆菌生产本发明抗体。适合这种应用的其他原核宿主包括杆菌，例如芽孢杆菌和其他肠杆菌科，例如沙门氏菌属、赛氏杆菌属和各种假单胞杆菌种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，该表达载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数目的多种公知启动子，例如乳糖启动子系统、氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常任选地与操纵子序列一起控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。
[0075]
其他微生物例如酵母也可用于表达本发明抗体。例如，酵母菌属可用作酵母宿主，具有含有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列及所需其他序列的适合启动子。用于酵母表达技术的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶启动子。可诱导的酵母启动子包括但不限于来自醇脱氢酶、异细胞素c和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
[0076]
在另一个实施方案中，哺乳动物组织细胞培养物可用于表达和生产本发明抗体。任何哺乳动物组织细胞可以用于此类方法，并且本领域已经开发了能够分泌异源蛋白(例如完整免疫球蛋白)的许多适合的宿主细胞系，包括哺乳动物bhk或cho细胞系、各种cos细胞系、 hela细胞系、优选骨髓瘤细胞系或转化的b细胞或杂交瘤。在一个实施方案中，细胞是非人的。哺乳动物细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必要的加工信号位点，例如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。在一个实施方案中，表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
[0077]
含有感兴趣的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可以通过公知方法转移至宿主细胞，所述方法根据细胞宿主类型而改变。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物弹道术或病毒转染可以用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了生产转基因动物，转基因可以被显微注射入受精卵，或者可以被引入胚胎干细胞基因组，此类细胞的核被转移入去核卵母细胞。
[0078]
当编码重链和轻链的核酸分子被克隆入单独表达载体时，该载体可以被共转染以获得表达并组装完整免疫球蛋白。一经表达，完整抗体、其二聚体、单个的轻链和重链、或抗体的其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱谱、 hplc纯化、凝胶电泳等。至少约90至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白可以被制备用于药物用途。在另一个实施方案中，至少约98至99％或更高同质性的基本上纯的人源化抗体可以被生产用于药物配制和方法。
[0079]
因此，本发明提供了表达本发明抗体的方法，包括：(a)用编码本文所述抗体的核酸分子转化宿主细胞，和(b)在允许表达该抗体的条件下培养转化的宿主细胞。可以使用在载体上包括选择标记的已知技术，使得表达所述抗体的所述标记的宿主细胞可以容易被选择。
[0080]
所述抗体的“抗原结合片段”或称为抗体的“抗原结合部分”指抗体保留了与抗原(如 hbsag)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明，抗体的抗原结合功能可由全长
抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合片段”的实例包括但不限于：(i)fab片段，即由vl、 vh、cl1和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，即由铰链区的二硫键连接的两个f(ab’)片段组成的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂vl和vh结构域组成的fv片段；(v)由vh结构域组成的dab片段；以及(vi) cdr。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh是由不同的基因编码，但它们可通过重组方法，由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fv，scfv)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合片段”范围内。
[0081]
可以通过这样一种方法制备本发明所述抗体，该方法包括在允许抗体表达的条件下，培养含有编码该抗体的dna序列并能表达该抗体的宿主细胞，然后从培养物中回收产生的抗体。
[0082]
用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的符合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由该细胞产生的多肽，这些方法包括通过离心或过滤而从培养基中分离宿主细胞，用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行纯化。
[0083]
3.方法和药剂
[0084]
本发明提供了包含本发明的结合人hbsag抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物将与适当的载体、赋形剂以及其它制剂一起施用。这些制剂纳入配方是为了改善递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典：雷氏药学大全 (remington
′
s pharmaceutical sciences,mack publishing company，easton，pa)中可到大量适当的配方。
[0085]
给药剂量随受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而调整。当本发明的抗体用来成人的各种与乙肝病毒感染相关的病症和疾病时，可采用静脉给药本发明抗体，通常单剂按每公斤体重计约0.01至约20mg/kg给药，更优选的是约0.1至约15、约1 至约10，或约3至约10mg/kg体重。根据病症的严重性，可对的频度和持续时间进行调整。
[0086]
已知有各种药物递送系统可用来施用本发明的药物组合物，例如包在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化，能够表达变异病毒的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参阅如wu等人 (1987)，j.biol.chem.262：4429-4432)。给予药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜，和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用，如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可与其它生物活剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。
[0087]
该药物组合物也可通过液囊递送，尤其是通过脂质体液囊递送(参阅langer(1990) science249：1527-1533；treat等人(1989) in liposomes in the therapy of infectious disease and cancer，lopez berestein and fidler(编著)， liss，new york,第353-365页；lopez-berestein，同上，第317-327页)。
[0088]
在某些情况下，该药物组合物可以受控释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(参阅langer，如上；sefton(1987)crc crit.ref.biomed.eng.14：201)。在另一个实施方
案中，可采用聚合物材料(参阅medical applications of controlled release，langer and wise(编著)， crc pres.，boca raton，florida(1974)。关于其它受控释放系统的讨论见 langer(1990)science249：1527-1533。
[0089]
注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可用已公开的方法制备。例如，注射制剂可通过将抗体或其盐溶于、悬浮于或乳化于惯常用于注射的无菌水介质或油介质的方式来制备。用于注射的水性介质有，例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等。它们可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[如聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔) 加成物)等结合使用。所用的油介质有，如芝麻油、大豆油等。它们可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂最好封装在适当的安瓿瓶中。
[0090]
单一和联合本发明的抗体和抗体片段对于可通过降低乙肝病毒表面抗原的载量而得到改善。
[0091]
本发明涵盖联合，其中hbsag抗体或抗体片段与一种或多种药剂(或称第二种药剂)联合施用。共同给药和联合并不限于同时给药，而是还包括在涉及给予患者至少一种其它药剂的疗程中至少给予一次抗hbsag抗体或抗体片段的方案。第二种药剂可能为另一种hbv药物，如另一种抗体/抗体片段，或可溶的细胞因子受体 (如干扰素、细胞介素、胸腺法新等)、核苷类似物(替诺福韦、恩替卡韦、阿德福韦等)。
[0092]
本发明还包括本文所述的任何抗hbsag抗体或抗原结合片段在制备疾病或症状的药物中的应用，其中的疾病或症状是通过降低人体内hbsag水平而得到改善。
[0093]
本发明的一方面，提供了一种药物组合物，其包括本发明与人hbsag结合的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
[0094]
本发明也可以是一种抗体缀合物，所述缀合物还包含佐剂部分，所述抗体和佐剂通过连接子相接，所述佐剂优选是引起免疫应答的化合物，如可以是tlr激动剂。
[0095]
在本文中，如无矛盾或特别说明，药物、药物组合物和药物制剂(药剂)可以互换使用。在本文中，药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；载体、溶剂，如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，本发明的药物组合物优选为注射剂。
[0096]
在本发明的一些实施方案中，本发明药物组合物中的抗体或其抗原结合片段以1mg/ml 至1000mg/ml的浓度存在，优选以10mg/ml至1000mg/ml的浓度存在，更优选以50mg/ml 至500mg/ml的浓度存在，更优选以100mg/ml至300mg/ml的浓度存在。
[0097]
本发明的药物组合物优选具有3.0至9.0的ph。其中，可进一步包含缓冲系统、防腐剂、表面张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物是含水制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮。本发明的具体实施方案中，该药物组合物是稳定的含水溶液。在本发明的另一个具体实施方案中中，该药物组合物是一种冻干制剂，在使用前医师或患者加入溶剂和/或稀释液溶解所述冻干制剂。
附图说明
[0098]
图1为hbv转基因小鼠给予本发明乙肝抗体后的血清hbv dna水平。
[0099]
图2为hbv转基因小鼠给予本发明乙肝抗体后的血清hbsag水平。
具体实施方式
[0100]
实施例1：hbsag抗体表达载体的构建
[0101]
kw027-047表达载体构建
[0102]
将hindiii酶切位点(aagctt)、kozak序列(gccgccacc)、信号肽基因 atggagagagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactgg t和乙肝抗体重链编码基因(包括seq id no：4所示氨基酸的hvr编码基因和人源恒定区 igg1(氨基酸序列如seq id no:19所示)编码基因)、终止码taataataa和ecori编码基因gaatcc依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过ecori和hindiii 位点，将上述片段插入真核表达质粒pcdna 3.1(+)(购自invitrogen corportation，货号v790-20)中并测序验证，得到用于hbsag抗体重链的表达质粒pcdna3.1(+)-dh。
[0103]
将hindiii酶切位点(aagctt)、kozak序列(gccgccacc)、信号肽基因 atggagagagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactgg t和hbsag轻链编码基因(包括seq id no：19所示氨基酸序列的lvr编码基因和人源恒定区κ(氨基酸序列如seq id no:23所示)编码基因)、终止码taataataa和ecori编码基因gaatcc依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过ecori和hindiii 位点，将上述片段插入真核表达质粒pcdna 3.1(+)中并测序验证，得到用于抗体轻链的表达质粒pcdna3.1(+)-dl。
[0104]
以上述方法依次构建kw027-048、kw027-050、kw027-051、kw027-052、kw027-053、 kw027-054、kw027-055、kw027-056、kw027-058、kw027-059、kw027-060、kw027-061 的表达载体。同样相似的方法，将编码鼠igg1基因替换人源igg1编码基因，其它均相同，可以制备得到kw027-048、kw027-050、kw027-051、kw027-052、kw027-053、kw027-054、 kw027-055、kw027-056、kw027-058、kw027-059、kw027-060、kw027-061、kw027-070、 kw027-070的表达载体。
[0105]
实施例2：抗hbsag抗体的表达和纯化
[0106]
使用实施例1所述dna构建体，通过真核表达细胞freestyle
tm 293-f cells(invitrogen corporation,r790-07)表达目的抗体。按照freestyle
tm 293expressionsystem操作手册，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x106个/毫升。在质粒转染当天，将质粒按照下表组合，与转染试剂混合后加入细胞培养基中。37℃，8％co2持续培养5-7天后，收集细胞培养上清进行抗体纯化。
[0107]
表达上清用0.22μm滤膜过滤，利用mabpurix亲和层析柱(购自sepax公司，65008)从表达上清中捕获表达抗体，用平衡缓冲液(120mm tris+100mm nacl,ph7.5)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(0.15m冰醋酸，ph2.8)洗脱。纯化后的抗体进行sds page、 sec检测，纯度在95％以上。
[0108]
实施例3：抗原结合亲和力测定
[0109]
该实施例中使用抗体为全人源化抗体。
[0110]
使用20μg/ml的重组hbsag蛋白(购自prospec-tany technogene ltd.)包被酶标
板，100μl/ 孔，贴封板膜，放置于4℃过夜。使用洗涤液pbst(0.5
‰
吐温的pbs)洗板3次，使用洗涤液制备10％牛血清白蛋白溶液进行封闭，以200μl/孔加至酶标板内，置于37℃2小时。使用洗涤液pbst(0.5
‰
吐温的pbs)洗板3次，以100μl/孔加入梯度稀释的待测抗体并设置系统空白对照，置于37℃2小时。使用洗涤液pbst(0.5
‰
吐温的pbs)洗板3次，加入二抗(1:10000 稀释，jackson immunoresearch)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃孵育1小时。最后，使用洗涤液pbst(0.5
‰
吐温的pbs)洗板5次，以100μl/孔加入tmb显液，置室温避光反应分钟，加入等体积终止液终止显反应。使用酶标仪在波长450mn处测定吸光度。结果见表2，结果表明，实施例2中所获得抗体，均能与重组hbsag蛋白有效结合，稀释浓度单位为μg/ml。
[0111]
表2本发明各抗体与hbsag的结合活性
[0112][0113]
070和073号抗体在稀释浓度为0.16时，与hbsag的结合活性的od值分别为0.152和0.114。
[0114]
实施例4：体内药效学研究
[0115]
本实验中，抗体的恒定区选用用鼠源igg1。
[0116]
动物
[0117]
雄性c57bl/6小鼠，5周龄，无特定病原体，购于上海斯莱克实验动物有限公司，并饲养于独立通风笼盒中。小鼠的饲养及使用按照药明康德iacuc批准的实验方案(iacuc#: id01-013-2020v1.0)。小鼠度过4天的环境适应期后注射aav/hbv病毒。
[0118]
溶剂：pbs。
[0119]
受试化合物：kw027-047，kw027-048，kw027-050，kw027-051，kw027-052，kw027-053， kw027-054，kw027-055，kw027-056，kw027-058，kw027-059，kw027-060，kw027-061，给药浓度为1.2mg/ml。
[0120]
重组raav8-1.3hbv
[0121]
raav8-1.3hbv(d型，ayw)由药明康德提供，批号为awy1-p4-200102，1
×
10
12
viral genome (v.g.)/ml。实验前用无菌pbs稀释至5
×
10
11
v.g./ml。每只小鼠注射200μl，即每只小鼠注射 1
×
10
11
v.g.。
[0122]
试验方法
[0123]
aav/hbv小鼠模型建立
[0124]
aav/hbv注射.raav8-1.3hbv在注射前预先用无菌pbs配制成浓度为1
×
10
11
v.g./200μl溶液。64只小鼠经尾静脉注射200μl raav8-1.3hbv溶液。
[0125]
分组前采血.病毒注射后第14、21和35天，所有感染的小鼠通过颌下静脉采血～100μl用于收集血浆。收集的血样用k
2-edta抗凝，在4℃，7000g/min条件下离心10分钟并收
集血浆。血浆通过qpcr检测hbvdna，通过elisa检测hbsag。血浆样本保存于-80℃直到送至药明康德生物部体外实验室检测相关项目。
[0126]
第一次给药记为第0天，感染后第45天即第0天。根据病毒注射后第14、21和35天采集的血浆hbvdna和hbsag水平对小鼠进行分组，从64只小鼠中挑选43只正式实验用的小鼠，随机分为十四组，标记为第一组到第十四组，第一组小鼠数量为4，其余组小鼠数量为3。所有小鼠通过尾静脉注射pbs或测试抗体，12mpk，给药一次。所有小鼠给药前称量体重。
[0127]
采血
[0128]
给药后第-1、1、3、5、7、10、14和17天，所有小鼠通过颌下静脉采血，收集血浆，用于检测hbvdna和hbsag。
[0129]
实验终点.测试部分：给药后第22天测试组所有小鼠安乐死。
[0130]
体重记录.体内实验过程中，每天观察小鼠状态，并在感染当天，给药和采血当天记录小鼠体重。
[0131]
样品保存和转移.所有血浆样品置于-80℃保存，并用干冰转移至药明康德生物部体外实验室进行相应检测。
[0132]
定量pcr检测小鼠血浆中hbvdna含量.提取血浆中dna，实验步骤参照qiaamp96dnabloodkit说明书。定量pcr检测小鼠血浆中hbvdna的含量。方法简述如下：
[0133]
配制qpcr反应混合液(taqmanuniversalmastermix(2x))，加入样品和标准品，进行pcr反应。反应条件：95℃，10分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。
[0134]
elisa检测小鼠血浆中hbsag的含量.实验步骤参照hbsagelisa(安图生物，cl0310)试剂盒说明书。方法简述如下：将血浆样品稀释2、10、20或600倍，加入包被板中，与酶结合物共同溫育(37℃，60分钟)，重复洗板5次，加入发光底物，室温避光反应10分钟，用酶标仪检测发光强度。
[0135]
受试抗体kw027-047、kw027-048、kw027-050、kw027-051、kw027-052、kw027-053、kw027-054、kw027-055、kw027-0056、kw027-058、kw027-059、kw027-060、kw061在aav/hbv小鼠模型中对hbv复制的抑制活性通过检测小鼠血浆中hbvdna含量和hbsag的表达来进行评价结果如图1及图2。
[0136]
血浆中hbvdna含量表明(如图1)：
[0137]
与溶剂组相比，组group2(kw027-047，12mpk)小鼠血浆hbvdna在kw027-047给药后第1天即显著降低，平均降低1.69log
10
copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第14天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbvdna为5.64log
10
copy/μl。
[0138]
与溶剂组相比，组group3(kw027-047，12mpk)小鼠血浆hbvdna在kw027-048给药后第1天即显著降低，平均降低0.68log
10
copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第7天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbvdna为5.41log
10
copy/μl。
[0139]
与溶剂组相比，组group4(kw027-035m，12mpk)小鼠血浆hbvdna在kw027-050给药后第1天即显著降低，平均降低1.25log
10
copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第7天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbvdna为5.50log
10
copy/μl。
[0140]
与溶剂组相比，组group5(kw027-037m，12mpk)小鼠血浆hbvdna在kw027-051给药后第1天即显著降低，平均降低0.41log
10
copy/μl(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbvdna为5.56log
10
copy/μl。
[0141]
与溶剂组相比，组group 6(kw027-052，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-052 给药后第1天即显著降低，平均降低2.01log
10 copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.51log
10 copy/μl。
[0142]
与溶剂组相比，组group 7(kw027-072m-2，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-053 给药后第1天即显著降低，平均降低0.67log
10 copy/μl(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.62log
10 copy/μl。
[0143]
与溶剂组相比，组group 8(kw027-072m-3，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-54 给药后第1天即显著降低，平均降低2.78log
10 copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第5天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.32log
10 copy/μl。
[0144]
与溶剂组相比，组group 9(kw027-079m-2，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-55 给药后第1天即显著降低，平均降低2.06log
10 copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第5天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.45log
10 copy/μl。
[0145]
与溶剂组相比，组group 10(kw027-079m-3，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-56 给药后第1天即显著降低，平均降低2.81log
10 copy/μl(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.53log
10 copy/μl。
[0146]
与溶剂组相比，组group 11(kw027-083m-2，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-58 给药后第1天即显著降低，平均降低0.88log
10 copy/μl(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.38log
10 copy/μl。
[0147]
与溶剂组相比，组group 12(kw027-068m-2，12mpk)小鼠血浆hbv dna在 kw027-059给药后第1天即显著降低，平均降低0.60log
10 copy/μl(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.42log
10 copy/μl。
[0148]
与溶剂组相比，组group 13(kw027-068m-3，12mpk)小鼠血浆hbv dna在kw027-60 给药后第1天即显著降低，平均降低0.56log
10 copy/μl(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbv dna为5.62log
10 copy/μl。
[0149]
组group14(kw027-061，12mpk)第0天给药后2只小鼠死亡，无数据分析。
[0150]
血浆中hbsag水平表明(见图2)
[0151]
溶剂组(group 1)小鼠血浆hbsag含量在实验中保持相对稳定，在4.65
–
5.27log
10 iu/ml 间波动(波动不超过0.62log
10 iu/ml)。
[0152]
与溶剂组相比，组group 2(kw027-047，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-047 给药后第1天即显著降低，平均降低1.73log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第14天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.80log
10 iu/ml。
[0153]
与溶剂组相比，组group 2(kw027-048，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-048 给药后第1天即显著降低，平均降低0.93log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第7天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.80log
10 iu/ml。
[0154]
与溶剂组相比，组group 4(kw027-050，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-050 给药后第1天即显著降低，平均降低1.81log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第5天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为5.00log
10 iu/ml。
[0155]
与溶剂组相比，组group 5(kw027-051，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-051 给药后第1天即显著降低，平均降低0.67log
10 iu/ml(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此
时小鼠血浆hbsag为5.06log
10 iu/ml。
[0156]
与溶剂组相比，组group 6(kw027-052，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-052 给药后第1天即显著降低，平均降低1.99log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.85log
10 iu/ml。
[0157]
与溶剂组相比，组group 7(kw027-053，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-053 给药后第1天即显著降低，平均降低0.86log
10 iu/ml(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为5.02log
10 iu/ml。
[0158]
与溶剂组相比，组group 8(kw027-054，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-054 给药后第1天即显著降低，平均降低2.62log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第5天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为5.03log
10 iu/ml。
[0159]
与溶剂组相比，组group 9(kw027-055，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-055 给药后第1天即显著降低，平均降低1.89log
10 iu/ml(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为5.01log
10 iu/ml。
[0160]
与溶剂组相比，组group 10(kw027-056，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-056 给药后第1天即显著降低，平均降低2.40log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.96log
10 iu/ml。
[0161]
与溶剂组相比，组group 11(kw027-058，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-058 给药后第1天即显著降低，平均降低1.21log
10 iu/ml(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.98log
10 iu/ml。
[0162]
与溶剂组相比，组group 12(kw027-059，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-059 给药后第1天即显著降低，平均降低1.12log
10 iu/ml(p《0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为5.03log
10 iu/ml。
[0163]
与溶剂组相比，组group 13(kw027-060，12mpk)小鼠血浆hbsag在kw027-060 给药后第1天即显著降低，平均降低0.84log
10 iu/ml(p《0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第7天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆hbsag为4.89log
10 iu/ml。
技术特征：
1.一种与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)序列和轻链可变区(vl)序列，所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(cdr)氨基酸序列：hcdr1:x1x2x3x4x5x6x7x8x9x10，hcdr2：x11x12x13x14x15x16x17t，hcdr3：ax20x21x22x23x24x25x26x27x28x29x30x31x32dx34；氨基酸序列为qdisny(seq id no:35)的cdr1(lcdr1)；氨基酸序列为aas(seq id no:36)的cdr2(lcdr2)；和氨基酸序列为qqsynipt(seq id no:37)的cdr3(lcdr3)；其中x选自任意一种氨基酸。2.根据权利要求1所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中：hcdr1中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10依次选自下述的任一种组合：g、g、s、i、n、r、g、g、y、y；g、g、s、s、缺失、缺失、n、g、y、y；g、y、s、f、a、缺失、缺失、n、y、g；g、y、r、f、t、缺失、缺失、s、n、g；g、g、s、v、l、缺失、缺失、s、y、f；g、g、y、l、s、缺失、缺失、n、y、a；g、y、t、f、t、s、缺失、缺失、s、y、a；k、v、t、f、s、缺失、缺失、n、y、a；g、f、t、f、s、缺失、缺失、s、y、p；g、y、t、f、t、缺失、缺失、s、y、a；g、y、t、f、t、缺失、缺失、d、y、g；g、y、t、f、t、缺失、缺失、k、y、t；g、g、s、i、s、缺失、缺失、g、y、h；g、y、t、f、t、缺失、缺失、g、y、y；hcdr2中x11、x12、x13、x14、x15、x16、x17依次选自下述的任一种组合：i、y、h、s、g、缺失、s；i、h、y、r、g、缺失、s；i、s、s、y、n、g、q；i、s、t、y、k、g、n；v、h、t、n、g、缺失、d；i、s、a、y、n、g、n；i、n、t、g、n、d、t；i、s、g、s、g、g、s；i、n、a、a、n、g、d；i、n、a、g、n、g、n；i、n、p、n、s、g、g；i、n、p、y、t、g、a；i、s、y、s、g、缺失、s；i、n、p、n、s、g、n；hcdr3中x20、x21、x22、x23、x24、x25、x26、x27、x28、x29、x30、x31、x32、x34依次选自下述的任一种组合：r、g、p、s、a、v、缺失、缺失、缺失、t、f、p、f、y；r、g、l、n、g、g、缺失、缺失、缺失、t、y、a、f、i；r、g、l、s、d、y、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、d、r、g、g、s、g、s、缺失、缺失、y、a、f、i；r、g、l、n、g、g、缺失、缺失、缺失、t、y、a、f、i；r、d、g、g、s、y、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、d、d、s、s、g、缺失、缺失、缺失、w、y、y、m、v；k、a、d、p、y、y、缺失、缺失、缺失、y、y、g、m、v；r、a、g、r、y、y、缺失、缺失、缺失、y、y、g、m、v；s、q、r、p、d、缺失、缺失、y、y、y、g、m、v；r、h、r、d、y、a、缺失、缺失、缺失、a、y、a、m、v；r、g、d、y、d、s、l、t、缺失、缺失、y、a、f、i。3.根据权利要求1所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、x12、x13、x14、x15、x16、x17、x20、x21、x22、x23、x24、x25、x26、x27、x28、x29、x30、x31、x32、x34依次选自下表中的任一种组合，
4.根据权利要求1-3中任意一权利要求所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体在各cdr区的两侧还包含框架区。5.根据权利要求1-4中任意一权利要求所述的与人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中vh序列选自：seq id no：4-18；vl序列选自：seq id no：19、20或21。6.根据权利要求1-5中任意权利要求所述的人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述hvr的恒定区选自igg系列，如igg1、igg2、igg3或igg4，优选igg1，或者其变体；所述lvr的恒定区选自κ或λ链，优选κ链。7.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-6中任一所述的人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。8.包含权利要求1-6中任意一权利要求所述抗体的抗体缀合物。9.包含权利要求1-6中任意一权利要求所述人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段的组合物。10.权利要求1-6中任一项所述的人乙肝表面抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或人体乙肝病毒感染的疾病或病症。11.一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有权利要求1-6中任意
一权利要求所述抗体或其抗原结合片段、或者权利要求6所述缀合物、或者权利要求9所述的药物组合物。
技术总结
本发明涉及乙肝用抗体。本发明属于抗体技术领域，提供了一种与人表面抗原(HBsAg)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物及其用途。另外，本发明还提供了编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。体的方法。
