一种基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的方法和装置
1.本发明涉及了土壤养分检测技术领域的一种检测土壤无机态氮的方法和装置，尤其涉及一种基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的方法和装置。
背景技术：
2.拉曼光谱源于印度物理学家拉曼在1928年发现的光非弹性散射效应。其基本原理是分子在单光照射下，极化率发生变化，产生诱导偶极矩，引发拉曼活性振动或转动，导致能量交换，从而产生与入射光波长和频率均不同的拉曼散射光。拉曼散射分为频率变小的斯托克斯散射和频率变大的反斯托克斯散射。而瑞利散射的分子散射波长和频率不变。拉曼散射和瑞利散射的频率之差，即拉曼频移raman shift，也可表示为波数，被用于分子的表征与分析。随着技术不断发展，引入纳米颗粒等基底材料的表面增强拉曼光谱sers。它因具有较高的灵敏度和选择性，在化学生物传感等领域被广泛应用。sers将目标分子吸附在粗糙金属纳米颗粒的表面上，通过等离子体介导的电场放大或化学增强效应来对微量或痕量的目标待测物进行指纹图谱识别。
3.土壤是地球陆地上能供值物生长与繁殖的疏松表层。作为地球生态系统的重要组成部分，土壤处于大气圈、岩石圈、水圈和生物圈的交接过渡带，是结合陆地环境各要素的枢纽。土壤具有肥力，是地表物质循环和能量转化非常活跃的场所，也是连接无机界和有机界的中心环节，能够为植物的生长供应和协调养分、水分、空气及热量。其中，氮素是土壤肥力中最活跃的因素之一，是植物生长需求量较大的营养元素，氮素水平的高低将直接影响到植物的生长发育和新陈代谢。土壤中的氮素分为无机态氮和有机态氮两大类。目前发现植物吸收的氮主要为铵态氮和硝态氮这两种无机态氮。氰胺态氮和酰胺态氮等其他形态的氮通常需要转化为铵态氮和硝态氮以后才能被作物吸收利用。为了满足作物生长需要，提高粮食产量，通常需要额外施加氮肥。但当氮肥不足时，植株矮小，叶片发黄，品质下降，花果减少，容易早衰；而氮肥过量时，作物的抗逆能力下降，易感病虫害与遭受冻害，并且叶片过于肥大，影响整体通风透光，降低有机物积累，同时加剧土壤酸化或盐碱化。于是需要测土配方施肥，提高肥料利用率，精准定位施肥，减少资源浪费，降低环境污染。土壤无机态氮测定的传统方法包括酚二磺酸比法、靛酚蓝比法、碱解扩散法、碱解蒸馏法、离子交换树脂法和连续流动分析法等，均涉及到严密的化学实验处理流程，费时费力，不利用农民在实际生产种植和田间管理中的运用。高效液相谱-质谱联用、x射线荧光光谱法和毛细管电泳法等其他方法虽然检测准确性和灵敏度高，但是检测仪器昂贵，维护成本高，检测时间长，难以满足大规模实时在线快速检测的要求。
技术实现要素：
4.为解决上述问题，本发明提供了一种基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的方法，能够实现土壤无机态氮的快捷精准检测，为实时定位反映土壤氮素肥力提供解决方案，为科学合理施肥提供参考依据。并且在该方法的基础之上设计了相应的便携式检测装置，简便
操作流程，提高系统实践指导农民田间管理的实用性。
5.本发明采用的技术方案是：
6.一、一种基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的装置
7.装置包括箱体和设置在箱体中的玻璃杯体、储废罐、电动机、搅拌器、排废管、排水管、石英玻璃瓶和拉曼检测系统；所述玻璃杯体和储废罐自上而下设置，所述电动机的机体固定安装在玻璃杯体顶部的杯盖上，所述电动机的输出轴穿过杯盖后同步连接有搅拌器，使得电动机通过自身的输出轴控制搅拌器在玻璃杯体内搅拌土壤，所述玻璃杯体的底部开设有用于安装排废管的通孔，所述排废管的入口端与玻璃杯体连通，所述排废管的出口端处设置有储废罐，且所述玻璃杯体通过排废管的出口端与储废罐连通，使得玻璃杯体中的沉淀经排废管流入储废罐，所述玻璃杯体的侧面开设有用于安装排水管的通孔，所述排水管的入口端与玻璃杯体连通，所述排水管的出口端处设置有石英玻璃瓶，且玻璃杯体通过排水管与石英玻璃瓶连通，使得玻璃杯体中的土壤上清液经排水管流入石英玻璃瓶，所述拉曼检测系统设置在石英玻璃瓶下方，且石英玻璃瓶的瓶身置于拉曼检测系统之中。
8.所述拉曼检测系统包括激光器、第一反射镜、分束器、第二反射镜、透镜、第三反射镜、瑞利散射滤光片、衍射光栅和ccd探测器；所述第一反射镜、分束器、第二反射镜、透镜、第三反射镜、瑞利散射滤光片、衍射光栅和ccd探测器依次顺序布置；所述激光器发射的激光经第一反射镜反射到分束器，激光透射过分束器后经第二反射镜反射到透镜，激光透射过透镜后经石英玻璃瓶侧面穿透过石英玻璃瓶，激光穿透过石英玻璃瓶后经第三反射镜反射再依次透射过石英玻璃瓶和透镜后入射到分束器，激光透射过分束器后再依次经瑞利散射滤光片、衍射光栅入射到ccd探测器中。
9.所述排水管的出口端处设置有滤膜，且石英玻璃瓶的瓶口处设置有液面探针。
10.优选的，排废管和排水管的入口端都设置有阀门。
11.所述装置还包括电脑、移动电源和操作控制台；所述拉曼检测系统的ccd探测器与电脑进行信号连接；所述电动机与操作控制台电连接，使得操作控制台通过电动机控制搅拌器搅拌土壤，所述操作控制台上设置有用于控制电源的开关、用于控制操作控制台的功率旋钮及控制箱体开合的按扣，所述移动电源设置在箱体内电脑的下方。
12.二、一种基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的方法
13.方法主要包括以下过程：
14.1.1.打开装置的箱体后，先打开玻璃杯体的杯盖，将土壤与纯净水按1：5的质量比混合加入玻璃杯体或者将土壤、纯净水和胶体按40：200：1～3的质量比混合加入玻璃杯体，然后盖上杯盖，启动电动机控制搅拌器将玻璃杯体内的土壤搅拌成粉末，使得土壤与纯净水或者土壤与胶体充分混合形成混合物，此时排废管的第一阀门和排水管的第二阀门均处于关闭状态；
15.1.2.启动拉曼检测系统，控制激光器激发出激光，且激光透射过的石英玻璃瓶内未装有土壤上清液，激光最终被ccd探测器接收获得拉曼光谱，ccd探测器将采集到的拉曼光谱传输到电脑，完成对拉曼检测系统的校正；
16.1.3.待玻璃杯体内的混合物静置分层形成土壤上清液和沉淀后，先打开排水管入口端的第二阀门，使得土壤上清液进入排水管后通过滤膜过滤流入石英玻璃瓶中；待流入石英玻璃瓶中的土壤上清液碰触到石英玻璃瓶瓶口处液面探针的底部时，操作控制台自动
关闭排水管的第二阀门；
17.1.4.重新启动激光器激发出激光，且激光透射过的石英玻璃瓶内装有土壤上清液，透射过装有土壤上清液的石英玻璃瓶的激光最终被ccd探测器接收获得待检测拉曼光谱，ccd探测器将采集到的待检测拉曼光谱传输到电脑，电脑对待检测拉曼光谱中波数在400-2000cm-1
范围内的拉曼光谱的光谱数据集采用粒子优化的最小二乘支持向量机模型拟合计算得出土壤无机态氮的浓度，所述光谱数据集d具体为：
[0018][0019]
式中，i为某一种土壤样本的个数；yi为第i个土壤样本的上清液在400-2000cm-1
的波数范围内的拉曼散射强度矩阵；xi为第i个土壤样本中无机态氮的浓度；
[0020]
1.5.拉曼光谱采集结束后，打开排废管入口端的第一阀门，使得玻璃杯体里剩余的沉淀及土壤上清液通过排废管流入储废罐。
[0021]
优选的，所述胶体为银胶或者金胶。
[0022]
所述无机态氮包括土壤铵态氮和土壤硝态氮，土壤铵态氮和土壤硝态氮均采用质量百分比的计算方式，单位为wt％，具体计算公式为：
[0023][0024][0025]
其中，ch为土壤铵态氮的浓度，co为土壤硝态氮的浓度，nh所添加铵态氮肥中的氮素含量，no为所添加硝态氮肥中的氮素含量，sh为土壤中已有的铵态氮含量，so为土壤中已有的硝态氮含量，mh为添加的铵态氮肥质量，mo为添加的硝态氮肥质量，ms为土壤质量。
[0026]
本发明的有益效果是：
[0027]
市面上常见的铵态氮肥和硝态氮肥易溶于水，氮肥会被溶解在土壤溶液中。作物的根也主要是吸取溶解在土壤溶液中的氮素，因此本发明采用水溶土壤，直接检测水溶土壤中可被植物吸收的无机态氮含量。拉曼光谱能对土壤氮素的化学键产生共振响应，其特异性吸收光谱带能够过滤掉其他易溶杂质信息，从而避免土壤固态压片检测时背景复杂、精度较低等问题。本发明采用拉曼光谱仪液相检测方法不易受水干扰，且对无机态氮具有良好的浓度响应，具有高灵敏和高稳定的特点。
[0028]
本检测装置，实现制样、测定的一体化设计，操作简单，携带便利，为实时在线原位快速检测土壤无机态氮提供有力支持。
附图说明
[0029]
图1为铵根离子的化学结构式示意图；
[0030]
图2为硝酸根离子的化学结构式示意图；
[0031]
图3为土壤铵态氮浓度一定时银胶和金胶的拉曼散射增强效果对比图；
[0032]
图4为土壤硝态氮一定时银胶和金胶的拉曼散射增强效果对比图；
[0033]
图5为不同浓度土壤铵态氮的银胶表面增强拉曼光谱图；
[0034]
图6为不同浓度的土壤硝态氮的金胶表面拉曼光谱图；
[0035]
图7为土壤铵态氮的真实值与预测值的对比图；
[0036]
图8为土壤硝态氮的真实值与预测值的对比图；
[0037]
图9为土壤无机态氮检测装置的部分剖面图；
[0038]
图10为拉曼检测系统的俯视光路图；
[0039]
图11为土壤无机态氮检测装置的主要操作步骤图。
[0040]
图中所示：1.储废罐；2.排废管；3.第一齿轮；4.第一阀门；5.搅拌器；6.玻璃杯体；7.杯盖；8.电动机；9.提手；10.电脑；11.功率旋钮；12.开关；13.操作控制台；14.按扣；15.排水管；16.滤膜；17.液面探针；18.石英玻璃瓶；19.拉曼检测系统；1901.数据线；1902.ccd探测器；1903.衍射光栅；1904.激光器；1905.第一反射镜；1906.瑞利散射滤光片；1907.分束器；1908.透镜。
具体实施方式
[0041]
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0042]
如图9所示，本装置包括箱体和设置在箱体中的玻璃杯体6、储废罐1、电动机8、搅拌器5、排废管2、排水管15、石英玻璃瓶18和拉曼检测系统19；玻璃杯体6和储废罐1自上而下设置，电动机8的机体固定安装在玻璃杯体6顶部的杯盖7上，电动机8的输出轴穿过杯盖7后同步连接有搅拌器5，使得电动机8通过自身的输出轴控制搅拌器5在玻璃杯体6内搅拌土壤，玻璃杯体6的底部开设有用于安装排废管2的通孔，排废管2的入口端与玻璃杯体6连通，排废管2的出口端处设置有储废罐1，且玻璃杯体6通过排废管2的出口端与储废罐1连通，使得玻璃杯体6中的沉淀经排废管2入口端流入排废管2后经排废管2出口端流入储废罐1，玻璃杯体6的侧面开设有用于安装排水管15的通孔，排水管15的入口端与玻璃杯体6连通，排水管15的出口端处设置有石英玻璃瓶18，且玻璃杯体6通过排水管15与石英玻璃瓶18连通，使得玻璃杯体6中的土壤上清液经排水管15入口端流入排水管15后经排水管15出口端流入石英玻璃瓶18，拉曼检测系统19设置在石英玻璃瓶18下方，且石英玻璃瓶18的瓶身置于拉曼检测系统19之中。
[0043]
如图10所示，拉曼检测系统19包括激光器1904、第一反射镜1905、分束器1907、第二反射镜、透镜1908、第三反射镜、瑞利散射滤光片1906、衍射光栅1903和ccd探测器1902；第一反射镜1905、分束器1907、第二反射镜、透镜1908、第三反射镜、瑞利散射滤光片1906、衍射光栅1903和ccd探测器1902依次顺序布置；激光器1904发射的激光经第一反射镜1905反射到分束器1907，激光透射过分束器1907后经第二反射镜反射到透镜1908，激光透射过透镜1908后经石英玻璃瓶18侧面穿透过石英玻璃瓶18，激光穿透过石英玻璃瓶18后经第三反射镜反射再依次透射过石英玻璃瓶18和透镜1908后入射到分束器1907，激光透射过分束器1907后再依次经瑞利散射滤光片1906、衍射光栅1903入射到ccd探测器1902中。
[0044]
排水管15的出口端处设置有用于过滤土壤上清液的滤膜16，且石英玻璃瓶18的瓶口处设置有用于探测石英玻璃瓶18内液面深度的液面探针17。
[0045]
优选的，排废管2和排水管15的入口端都设置有用于控制流体流通的阀门，具体为
通过摆动分别设置在排废管2和排水管15入口端且分别与排废管2的阀门和排水管15的阀门啮合连接的第一齿轮3和第二齿轮来控制阀门的开与关。
[0046]
装置还包括电脑10、移动电源和操作控制台13；拉曼检测系统19的ccd探测器1902通过数据线1901与电脑10进行信号连接，通过电脑10对ccd探测器1902采集的拉曼光谱进行处理获得土壤无机态氮浓度；电动机8与操作控制台13电连接，使得操作控制台13通过电动机8控制搅拌器5搅拌土壤，操作控制台13上设置有用于控制电源的开关12、用于控制操作控制台13的功率旋钮11及控制箱体开合的按扣14，移动电源设置在箱体内电脑10的下方，便于户外使用，电脑10含全球定位系统gps点位模块，可结合离线电子地图进行导航，电脑桌面上有控制软件，可自动控制装置的中途操作。
[0047]
优选的，装置外壳顶部还设置有用来提拉装置的提手9。
[0048]
如图11所示，基于拉曼光谱检测土壤无机态氮的方法主要包括以下过程：
[0049]
1.1.打开装置的箱体后，旋转功率旋钮11，打开操作控制台13，按照提示，先打开玻璃杯体6的杯盖7，将10g土壤与50ml纯净水混合加入玻璃杯体6，然后盖上杯盖7，启动电动机8控制搅拌器5将玻璃杯体6内的结块土壤搅拌成粉末，使得土壤与纯净水或者土壤与胶体充分混合形成混合物，以便将土壤中的无机态氮充分溶解于水中；同时设计控制软件倒计时，在一定时间后，搅拌器5自动暂停。此时排废管2的第一阀门4和排水管15的第二阀门均处于关闭状态；
[0050]
1.2.启动预热好的拉曼检测系统19，控制激光器1904激发出785nm的激光，且激光透射过的石英玻璃瓶18内未装有土壤上清液，激光最终被ccd探测器1902接收获得用于校正的拉曼光谱，ccd探测器1902将采集到的用于校正的拉曼光谱传输到电脑10，电脑10通过控制软件呈现一维谱线信息，完成对拉曼检测系统19的校正；
[0051]
1.3.待玻璃杯体6内的混合物静置分层形成土壤上清液和沉淀后，先打开排水管15入口端的第二阀门，使得土壤上清液进入排水管15后通过滤膜16过滤流入透光性好、无杂质干扰的石英玻璃瓶18中，其中，在排水管15出口端采用0.22μm的有机滤膜对土壤上清液进行过滤；待流入石英玻璃瓶18中的土壤上清液碰触到石英玻璃瓶18瓶口处液面探针17的底部时，操作控制台13控制玻璃杯体6右侧的第二齿轮转动，自动关闭排水管15的第二阀门；
[0052]
1.4.重新启动激光器1904激发出785nm的激光，且激光透射过的石英玻璃瓶18内装有土壤上清液，透射过装有土壤上清液的石英玻璃瓶18的激光最终被ccd探测器1902接收获得待检测拉曼光谱，ccd探测器1902将采集到的待检测拉曼光谱传输到电脑10，电脑10对400-2000cm-1
波数范围内的光谱数据集采用粒子优化的最小二乘支持向量机即模型pso-lssvm拟合计算得出土壤无机态氮的浓度，光谱数据集d具体为：
[0053][0054]
式中，i为某一种土壤样本的个数；yi为第i个土壤样本的上清液在400-2000cm-1
波数范围内的拉曼散射强度矩阵，通过拉曼检测系统测得，在光学分辨率为2cm-1
时，yi对应801个离散的拉曼散射强度的行向量[y1,y2,
…
，y
801
]，任意波数下的拉曼散射强度y的单位
为a.u.；xi为第i个土壤样本中无机态氮的浓度；
[0055]
1.5.拉曼光谱采集结束后，打开排废管2入口端的第一阀门4，使得玻璃杯体6里剩余的沉淀及土壤上清液通过排废管2流入储废罐1，用于回收或清理。
[0056]
胶体为通过柠檬酸三钠还原硝酸银制备的银胶或者通过柠檬酸三钠还原氯金酸制备的金胶。胶体作为纳米颗粒表面增强试剂，用来增强拉曼光谱的采集信号。银胶是含银纳米颗粒agnps的胶体材料基底，金胶是含金纳米颗粒aunps的胶体材料基底。
[0057]
无机态氮包括土壤铵态氮和土壤硝态氮，土壤铵态氮和土壤硝态氮均采用质量百分比的计算方式，单位为wt％，具体计算公式为：
[0058][0059][0060]
其中，ch为土壤铵态氮的浓度，co为土壤硝态氮的浓度，nh所添加铵态氮肥中的氮素含量，no为所添加硝态氮肥中的氮素含量，sh为土壤中已有的铵态氮含量，so为土壤中已有的硝态氮含量，mh为添加的铵态氮肥质量，mo为添加的硝态氮肥质量，ms为土壤质量。
[0061]
如图1和图2所示，本实施例中使用的铵态氮肥为硫酸铵，硝态氮肥为硝酸钠。铵根离子是由n-h极性键构成的非极性离子，硫酸铵对应的铵态氮拉曼吸收峰为976cm-1
，来源于n-h键的摇摆振动。由于土壤胶体带负电荷，带正电荷，两者间会形成范德华力，即土壤胶体吸附随之放出热量，分子热运动剧烈，氢键易断裂，振动频率增加，波长变短，拉曼吸收峰向波数增大的方向微微偏移，即蓝移。因此实际测得的拉曼吸收峰为978cm-1
。硝酸根离子的氮氧键介于单双键之间，硝酸钠对应的硝态氮拉曼吸收峰为1044cm-1
，它来源于n-o键的对称拉伸振动。
[0062]
在不使用胶体作为纳米颗粒表面增强试剂时，即玻璃杯体6中仅是土壤与纯净水的混合物，土壤铵态氮和硝态氮的拉曼光谱检测限lod分别为60μg/ml和20μg/ml；在使用银胶时，土壤铵态氮和硝态氮的拉曼光谱检测限lod分别为30μg/ml和10μg/ml，均降为不使用纳米颗粒表面增强试剂时的一半。
[0063]
具体的，所添加的银胶与待测无机态氮水溶液的质量比为1:200；而添加的金胶与待测无机态氮水溶液的质量比为1:100。
[0064]
如图3和图4所示，银胶的增强效果优于金胶，而且银胶比金胶的成本更低、用量更少、保质期更长，故推荐使用银胶作为表面增强试剂，图4之后的拉曼光谱数据均是使用银胶测得的。
[0065]
其中，拉曼光谱的单光源可以选择785nm、830nm或1064nm的激光器，探测器可以选择ccd探测器、ge探测器或ingaas探测器。
[0066]
优选地，拉曼光谱采集时的参数为：激发波长为785nm，功率为200mw，频移扫描范围为100-3300cm-1
，光学分辨率为2cm-1
，积分时间为10s，连续扫描2次取平均，滤波器平滑参数为1。
[0067]
如图5-8所示，土壤上清液的拉曼光谱与土壤无机态氮的浓度是非线性正相关的。
其中，土壤铵态氮浓度与拉曼吸收峰强度的拟合曲线如图7所示，其决定系数r2＝0.99936。土壤硝态氮浓度与拉曼散射强度的拟合曲线如图8所示，其决定系数r2＝0.99815。
[0068]
本实施例采集三种不同的土壤，分别标识为土壤一、土壤二和土壤三。对它们的铵态氮和硝态氮分别在0.1-10％范围内分别设置10个浓度，每个浓度梯度重复10次以上操作。最终得到6个数据集，每个数据集包含100组数据，每组数据对应801个离散点值。
[0069]
三种土壤的铵态氮均在978cm-1
处出现相同且唯一的拉曼特征峰，如图3所示。类似地，三种土壤的硝态氮均在1044cm-1
处出现相同且唯一的拉曼特征峰，如图4所示。并且拉曼光谱强度随三种土壤的10个递增浓度梯度而显著变强，同时保持峰值位置恒定，如图5和图6所示。由于三种土壤的规律保持一致，故以土壤三为例。图3、图4、图5、图6、图7和图8均为土壤三的数据可视化。图3和图4中的银胶代表使用银胶测得的拉曼光谱，金胶代表使用金胶测得的拉曼光谱，参照组代表无任何添加的原始拉曼光谱。图5的右轴表示土壤铵态氮的浓度，图7的右轴表示土壤硝态氮的浓度。
[0070]
将所有土壤上清液的拉曼光谱按4:1的比例随机划分为校正集和验证集。校正集的数据主要用于训练使用粒子优化的最小二乘支持向量机模型pso-lssvm，验证集的数据主要用于对所构建的模型pso-lssvm进行测试。
[0071]
表1
[0072][0073]
表1为利用建立的模型pso-lssvm预测三种不同土壤中的两种无机态氮浓度的结果表现。表1中r2为模型pso-lssvm计算预测该土壤无机态氮浓度的决定系数，rmsep为模型pso-lssvm计算预测该土壤无机态氮浓度的均方根误差，rpd为模型pso-lssvm计算该土壤无机态氮浓度的相对预测偏差。
[0074]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明做了详细的说明，但是本领域技术人员对本发明的技术方案所做的部分修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
