μA

维A酸软膏中维A酸的含量测定及有关物质的检查

蔡乐;姚兰;白林

【摘要】Objective:ToestablishtheHPLCmethodfordeterminationof

s:HPLC

analysiswascarriedoutonacolumnofAgilentZorbaxSBC18(250mm×

4.6mm,5μm)withmobilephaconsistedofmethanol-2%glacialacetic

acidsolution(85:15),thelfowratewas1.0mL·min-1,thedetection

wavelengthwastat354nmandcolumntemperaturewas

45℃.Results:Theparationbetweentretinoinandotherimpuritieswas

wellunderthischromatographiccondition,andparatingdegreeof

tretinoinandisotretinoinwas>ibrationcurveoftretinoinwas

linearintherangerof0.9344–18.6872μg·mL-1(r=1.0000).Theaverage

recoveryoftretinoinwas99.4%(RSD=1.44%,n=9).Conclusion:This

methodissimple,accurateandfeasible,whichcanbeappliedasthe

quantitativemethodforthedeterminationoftretinoinintretinoin

ointment.%目的：建立维A酸软膏中维A酸的含量测定及有关物质检查的方法。

方法：采用HPLC法测定维A酸的含量。色谱柱：AgilentZorbaxSBC18柱

（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-2％冰醋酸（85：15），流速：

1.0mL·min-1，检测波长：354nm，柱温：45℃。结果：维A酸与其他杂质分

离良好，与异维A酸的分离度>5。维A酸在0.9344~18.6872μg·mL-1范围内线

性关系良好（r=1.0000）；维A酸的平均回收率为99.4%（RSD=1.44%，n

=9）。结论：采用该方法测定维A酸软膏中维A酸的含量操作简单，结果准确，

可作为该制剂的质量控制方法。

【期刊名称】《中国药物应用与监测》

【年(卷),期】2015(000)003

【总页数】3页(P144-146)

【关键词】高效液相色谱法;维A酸软膏;含量测定;维A酸;异维A酸

【作者】蔡乐;姚兰;白林

【作者单位】解放军总医院药品保障中心，北京100853;解放军总医院药品保障

中心，北京100853;解放军总医院药品保障中心，北京100853

【正文语种】中文

【中图分类】R917

维A酸软膏收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）[1]，由

维A酸、凡士林和液体石蜡组成，其中维A酸是维生素A的活性代谢产物，具有

促进表皮细胞更新、调节表皮细胞增殖和分化作用，该药常用于各种类型的扁平苔

藓、毛囊角化病、痤疮及其他角化异常类皮肤病的治疗。在《中国人民解放军医疗

机构制剂规范》（2002年版）中并未记载维A酸软膏的含量测定方法，维A酸

不稳定见光易转化为其顺势异构体异维A酸，为提高维A酸软膏的质量标准，更

好地控制该制剂的质量，提高临床用药的安全性和有效性，本研究建立了测定维A

酸软膏中维A酸的含量及检查有关物质异维A酸的HPLC方法。

Agilent1200型高效液相色谱仪（包括1200系列在线脱气机、四元梯度泵、自

动进样器、柱温箱、VWD检测器和色谱工作站，美国Agilent公司）；AG-285

型电子天平（瑞士Mettler公司）；UV-2550型紫外分光光度仪（日本岛津公

司）。

维A酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度99.4%，批号100224-

200903）；异维A酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度99.8%，批号

100224-200903）；维A酸软膏（本院自制，规格：0.025%、20g/盒，批号

20140120-1、20140120-2、20140121）；甲醇为色谱纯；乙醇、冰醋酸为分

析纯；水为重蒸馏水。

2.1色谱条件

色谱柱：AgilentZorbaxSBC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲

醇-2%冰醋酸（85:15）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：354nm；柱温：

45℃；进样量：10μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称定维A酸对照品9.4mg，置100mL棕色量瓶中，加甲

醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维A酸对照品储备液。精密称定异维A酸对照

品12.3mg，置100mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为异

维A酸对照品储备液A。精密量取异维A酸对照品储备液A1mL，置10mL量

瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为异维A酸对照品储备液B。精密量取维

A酸对照品储备液2.5mL和异维A酸对照品储备液B4mL，置100mL量瓶中，

加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（含维A酸2.3359μg·mL-1和异

维A酸0.4910μg·mL-1）。

2.2.2供试品溶液避光操作，取供试品约1.0g（含维A酸约0.25mg），精密称

定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇50mL，称定重量，于60℃水浴中充分

振摇15min，再置于冰浴中冷却2h。取出后用无水乙醇补足重量，迅速滤过，

放至室温后，取续滤液5mL置10mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，

用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液另按处方比例及制备工艺，取除维A酸以外的其余成分，配

制不含维A酸的空白制剂，依供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.1”项下色谱条件，各进样

10μL，测定HPLC图谱，考察供试品中维A酸、异维A酸和其他组分色谱峰分

离情况。在此色谱条件下，维A酸的保留时间为18.4min，异维A酸的保留时间

为16.3min，维A酸和异维A酸色谱峰峰形对称尖锐，分离度大于5，基线平稳，

与其他色谱峰分离良好，阴性对照无干扰，见图1。

2.4线性关系考察

精密量取维A酸储备液适量，加流动相配制成含维A酸分别为0.9344、2.3359、

4.6718、9.3436、14.0154、18.6872μg·mL-1的标准溶液。分别精密吸取标

准溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积值为纵坐标（Y），

浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，计算得维A酸的回归方程为Y=89.383X+

1.8742，r=1.0000。结果表明，维A酸在0.9344～18.6872µg·mL-1范围

内与峰面积呈良好线性关系。

2.5精密度实验

取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定，计算

维A酸的峰面积RSD为0.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6重复性实验

取同一供试品（批号20140120-1）约1.0g，共6份，精密称定，分别按“2.2.2”

项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量RSD为

1.73%（n=6），表明方法重复性良好。

2.7回收率实验

取“2.2.3”项下空白制剂9份，分成3组，每组3份，每份约1.0g。分别精密

加入一定量的维A酸对照品储备液，于50℃微温下与空白制剂混合，再按供试品

溶液制备方法制成含量约为供试品标示量的80%、100%、120%的样品溶液。按

“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.8样品含量测定

取3批样品（批号20140120-1、20140120-2、20140121），每批3份，按

“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法

计算各个样品中维A酸的含量，结果见表2。

2.9异维A酸限量检查

取3批样品（批号20140120-1、20140120-2、20140121），按“2.2.2”项下

方法制备供试品溶液，依照“2.1”项下色谱条件，40μL进样测定。供试品溶液

色谱图中若有与异维A酸保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照品溶液

10μL进样时异维A酸峰面积的5%。经测定，3批样品异维A酸的限量均符合规

定。

3.1维A酸含量测定方法的选择

维A酸的含量测定方法主要有UV法[2-3]和HPLC法[4-6]。经实验发现，维A酸

软膏中凡士林等基质和异维A酸等杂质在维A酸最大吸收波长处均有吸收，对紫

外分光光度法测定存在影响，采用HPLC法则可避免基质和杂质对维A酸测定的

干扰，并可对制剂中的杂质进行限量检查。由于软膏基质黏度大，成分复杂，处理

不当易造成色谱柱堵塞。因此，本实验在参考文献基础上，对提取条件等进行了优

化。

3.2色谱条件的选择

研究中曾参考文献[6]维A酸原料药含量测定项下的流动相甲醇-2%冰醋酸（81:

19）进行实验，但采用该配比测定时维A酸的出峰时间偏长（约30min），且峰

形宽。经实验发现维A酸对甲醇的比例变化敏感，维A酸在甲醇-2%冰醋酸

（90∶10）的条件下，出峰时间可缩短为10min左右，但维A酸与异维A酸的

分离度＜5；而维A酸在甲醇-2%冰醋酸（85∶15）的条件下，出峰时间为18

min左右，维A酸与异维A酸的分离良好（分离度＞5），为此确定流动相为甲

醇-2%冰醋酸（85∶15）。通过扫描维A酸标准溶液的紫外图谱，发现维A酸在

354nm处有最大吸收，因此选择354nm为检测波长。

3.3提取条件的选择

本研究分别以无水乙醇、甲醇和流动相作为溶剂提取样品，发现无水乙醇的提取率

明显高于甲醇和流动相。为减小供试品溶液对色谱柱的损坏，使用无水乙醇提取后，

可冰浴2h使软膏基质沉淀，滤过后再用流动相稀释进一步析出杂质，最后用

0.22μm微孔滤膜滤过后进样[7]。此外，对提取时间和温度进行优化，发现60℃

水浴时充分振摇15min即可完全提取样品。

3.4维A酸的稳定性

本研究考察了光线对维A酸稳定性的影响。实验结果表明，维A酸溶液在室温光

照条件下极不稳定，1h含量下降近20%，8h含量下降超过60%；而维A酸在

室温避光条件下，12h基本稳定，因此实验操作中要注意严格避光。

由于维A酸不稳定，见光易转化为异维A酸，而异维A酸具有较强的致畸作用，

因此应对制剂中异维A酸的含量进行限制。参考文献[6]维A酸乳膏中的检查方法，

本研究将供试品40μL进样中异维A酸峰面积限定为不大于对照品溶液（10μL

进样）中异维A酸峰面积的5%，经检查所配制的3批样品均符合规定。

综上，采用HPLC法操作简便，准确性高，重复性好，可作为维A酸软膏中维A

酸含量测定及有关物质检查的方法。

【相关文献】

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