高翻译稳定性BDFmRA的设计和制备方法与流程
高翻译稳定性bdnf mrna的设计和制备方法
技术领域
1.本发明涉及核酸产品技术领域，具体涉及一种高翻译稳定性 bdnf mrna的设计和制备方法。
背景技术：
2.间充质干细胞(msc)是中胚叶性组织由来的体性干细胞，存在于骨髓、脐带、脂肪组织等位置。msc能贴附在塑料表面生长，并具有分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞的潜能。所以， msc被期待在骨骼、血管、心肌的再构筑等再生医疗领域得到应用。此外，msc也被认为是当前针对神经退行性疾病的新型手段, 其在抑制神经炎症反应的同时还能有限地分泌多种神经营养因子，用于神经损伤。其中脑源性神经营养因子(bdnf)在突触传递方面扮演了重要角，bdnf的原位注射或过表达皆可增加新生神经元产量，促进神经生成，在保护神经退行性疾病患者的运动神经元和暂缓疾病进展方面均有成功案例报道。但神经营养因子疗法面临的两大亟待解决的问题是：(1)过快的降解速率；(2)无法通过血脑屏障，现存载体存在缺陷。
3.若直接转染含有基因修饰型bdnf的质粒dna进入人msc细胞核存在污染人基因组的风险，用脂质体法转染基因修饰型bdnfmrna可规避此风险。然而，野生型人bdnf mrna的体外环境下易降解，转染后表达的bdnf蛋白的半衰期短，必须对其mrna的开放阅读框架(orf)进行优化，再实施加帽/加尾反应以确保其在体外环境中的稳定性。既往的mrna合成工艺花费高、耗时长等问题，制约了相关细胞药物研发的进程。
技术实现要素：
4.为解决上述问题，本发明提供了一种高翻译稳定性bdnfmrna的设计和制备方法，其方法方便快捷、性价比高，适于推广应用，有效避免了现有技术中体外转录操作存在花费高以及耗时长等问题、制约了相关细胞药物研发的进度的缺陷。在mrna体外合成的成本和工时，能加快相关细胞药物研发的进展。
5.为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种高翻译稳定性 bdnf mrna的设计和制备方法的解决方案，具体如下：
6.一种高翻译稳定性bdnf mrna的设计，包括：
7.在野生型人bdnf基因序列的基础上，通过哺乳动物细胞密码子偏好设计优化为稳定型bdnf序列；
8.同时，舍弃了野生型人bdnf基因中原有的5
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/3
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非翻译区 (utr)，转而采用长度短于100nt的5
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utr和珠蛋白的3
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utr来修饰bdnf mrna。
9.进一步的，设计完成后的稳定型bdnf序列被合成并连接在适当的pcdna3.1(+)质粒中，转化到dh5α中进行大量扩增，用于 bdnf mrna的制备。
10.一种高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，包括如下步骤：
11.步骤1：取1-10μg所述质粒进行单酶切使其线性化，加入1
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5μl的内切酶、5-25μl
的内切酶缓冲液并加ddh2o至终体系为 50-200μl，在37℃下孵育30min-2h；
12.步骤2：先后加入1/100-1/50体积的乙二胺四乙酸(edta)、1/100-1/50体积的醋酸铵以及2-5倍体积的无水乙醇，混合均匀后在低温下静置，再采用低温高速离心对线性化后的质粒进行纯化；
13.步骤3：体外加帽转录反应；
14.步骤4：去除转录以及加帽反应液中的核苷酸、短寡核苷酸、蛋白质和盐；
15.步骤5：多聚腺苷酸加尾反应；
16.步骤6：移除步骤5所得到的生成物中的蛋白质，缓冲盐以及核苷酸。
17.进一步的，所述步骤3具体包括：取0.5-5μg线性质粒加入适量无核酸酶水中，再依次加入1-5μl的10
×
反应缓冲液，5
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30μl的2
×
ntp/帽类似物以及1-5μl的酶混合物，混合均匀后在 37℃下孵育1-16h。
18.进一步的，所述步骤4具体包括：加入0.1-1ml浓缩结合液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用 0.1-1ml洗涤液高速离心清洗2次后用1-100μl洗脱液溶解加帽 mrna并高速离心洗脱，收集滤液。
19.进一步的，所述步骤5具体包括：混合无核糖核酸酶水、1
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10μl的10
×
多聚腺苷酸多聚酶反应缓冲液、1-30μl的10mmatp、 20-100μgrna，以及1-10μl多聚腺苷酸多聚酶，充分混匀后置于 37℃孵育10-30min，再加入5-15mmedta,将反应液置于低温10
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30min以终止反应而得到生成物。
20.进一步的，所述步骤6具体包括：加入0.1-1ml清除结合缓冲液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用0.1-1ml洗涤液高速离心清洗2次后，向滤柱中央滤膜中央加入提前预热的10-50μl无核酸酶水溶解加帽/加尾mrna并高速离心洗脱，收集滤液即完成高翻译稳定性bdnfmrna的制备。
21.本发明的有益效果为：
22.本发明利用较低起始量的质粒在短时间内即可完成具有翻译稳定性的mrna的合成和纯化，除使用到若干特定试剂盒，不需要额外试剂的投入。本发明相较于价格高昂的进口试剂盒套装，在两步提纯损耗率均低于5％的情况下，可达到同等产能，极大地便利了该 mrna产物在下游实验中的活用，有效地解决了既有的mrna体外合成工艺花费高、耗时长等问题、加快了相关细胞药物研发的进程。有效避免了现有技术中体外转录操作存在花费高以及耗时长等问题、制约了相关细胞药物研发的进度的缺陷。
附图说明
23.图1为本发明的高翻译稳定性bdnf mrna的设计概要图；
24.图2为本发明的制备方法流程图；
25.图3为本发明实施例1转染msc的效率图；
26.图4为本发明实施例1转染msc的制剂的bdnf浓度及活率变化图；
27.图5为本发明实施例3中不同组小鼠运动机能改善及存活时间延长的结果图。
具体实施方式
28.本发明利用基因修饰的方法对bdnf mrna序列进行修饰、优化，再通过脂质体转染
的方式实现bdnf在msc中的表达，可大幅提升 msc的bdnf分泌能力。
29.下面将结合附图和实施例对本发明做进一步地说明。
30.高翻译稳定性bdnf mrna的设计，包括：
31.在野生型人bdnf基因序列的基础上，通过哺乳动物细胞密码子偏好设计优化为稳定型bdnf序列；
32.同时，舍弃了野生型人bdnf基因中原有的5
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非翻译区 (utr)，转而采用长度短于100nt的5
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utr和珠蛋白的3
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utr来修饰bdnf mrna。
33.设计完成后的稳定型bdnf序列被合成并连接在适当的 pcdna3.1(+)质粒中，转化到dh5α中进行大量扩增，用于bdnfmrna的制备。
34.高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，包括如下步骤：
35.步骤1：取1-10μg所述质粒进行单酶切使其线性化，加入1
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5μl的内切酶、5-25μl的内切酶缓冲液并加ddh2o至终体系为 50-200μl，在37℃下孵育30min-2h；
36.步骤2：先后加入1/100-1/50体积的乙二胺四乙酸(edta)、 1/100-1/50体积的醋酸铵以及2-5倍体积的无水乙醇，混合均匀后在低温下静置，再采用低温高速离心对线性化后的质粒进行纯化；
37.步骤3：体外加帽转录反应；
38.步骤
39.4：去除转录以及加帽反应液中的核苷酸、短寡核苷酸、蛋白质和盐；
40.步骤5：多聚腺苷酸加尾反应；
41.步骤6：移除步骤5所得到的生成物中的蛋白质，缓冲盐以及核苷酸。
42.所述步骤3具体包括：取0.5-5μg线性质粒加入适量无核酸酶水中，无核酸酶水为1-5μl的无核酸酶水，再依次加入1-5μl的 10
×
反应缓冲液，5-30μl的2
×
ntp/帽类似物以及1-5μl的酶混合物，混合均匀后在37℃下孵育1-16h。
43.所述步骤4具体包括：加入0.1-1ml浓缩结合液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用0.1-1ml洗涤液高速离心清洗2次后用1-100μl洗脱液溶解加帽mrna并高速离心洗脱，收集滤液。
44.所述步骤5具体包括：混合无核糖核酸酶水、1-10μl的 10
×
多聚腺苷酸多聚酶反应缓冲液、1-30μl的10mmatp、20
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100μgrna，以及1-10μl多聚腺苷酸多聚酶，充分混匀后置于 37℃孵育10-30min，再加入5-15mmedta,将反应液置于低温10
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30min以终止反应而得到生成物。
45.所述步骤6具体包括：加入0.1-1ml清除结合缓冲液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用0.1
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1ml洗涤液高速离心清洗2次后，向滤柱中央滤膜中央加入提前预热的10-50μl无核酸酶水溶解加帽/加尾mrna并高速离心洗脱，收集滤液即完成高翻译稳定性bdnfmrna的制备。
46.具体实施例如下所示：
47.实施例1(bdnf mrna转染msc及msc制剂的制备)
48.(1)msc传代培养：
49.人脐带msc以1
×
104/cm2的密度接种于培养瓶中。将细胞培养瓶置于37℃、5％co2饱和湿度孵育箱中培养，每隔三到四天换液，在转染msc的前一天实施传代培养。
50.(2)使用mrna转染试剂盒转染msc:
51.在转染前18-24小时以0.8-3.0
×
104cells/cm2的密度传代细胞，以确保细胞达到适当的细胞密度(通常≥80％汇合)时开始转染。按如下顺序依次取样配制转染体系混合液：1.9ml的opti-mem ireduced-serum medium、19.7μg的mrna、39.4μl的mrnaboost reagent以及39.4μl mrna boost reagent，混合液在室温下孵育2-4min后加入培养细胞的t75培养瓶中，培养适当时间后取出进行后续半成品的制备。
52.(3)gfp-bdnf mrna转染msc效率分析
53.在转染效率检测的实施例中，bdnf的设计序列的orf的羧基端被插入了一段绿荧光蛋白(gfp)基因，继而用本发明的制备手法合成mrna,并用实施例1(2)中的转染msc，如图3所示，在转染后，gfp和bdnf的表达水平显著高于转染前，且转染率大于30％。
54.实施例2(msc制剂细胞活率及bdnf分泌能力的检测)
55.本实施例研究了按实施例1方法制备的msc制剂在制成后的72 h间的细胞活率与bdnf分泌能力相较于未转染对照组的差异，具体方法如下：
56.(1)转染后的细胞弃去培养基，并用pbs清洗两遍，加入5 ml消化液消化5min，再加入5ml终止液终止消化，吹打制成细胞悬液并收集至离心管中，以270g的转速离心5min，弃去上清后再加入重悬洗液清洗数遍，根据细胞数量加入适量辅料溶液，即为制备完成的msc-bdnf制剂。
57.(2)每隔24h对msc-bdnf制剂进行取样，并用ao/pi染检测制剂中msc的细胞活率，取得的样品以270g的转速5min，弃去细胞沉淀。上清液通过bdnf elisa试剂盒检测制剂中bdnf的含量。标准品设定8个浓度梯度，取出检测样板，每孔加入50μl assaydiluent rd1-123。标准品以及样本以适量体积加入相应孔中，盖板膜盖板后，设置摇床500
±
50rpm，室温孵育2h；孵育结束后加入洗涤液按要求洗板四次，再加入200μl total bdnf conjugate，盖板膜盖板后，室温下摇床上孵育1h；孵育结束后再洗板四次，加入200μl substrate solution，室温下避光孵育30min进行显反应。结束后再加入50μl stop solution终止显，30 min内利用酶标仪在450nm波长处进行测定每孔的od值。
58.图4a中，转染了bdnf mrna的实验组msc-bdnf制剂中各个时间段的bdnf浓度均显著高于未做转染处理的对照组msc制剂；图 4b中,实验组msc-bdnf制剂与对照组msc制剂的细胞活率随时间推移逐渐趋近。
59.实施例3(动物模型实验)
60.本实施例研究了按实施例1方法制备的msc半成品制剂的移植对渐冻症(als)疾病模型小鼠运动机能改善及存活时间延长的功效，具体方法如下：
61.实验动物选择4-6周的雄性转基因b6sjltg(sod1-g93a) 1gur/j小鼠(实验组)和其非转基因野生型同窝小鼠(对照组)，饲育于60％湿度、21-23℃、12h明/12h暗循环的spf环境中。在小鼠60日龄时，对其进行每组6只编组，对照组小鼠，实验组小鼠被随机分为模型组(鞘内注射pbs)、msc组(鞘内注射未转染的 msc)和msc-bdnf组(鞘内注射转染了bdnf mrna的msc)。实施msc移植时，msc被以105/μl的浓度重悬在pbs中，5μl的细胞悬液被以腰椎穿刺的方式注入马尾水平椎骨间中线的蛛网膜下腔，插管会被维持2分钟，随后被缓慢收回。细胞移植一个月后，评价各组小鼠的各项生理指标。
62.图5a中，als模型小鼠运动机能的改善可在als/msc组和 als/msc-bdnf组中被观
察到，在此旋转试验中，als/msc-bdnf组小鼠展现出了显著的更佳旋转棒表现，相较于als组和als/msc组小鼠，它们有着更长的跌落延迟时间；另外，在图5b中,als/msc
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bdnf组小鼠显示出了比als组和als/msc组小鼠较长的寿命 (146.67天)，als组为136.67天，als/msc组为142.33天。以上以用实施例说明的方式对本发明作了描述，本领域的技术人员应当理解，本公开不限于以上描述的实施例，在不偏离本发明的范围的情况下，可以做出各种变化、改变和替换。
技术特征：
1.一种高翻译稳定性bdnf mrna的设计，其特征在于，包括：在野生型人bdnf基因序列的基础上，通过哺乳动物细胞密码子偏好设计优化为稳定型bdnf序列；同时，舍弃了野生型人bdnf基因中原有的5
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非翻译区(utr)，转而采用长度短于100nt的5
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utr和珠蛋白的3
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utr来修饰bdnf mrna。2.根据权利要求1所述的高翻译稳定性bdnf mrna的设计，其特征在于，设计完成后的稳定型bdnf序列被合成并连接在适当的pcdna3.1(+)质粒中，转化到dh5α中进行大量扩增，用于bdnf mrna的制备。3.一种高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取1-10μg所述质粒进行单酶切使其线性化，加入1-5μl的内切酶、5-25μl的内切酶缓冲液并加ddh2o至终体系为50-200μl，在37℃下孵育30min-2h；步骤2：先后加入1/100-1/50体积的乙二胺四乙酸(edta)、1/100-1/50体积的醋酸铵以及2-5倍体积的无水乙醇，混合均匀后在低温下静置，再采用低温高速离心对线性化后的质粒进行纯化；步骤3：体外加帽转录反应；步骤4：去除转录以及加帽反应液中的核苷酸、短寡核苷酸、蛋白质和盐；步骤5：多聚腺苷酸加尾反应；步骤6：移除步骤5所得到的生成物中的蛋白质，缓冲盐以及核苷酸。4.根据权利要求3所述的高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：取0.5-5μg线性质粒加入适量无核酸酶水中，再依次加入1-5μl的10
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反应缓冲液，5-30μl的2
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ntp/帽类似物以及1-5μl的酶混合物，混合均匀后在37℃下孵育1-16h。5.根据权利要求3所述的高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：加入0.1-1ml浓缩结合液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用0.1-1ml洗涤液高速离心清洗2次后用1-100μl洗脱液溶解加帽mrna并高速离心洗脱，收集滤液。6.根据权利要求3所述的高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，其特征在于，所述步骤5具体包括：混合无核糖核酸酶水、1-10μl的10
×
多聚腺苷酸多聚酶反应缓冲液、1-30μl的10mmatp、20-100μgrna，以及1-10μl多聚腺苷酸多聚酶，充分混匀后置于37℃孵育10-30min，再加入5-15mmedta,将反应液置于低温10-30min以终止反应而得到生成物。7.根据权利要求3所述的高翻译稳定性bdnf mrna的制备方法，其特征在于，所述步骤6具体包括：加入0.1-1ml清除结合缓冲液，混匀后再加入0.1-1ml无水乙醇混匀，高速离心过柱弃滤液；用0.1-1ml洗涤液高速离心清洗2次后，向滤柱中央滤膜中央加入提前预热的10-50μl无核酸酶水溶解加帽/加尾mrna并高速离心洗脱，收集滤液即完成高翻译稳定性bdnfmrna的制备。
技术总结
一种高翻译稳定性BDF mRA的设计和制备方法，包括：在野生型人BDF基因序列的基础上，通过哺乳动物细胞密码子偏好设计优化基因序列来作为稳定型BDF序列；同时，舍弃了野生型人BDF基因中原有的5
