一种基于快速沉降病毒直接PCR检测植物病毒的方法
一种基于快速沉降病毒直接pcr检测植物病毒的方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于快速沉降病毒直接pcr检测植物病毒的方法，属于植物保护领域。
背景技术：
2.植物病毒病素有“植物癌症”之称，种类多、寄主广、危害大、防治难，是仅次于真菌病害的第二大植物病害，目前已报道的植物病毒有1340种，危害1000多种植物，致使农作物产量和品质严重下降。据不完全统计，全球每年因植物病毒病害造成的农作物经济损失高达600亿美元，对作物安全生产造成了极大的威胁。种植结构调整和气候变化导致植物病毒病害在我国发生日趋普遍，呈现出突发性、暴发性和重发性的特点。在我国生产上重要性的病毒中，既有危害粮食作物的水稻条纹病毒(rice stripe virus，rsv)、水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus，rbsdv)、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus，srbsdv)、大麦黄矮病毒(barley yellow dwa，f virus，bydv)、小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus，wymv)等，也有危害经济作物的番茄黄化曲叶病毒(tomaoto yellow leaf curl virus，tylcv)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)、马铃薯y病毒(potato virus y，pvy)等。随着国际商贸往来的日益频繁，大量新的植物病毒陆续在国内检出，例如，黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus，cgmmv)、番茄褐皱果病毒(tomato brown rugose fruit virnus，tbrfv)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，tswv)、玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus，mcmv)、李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus，pnrv)等。为阻止外来入侵物种的扩散蔓延，国家有关部门将很多新发植物病毒列入全国农业植物检疫性有害生物目录，以加强这些病毒的检疫工作，控制其扩散风险。
3.植物感染病毒后症状通常较为相似，一般为叶片褪绿、黄化、花叶、皱缩、坏死，植株矮化、畸形等，多数情况下难以通过症状诊断植株感染病毒的种类，因此，需借助分子生物学技术进行检测鉴定。植物病毒的快速检测对于病害诊断、病毒病预测预报、流行监测以及预警体系的构建具有重要作用，对后续防控技术的应用也能起到积极的指导作用。
4.常用植物病毒的鉴定方法主要有：生物学接种实验、血清学检测、电镜检测及分子生物学检测。生物学接种实验是通过机械摩擦方式或通过媒介昆虫将病毒接种至指示植物，然后观察植株症状，该方法工作量大、耗时长，短则1周时间，长则1个月。血清学检测对病毒抗体的依赖性高，需要高特异性抗体，在缺乏病毒抗体的情况下，血清学检测无法应用。电镜检测需要高值仪器电子显微镜，且不适合大量样品检测，一般应用于病原特性的研究工作。目前，应用最广泛的仍是以pcr和rt-pcr技术为主的分子生物学检测法，该方法受到的制约条件最小。无论是通过pcr检测dna病毒，还是通过rt-pcr检测rna病毒，第一步都需要从植物组织中提取病毒核酸，核酸提取方法现在运用最多的是ctab法(dna提取)和trizol法(rna提取)以及以此为基础形成的提取试剂盒。当检测样本较多时，核酸提取步骤
仍需花费大量时间，同时提取过程中会使用氯仿、异丙醇、苯酚等有机试剂并产生有毒废弃液，对实验操作人员和环境均有潜在的危害。本方法无需提取植物组织核酸即可实现病毒的pcr检测，在保证可靠性和灵敏性的前提下，简化了检测步骤，节省了成本和时间。同时，避免了有毒化学试剂的使用，降低了对实验操作人员的伤害和环境的污染。
技术实现要素：
5.本发明针对上述研究背景，开发了低温无水乙醇快速沉降病毒粒子的方法(简称为病毒沉降法)，获得的沉淀(含病毒粒子)可直接用于pcr和rt-pcr检测，免除了植物病毒分子检测中核酸提取的繁琐步骤，与trizol提取rna方法检测病毒相比较，检测结果一致，说明利用该方法可以实现对植物病毒的快速检测。本发明提供了一种基于快速沉降病毒直接pcr检测植物病毒的方法，填补了植物病毒分子检测中免核酸提取技术上的空白，同时避免了有毒化学试剂的使用，降低了对实验操作人员的伤害和环境的污染，是一种快速、简便、高效、经济、安全的植物病毒检测方法，可应用于植物病毒的诊断鉴定、流行监测以及植物病毒侵染寄主机制研究工作。
6.病毒沉降法的详细步骤：
7.1)取感病植物叶片约100mg置于2ml取样管中，液氮冷冻，充分研磨；
8.2)加入400μl pbs缓冲液(沉降有包膜病毒时，可使用含2％tritonx-100的pbs缓冲液)，振荡混匀，12000rpm，离心3min；
9.3)取上清移入新的1.5ml离心管，加入等体积4℃预冷的无水乙醇，混匀后，-20℃静置20min；
10.4)4℃，12000rpm，离心10min，沉降病毒，弃上清；
11.5)加入800μl 70％乙醇洗涤沉淀(沉淀含病毒粒子)，12000rpm，离心5min，弃上清，重复洗涤沉淀一次，吸净残余液体；
12.6)晾干沉淀，加入50μl rnase-free水溶解沉淀。100℃水浴5min(裂解病毒外壳蛋白，使核酸暴露)，迅速冰浴，即获得病毒基因组溶液，-20℃保存。所获病毒基因组溶液可直接用作pcr和rt-pcr扩增反应模板，检测dna病毒和rna病毒。
附图说明：
13.图1：trizol提取rna法和病毒沉降法检测tommv的电泳结果(m：dna标准分子量；1：烟草样品使用trizol提取rna法检测病毒；2：烟草样品使用病毒沉降法检测病毒)。
14.图2：trizol提取rna法和病毒沉降法检测rsv的电泳结果(m：dna标准分子量；1：水稻样品使用trizol提取rna法检测病毒；2：水稻样品使用病毒沉降法检测病毒)。
15.图3：应用病毒沉降法快速pcr检测8种植物病毒的电泳结果，a：rsv、b：rbsdv、c：srbsdv、d：wymv、e：tommv、f：tswv、g：cmv、h：tylcv(m：dna标准分子量；ck-：阴性对照；1-4：感病植物样品)。
16.图4：病毒沉降法结合荧光定量pcr检测tommv。
具体实施方式：
17.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
18.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
19.本发明实施例所用的感染病毒的植物叶片由发明人实验室提供，其余材料、试剂等，均可从商业途径得到。
20.实施例1：病毒沉降法与trizol提取rna法检测植物病毒的效果比较
21.以番茄斑驳花叶病毒(tomato mottled mosaic virus，tommv)和水稻条纹病毒(rsv)为检测对象比较两种方法的效果。
22.1、引物设计
23.在ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)下载已报道的tommv cp基因(登录号：kf477193.1)和rsv ncp基因(登录号：x53563)核苷酸序列，利用primer premier 5.0软件设计特异性引物如下：
24.tommv-cp-f：5
’‑
atgtcttacgctattacttct-3’25.tommv-cp-r：5
’‑
ttaggacgctggcgcagaagt-3’26.rsv-ncp-f：5
’‑
atgggtaccaacaagccagc-3’27.rsv-ncp-r：5
’‑
ctagtcatctgcaccttctgc-3’28.2、病毒沉降法快速沉降病毒粒子
29.1)取感病植物叶片(烟草和水稻)约100mg置于2ml取样管中，液氮冷冻，充分研磨；
30.2)加入400μl pbs缓冲液，振荡混匀，12000rpm，离心3min；
31.3)取上清移入新的1.5ml离心管，加入等体积4℃预冷的无水乙醇，混匀后-20℃静置20min；
32.4)4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；
33.5)加入800μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心5min，弃上清，重复洗涤沉淀一次，吸净残余液体；
34.6)晾干沉淀，加入50μl rnase-free水溶解沉淀。100℃水浴5min，迅速置冰上，即获得病毒基因组溶液，-20℃保存。
35.3、trizol法提取叶片总rna(对照)
36.1)取感病植物叶片(烟草和水稻)约100mg置于2ml取样管中，液氮冷冻，充分研磨；
37.2)加入1ml trizol reagent充分振荡，室温放置5min；
38.3)加入200μl氯仿，混匀后静置3min；
39.4)4℃，12000rpm，离心10min；
40.5)取上层水相移入新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀后静置5min；
41.6)4℃，12000rpm，离心10min，弃去上清；
42.7)加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀，12000g，离心5min，弃上清，重复洗涤沉淀一次；
43.8)干燥rna沉淀，加40μl rnase-free水溶解沉淀，用nanodrop 2000c分光光度计测定rna的浓度和质量，-20℃保存。
44.4、rt-pcr扩增
45.1)反转录(rt)反应：
46.取pcr管，加入以下试剂：病毒基因组溶液(或总rna)2μl，5
×
primescript rt master mix(含逆转录酶、反应缓冲液、rnase抑制剂、dntp)2μl，rnase-free水6μl，反应条件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃保存。
47.2)聚合酶链式反应(pcr)：
48.以反转录合成的第一链cdna为模板，进行pcr扩增，如检测dna病毒，无需反转录步骤，直接以病毒基因组溶液为模板进行pcr扩增。反应体系如下：
[0049][0050]
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性25sec、50-52℃退火25sec、72℃延伸40sec，34次循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0051]
5、电泳检测
[0052]
取6μl pcr产物经1％琼脂糖凝胶(加入花青素类核酸染料)电泳，电压150v、电泳时间30min，于凝胶成像系统中观察扩增结果。如果叶片有病毒感染，则可以观察到一条符合预期大小的条带，如果叶片没有病毒感染，则不会扩增出条带。结果显示，在检测tommv实验中，病毒沉降法与trizol提取rna法的结果一致，均可以从烟草病叶中检测出大小为480bp的病毒cp基因(图1)；同样的，两种方法都可以从水稻病叶中检测出大小为969bp的rsv ncp基因(图2)。这些结果证明病毒沉降法能够有效的从植株中检测出植物病毒，检测结果准确性与trizol提取rna法相同，并且病毒沉降法不使用有毒化学试剂。
[0053]
实施例2：应用病毒沉降法快速pcr检测8种植物病毒
[0054]
分别取感染rsv、rbsdv、srbsdv、wymv、tommv、tswv、cmv、tylcv的植株组织(水稻、小麦、烟草、番茄、黄瓜)，采用病毒沉降法快速检测这8种在我国普遍发生的粮食作物和蔬菜作物病毒。取感病植株组织约100mg，以相应的健康样品为阴性对照。按照实例1的步骤先沉降病毒获得病毒基因组溶液，然后进行rt-pcr(rna病毒)或pcr(dna病毒)检测。所用引物如下：
[0055][0056]
结果显示，在8种病毒的检测中，测试样品均可以扩增出符合预期大小的条带，而阴性对照均没有扩增出条带(图3)。这些结果说明应用病毒沉降法能够从病叶中快速检测出各类植物病毒，检测结果准确，广谱性高，适用范围广。
[0057]
实施例3：应用病毒沉降法结合荧光定量pcr检测植物病毒
[0058]
取感染tommv烟草叶片约100mg，以健康叶片为阴性对照。按照实例1的步骤先沉降病毒获得病毒基因组溶液，反转录合成第一链cdna，然后进行荧光定量pcr检测。所用引物如下：qtom-cp-f：5
’‑
cattgctgggaactttcgat-3’，qtom-cp-r：5
’‑
caggccaacccagacatact-3’。反应体系20μl：2
×
sybr green pcr master mix 10μl，cdna 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 6μl。反应条件为95℃预变性30sec；95℃变性5sec、60℃退火15sec，40次循环；熔解曲线分析，60℃至95℃，0.1℃/sec递增。结果显示，测试样品可以观察到标准的扩增曲线，而阴性对照没有出现扩增曲线(图4)。这说明病毒沉降法获得的病毒基因组溶液同样适用于荧光定量pcr方法检测植物病毒。
[0059]
上述实施不以任何形式限定本发明。
技术特征：
1.一种基于快速沉降病毒直接pcr检测植物病毒的方法，其特征在于：植物组织研磨上清液中加入等体积预冷无水乙醇，冰浴后12000rpm离心沉降病毒粒子，洗涤后加入无核酶去离子水溶解沉淀，100℃水浴后立即冰浴，即获得病毒基因组溶液，作为模板直接用于pcr、rt-pcr和荧光定量pcr反应，实现植物病毒的快速检测。
技术总结
针对目前植物病毒检测中核酸提取步骤冗繁的问题，本发明建立了一种基于低温预冷无水乙醇快速沉降病毒粒子检测植物病毒的方法。充分研磨获得的植物组织上清液中加入等体积预冷无水乙醇，冰浴后12000rpm离心沉降病毒粒子，70％乙醇洗涤后，加入无核酶去离子水溶解沉淀，100℃水浴后立即冰浴，即获得病毒基因组溶液，作为模板直接用于PCR、RT-PCR和荧光定量PCR反应检测病毒。使用本方法可以快速从植物样品中检测多种植物病毒，包括DA和RA病毒。本发明方法不需要冗繁步骤来分离提取待检测样品的DA或RA，能在较短时间内获得满足PCR反应的病毒基因组作为模板，简便快捷、广谱性高、无需使用有毒化学试剂，节省了成本，降低了对实验人员的伤害和环境的污染，大大提高了植物病毒检测的效率和准确性，对于大规模快速检测植物病毒具有重要意义。这一方法可应用于植物病毒的诊断鉴定、流行监测以及植物病毒侵染寄主机制研究工作。寄主机制研究工作。寄主机制研究工作。
