一种锁核酸修饰的septin9基因甲基化检测方法
1.本发明涉及基因甲基化检测技术领域，具体为一种锁核酸修饰的septin9 基因甲基化检测方法。
背景技术：
2.有效的甲基化基因检测手段是临床应用的关键，其中甲基化特异性pcr (methylation-specific pcr，msp)是一种快速、实用的使用亚硫酸盐处理的基因甲基化检测方法，其灵敏度高、特异性强，能同时检测多个cpg位点的甲基化情况，定量分析基因启动子cpg岛每个cpg位点的甲基化水平。在msp的基础上研发的methylight是一种基于荧光的实时定量pcr方法 (quantitative real-time pcr，qpcr)，因其操作过程简单和高通量检测可实现对微量模板dna的检测而常应用于定量检测肿瘤基因的甲基化情况。同传统的fobt和cea等crc相关肿瘤标志物相比，基于qpcr方法的外周血septin9 基因甲基化检测不仅具有较高的灵敏度和特异性，还能克服由于病变位置导致的灵敏度差异。2018年一项评估结直肠癌患者血液标志物的研究中，li等发现msept9(methylated septin9，msept9)的总体灵敏度为61.8％，特异性为89.6％，auc值为0.757。在此项研究中，通过与传统的血液肿瘤标志物cea、 ca-199相比，msept9具有较高的诊断价值。在另一项研究中，73.3％的crc 患者septin9阳性，特异性为94.5％，高于fobt在crc中的筛查价值。然而 qpcr技术也有其局限性，具体表现为在检测低浓度样本时灵敏度较低、精密性和重复性较差等，这些局限性是由qpcr技术本身的瓶颈所造成的。体液中的靶分子浓度极低，如健康人血浆中的浓度为5～20ng/ml，这已成为基于甲基化dna片段进行癌症诊断的主要障碍。
技术实现要素：
3.针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种锁核酸修饰的septin9 基因甲基化检测方法，以解决背景技术中提出的问题。
4.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
5.本发明提供一种锁核酸修饰的septin9基因甲基化检测方法，(1)在ncbi 数据库查septin9甲基化的cpg岛位点，并通过methprimer和methbank进行序列转换和高甲基化位点预测后设计引物和探针；
6.(2)提取结直肠癌细胞hct116的dna，pcr扩增并测序确认septin9 基因启动子区高甲基化位点，同时构建质粒标准品；
7.(3)使用rt-qpcr技术验证引物、探针构建甲基化检测体系的特异性；
8.(4)qpcr检测平台上测试不同引物/探针浓度、退火/延伸温度和变性/ 退火/延伸时间，优化qpcr检测septin9基因方法；
9.(5)进行qpcr检测反应体系方法学的评价包括线性范围、灵敏度、特异性、重复性；
10.使用优化后的qpcr反应体系检测不同浓度甲基化质粒标准品，确定体系的线性范围；
11.通过检测阳性对照和阴性对照并加设不加入模板的空白对照，判断体系的特异性；
12.取高、中、低三种浓度的质粒标准品作同批次重复和不同批次重复，分别计算批内及批间拷贝数值的变异系数，评价体系的重复性；
13.通过检测低浓度的甲基化质粒标准品，评价qpcr反应体系检测灵敏度；
14.将甲基化质粒与非甲基化质粒标准品混合成不同比例，计算实际突变比例和rt-qpcr检测计算得出比例的一致性，评价优化后的qpcr反应体系的准确性。
15.本发明的有益效果在于：
16.1、本发明设计了锁核酸修饰septin9基因引物和探针，提高了甲基化检测的特异性。
17.2、本发明通过优化引物、探针浓度，反应体系的变性时间、退火/延伸温度优化了septin9基因检测方法；优化后的方法增强了检测特异性，同时缩短了检测所有时间。
18.3、本发明建立了以高甲基化的细胞系为模板，构建了甲基化和非甲基化质粒标准品，并以此为模板验证了方法学性能。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为硫化处理后的septin9基因序列示意图；
21.图2为septin9基因测序结果，a、b非甲基化，c、d甲基化；
22.图3为探针特异性验证实验示意图；
23.图4为探针扩增效率验证实验示意图；
24.图5为不同引物浓度的扩增曲线图；
25.图6为不同探针浓度的扩增曲线图；
26.图7为不同退火延伸温度的扩增曲线图，a、b、c、e、f、g分别为57℃、 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；
27.图8为不同变性时间的扩增曲线图，a、b、c、e、f、g分别为5s、10s、 15s、20s、25s、30s；
28.图9为10
10-101copies/μl甲基化质粒标准品的扩增曲线图；
29.图10为10
10-101copies/μl甲基化质粒标准品的标准曲线图；
30.图11为10
11-100copies/μl甲基化/质粒标准品以及ddh2o的扩增曲线图；
31.图12为10
4-100copies/μl甲基化质粒标准品的扩增曲线图；
32.图13为103、105、107copies/μl甲基化质粒标准品的扩增曲线图；
33.图14为103、105、107copies/μl甲基化质粒标准品20次qpcr的扩增曲线图；
34.图15为不同比例质粒标准品的扩增曲线；
35.图16为实际突变比例和rt.qpcr检测计算得出比例的一致性，(r2＝0.9987， p《0.0001)。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例：
38.本发明提供了一种锁核酸修饰的septin9基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
39.(1)在ncbi数据库查septin9甲基化的cpg岛位点，并通过methprimer 和methbank进行序列转换和高甲基化位点预测后设计引物和探针；
40.(2)提取结直肠癌细胞hct116的dna，pcr扩增并测序确认septin9 基因启动子区高甲基化位点，同时构建质粒标准品；
41.(3)使用rt-qpcr技术验证引物、探针构建甲基化检测体系的特异性；
42.(4)qpcr检测平台上测试不同引物/探针浓度、退火/延伸温度和变性/ 退火/延伸时间，优化qpcr检测septin9基因方法；
43.(5)进行qpcr检测反应体系方法学的评价包括线性范围、灵敏度、特异性、重复性；
44.使用优化后的qpcr反应体系检测不同浓度甲基化质粒标准品，确定体系的线性范围；
45.通过检测阳性对照和阴性对照并加设不加入模板的空白对照，判断体系的特异性；
46.取高、中、低三种浓度的质粒标准品作同批次重复和不同批次重复，分别计算批内及批间拷贝数值的变异系数(cv)，评价体系的重复性；
47.通过检测低浓度的甲基化质粒标准品，评价qpcr反应体系检测灵敏度；
48.将甲基化质粒与非甲基化质粒标准品混合成不同比例，计算实际突变比例和rt-qpcr检测计算得出比例的一致性，评价优化后的qpcr反应体系的准确性。
49.具体的，本发明结合附图，进行进一步说明，
50.1.软件预测cg位点：
51.通过methprimer预测cpg岛，获得pcr的硫化dna模板，通过methbank 预测cpg岛和正常结直肠cg位点甲基化的频率。
52.以硫化dna为模板，使用oligo7在crc患者差异性cg位点上设计引物、探针，如下表1所示，所得亚硫酸盐处理后的septin9基因序列如图1所示。
53.注：“+”为锁核酸修饰位置。
[0054][0055]
表1
[0056]
2.制定质粒标准品
[0057]
如图2所示，
[0058]
提取结直肠癌细胞基因组dna后进行亚硫酸盐转化(ezdnamethylation-gold
tm
kit)，以此为模板，使用表1的引物进行pcr扩增，产物经过回收(tianquickminipurificationkit)后连接t载体(takarapmd
tm
18-tvectorcloningkit)，并将其转化至dh5α感受态大肠杆菌；
[0059]
过夜培养后，挑取单菌落进行pcr及琼脂糖凝胶电泳鉴定，通过菌落测序验证产物序列。同时，提取质粒dna，获得甲基化标准品和非甲基化标准品。
[0060]
3.验证反应体系特异性
[0061]
如图3-图4所示，
[0062]
采用引物和探针浓度为200nm(表1)所构成的反应体系检测不同浓度的甲基化质粒标准品；体系的特异性和扩增效率分别为图3和图4。
[0063]
4.最适引物、探针浓度
[0064]
如图5-图6所示，
[0065]
甲基化质粒标准品浓度为105copies/μl，探针浓度为200nm时，测试最佳引物浓度；根据ct值和rn值判断引物浓度200nm为最适引物浓度，如图5所示；
[0066]
甲基化质粒标准品浓度为105copies/μl，引物浓度200nm时，测试最佳探针浓度；根据ct值和rn值判断探针浓度为100nm为最适探针浓度，如图6所示。
[0067]
5.最适反应条件
[0068]
如图7-图8所示：
[0069]
5.1甲基化质粒标准品浓度为105copies/μl，退火/延伸温度分别为57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，根据ct值和rn值判断58℃为最适退火/延伸温度，如图7所示；
[0070]
5.2甲基化质粒标准品浓度为105copies/μl，变性时间分别为5s，10s，15s，20s，25s，30s，根据ct值和rn值判断5s最适变性时间，如图8所示。
[0071]
6.方法学评价
[0072]
如图9-图16所示：
[0073]
6.1线性范围
[0074]
将甲基化质粒标准品稀释至10
10-101copies/μl评价，优化后的qpcr反应体系线性范围；
[0075]
自建方法的线性范围为10
10-101copies/μl，如图9所示；标准曲线公式为：y＝-3.87x+46.442，如图10所示。
[0076]
6.2特异性
[0077]
将甲基化质粒标准品与非甲基化质粒标准品稀释至10
11-100copies/μl，以ddh2o作为空白对照，评价qpcr反应体系特异性；
[0078]
在浓度范围内，甲基化质粒标准品呈对数扩增曲线，非甲基化质粒标准品和空白对照无对数扩增曲线，反应体系特异性较好，如图11所示。
[0079]
6.3灵敏度
[0080]
将甲基化质粒标准品稀释至10
4-100copies/μl，每个浓度重复3次，评价qpcr反应体系检测灵敏度；
[0081]
甲基化质粒标准品在101copies/μl以下，不再有对数扩增曲线，qpcr反应体系的检测灵敏度为101copies/μl，如图12所示。
[0082]
6.4重复性
[0083]
6.4.1批内重复性
[0084]
甲基化质粒标准品浓度为103、105、107copies/μl，同一个反应中重复20 次，评价优化后的qpcr反应体系的批内重复性；107copies/μl、105copies/μl、 103copies/μl批内变异系数分别为0.92％、0.69％、0.69％，如图13所示。
[0085]
6.4.2批间重复性
[0086]
甲基化质粒标准品浓度为103、105、107copies/μl，重复20次qpcr反应，评价优化后的qpcr反应体系的批间重复性；107copies/μl、105copies/μl、 103copies/μl批间变异系数分别为3.95％、3.01％、1.47％，如图14所示。
[0087]
6.5准确性
[0088]
将107copies/μl的甲基化质粒与非甲基化质粒标准品混合成不同比例，评价优化后的qpcr反应体系的准确性。
[0089]
实际突变比例和rt-qpcr检测计算得出比例的一致性较好，如图15-图16 所示。
[0090]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
技术特征：
1.一种锁核酸修饰的septin9基因甲基化检测方法，其特征在于，(1)在ncbi数据库查septin9甲基化的cpg岛位点，并通过methprimer和methbank进行序列转换和高甲基化位点预测后设计引物和探针；(2)提取结直肠癌细胞hct116的dna，pcr扩增并测序确认septin9基因启动子区高甲基化位点，同时构建质粒标准品；(3)使用rt-qpcr技术验证引物、探针构建甲基化检测体系的特异性；(4)qpcr检测平台上测试不同引物/探针浓度、退火/延伸温度和变性/退火/延伸时间，优化qpcr检测septin9基因方法；(5)进行qpcr检测反应体系方法学的评价包括线性范围、灵敏度、特异性、重复性；使用优化后的qpcr反应体系检测不同浓度甲基化质粒标准品，确定体系的线性范围；通过检测阳性对照和阴性对照并加设不加入模板的空白对照，判断体系的特异性；取高、中、低三种浓度的质粒标准品作同批次重复和不同批次重复，分别计算批内及批间拷贝数值的变异系数，评价体系的重复性；通过检测低浓度的甲基化质粒标准品，评价qpcr反应体系检测灵敏度；将甲基化质粒与非甲基化质粒标准品混合成不同比例，计算实际突变比例和rt-qpcr检测计算得出比例的一致性，评价优化后的qpcr反应体系的准确性。
技术总结
本发明公开了一种锁核酸修饰的septin9基因甲基化检测方法，本发明通过引入锁核酸技术优化引物和探针，提高甲基化等位基因的特异性结合，从而优化体系扩增效率，同时通过优化反应体系和反应条件建立具有高灵敏度的人Septin9甲基化检测方法；本发明建立Septin9基因甲基化和非甲基化质粒标准品，以此为模板DA分析Septin9甲基化检测方法学的性能，并对反应体系的线性范围、特异性、灵敏度、重复性、准确性进行验证。本发明有效的提高了甲基化检测的特异性，缩短了检测的时间，验证了方法学性能。性能。性能。
