一种甾体磷酸酯化合物及其应用的制作方法
1.本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一类几乎无肝毒性的甾体类磷酸酯衍生物，其作为雄性激素抗体抑制剂的制备方法以及它们的医药用途，特别是在预防和雄性激素受体相关的疾病，如前列腺癌的药物用途。
背景技术：
2.雄激素受体(androgenic receptor，ar)属于核受体家族，包含有四个主要区域：n端活性转录控制区域(ntd)，dna结合区域(dbd)，铰链区及配体结合区(lbd)。ar主要在雄激素靶组织例如前列腺骨骼肌、肝脏和中枢神经系统中表达。在前列腺、肾上腺和附睾中观察到最大表达水平。ar可以由包括睾酮和5α-二氢睾酮(5α-dht)在内的内源性雄激素的结合来激活。
3.前列腺癌(prostate cancer，pca)是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。前列腺癌的发病率具有明显的地理差异。在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位；在亚洲，其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势。目前我国的前列腺癌发病率呈逐年升趋势，且发现时以多呈中晚期。
4.pca的发生、发展与雄激素密切相关，内分泌是目前晩期前列腺癌的主要治方法。雄性激素受体拮抗剂(ar antagonist)药物例如尼鲁米胺 (nilutamide)、氟他胺(flutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide，商标名casodex) 的最初设计是用来避免激素疗法的副作用以及消除前列腺癌病人的耐药性。尽管这些雄性激素受体拮抗剂在与激素疗法配合使用时对首次接受的晚期前列腺癌病人效果良好，但无论作为单独使用还是复合疗法它们对抗药性的前列腺癌疗效十分有限。近年来研究表明，比卡鲁胺作为雄激素受体(ar)拮抗剂的特异性较弱，并有一定的激活受体作用(agonism)(氟他胺也被发现有类似的问题)。最新硏究显示雄性激素受体信号通道的重新活化可能是对激素疗法产生抗药性的根本原因，其限制了目前市场普遍使用的雄性激素受体拮抗剂药物例如比卡鲁胺前列腺癌的疗效，特别是对于晩期抵抗性前列腺癌。此外，这些雄性激素受体拮抗剂药物的疗效还普遍受限于它们显著的副作用，例如对肝脏或中枢神经系统有毒性。所以，前列腺癌临床迫切需要高活性低毒性且无残余激活性质(agonism)的新一代雄性激素受体拮抗剂。
5.许多皮质类固醇已经用作抗炎剂、抗风湿剂、抗过敏剂和抗休克剂。特别地，11-脱氧-皮质醇酯及其衍生物已经广泛用作抗炎剂。含有不多于六个碳原子的羧酸17或21单酯也是已知的。
6.例如，17α,21-二乙酰氧基孕-4-烯-3,20二酮的制备公开于us3,530,038，该文献也提及丙酰基衍生物和一系列含有至多六个碳原子链的脂族酰基衍生物的用途。
7.us3,152,154公开了21-羟基孕-4,9-二烯-3,20-二酮-17α-丁酸酯的制备，该化合物用作3,21-二酰氧基-17α-丁酰氧基孕-3,5,9-三烯-20-酮制备的中间体，其中3和21酰基是相同的并且是乙酰基、丙酰基、丁酰基和异丁酰基。在这些文献中引用的所有实施例涉及
其中17α和21位由相同的酰基酯化的化合物。
8.作为混合酯的唯一实施例，21-乙酰氧基孕-4-烯-3,20-二酮-17α二甲基丙酸酯的制备描述于liebigs ann.chem.1983,705-71：作者说明仅当21位中的取代基是乙酰基时，混合酯的制备是可能的。
9.us3,530,038公开了11β-17α-21-三羟基类固醇的制备方法，该方法包括将 11-脱氧-17α-or-21-or’类固醇，其中r是1-18个碳原子的羧酸残基和r’是氢或1-18个碳原子的酰基，用弯孢属的微生物进氧化，用于获得相应的11β
‑ꢀ
羟基类固醇。
10.根据相同的专利，孕烷、雄烷或雌烷系列化合物提及为可能的起始类固醇，但没有提及其中r是1-18个碳原子的酰基和r’是氢的11脱氧-17α-or-21
‑ꢀ
or’类固醇的任何转化。
11.这些产物的制备由r.b.turner参考孕-4-烯-3,20-二酮-17α,21-二乙酸酯的制备描述(j.am.chem.soc.75(1953)3489)并由r.gardi等人描述(gazz.chim. it.93(1963)431-450)。
12.us3,780,177公开了借助原丁酸酯的21-羟基-孕-4,9-二烯3,20-二酮-17a
‑ꢀ
丁酸酯的制备及其作为6α,9α-二氟强的松龙-17-丁酸酯-21酯衍生物的制备中间体的用途。
13.最后cn1246328c公开了17α,21-二羟基孕烯的混合酯的制备和用途，并且描述了具有相同脂族链的17和21酰基衍生物，该脂族链含有不多于四个碳原子。
14.综上，所公开的内容中没有甾体类磷酸衍生物是已知的，特别的没有 17α,21-二羟基孕烯的混合酯涉及磷酸类衍生物是已知的。
15.本发明中，在化学结构上取代如21位羟基被磷酸类衍生物取代后能提高特异性并降低现在临床上使用的雄性激素受体拮抗剂药物的副作用(例如对肝脏或中枢神经系统的毒性)，这些化合物能与雄激素受体结合，抑制受体向细胞核内移动和降低其转录活性，有望成为晚期前列腺癌的雄性激素受体拮抗候选药物。
技术实现要素：
16.本发明人开发了一种式(ⅰ)所示甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐及其互变异构体，
[0017][0018]
式(ⅰ)中，
[0019]
r0选自下列基团或原子：h、-och2och3、-och3、-oac、-oh、＝noh、＝nh、或＝o；
[0020]
虚线表示有无双键；
[0021]
y选自o或s；
[0022]
r1和r2分别独立地选自阳离子、氢、或被一个或多个基团a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c1-c12烷氨基、 3-8元环烷基、3-8元杂环、c5-c20芳基；
[0023]
或者，r1和r2相连，共同与p及与r1、r2分别相连的o共同组成5-7 元环；
[0024]
r3选自被一个或多个基因a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、 c1-c12烷酰基、c5-c20芳基、或芳酰基。
[0025]
基团a选自：卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基、羟基、c1-c8 的烷基、c1-c8的烷氧基、c1-c8的烷氨基、c1-c8的烷基羰基、c1-c8的烷氧羰基、c1-c8的烷基羰氧基、3-8元环烷基。
[0026]
本发明的方案中，虚线表示有无双键，即相连的原子可以是单键，也可是双键。
[0027]
本发明的一些方案中，r0选自：h、-och2och3、-och3、-oac、-oh，此时，r0与相连的碳原子成单键；
[0028]
本发明的一些方案中，r0选自：＝noh、＝nh、或＝o，此时，r0与相连的碳原子成双键。
[0029]
本发明的一些方案中，上述y选自o或者s；优选地，y是o。
[0030]
本发明的一些方案中，上述其药学上可接受的盐及其互变异构体，所述甾体磷酸酯化合物如结构式(ⅱ)，
[0031][0032]
其中，式(ii)中取代基的定义如式(i)所定义的。
[0033]
本发明的一些方案中，r1和r2均为氢；
[0034]
本发明的一些方案中，r1和r2选自阳离子；
[0035]
本发明的一些具体方案中，上述r1和r2分别独立的选自金属阳离子；优选的，r1和r2分别独立的选自：li
+
、na
+
、k
+
、zn
2+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
；
[0036]
本发明的一些具体方案中，上述r1和r2分别独立的选自季铵盐类或铵根离子；优选的，r1和r2分别独立的选自n(c1-c4-烷基或取代烷基)
4+
；
[0037]
本发明的一些具体方案中，上述r1和r2分别独立的选自被一个或多个基因a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、 c1-c12烷氨基、3-8元环烷基、
3-8元杂环、c5-c20芳基；
[0038]
本发明的一些具体方案中，上述r1和r2分别独立地选自：c1-c4烷基、c1-c4烷氨基、c1-c4烷基苯基、c1-c4烷基杂环、c1-c4烷基芳基、、
[0039]
本发明的一些方案中，r1和r2相连，与p及与r1、r2分别相连的o 共同组成5-7元环。
[0040]
本发明的一些方案中，上述r3选自被一个或多个基因a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、c1-c12烷酰基、c5-c20芳基、或芳酰基；优选的， r3选自c
1-c8酰基；更优的，r3选自丙酰基。
[0041]
本发明的方案中，基团a选自：卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、氰基、羟基、c1-c8的烷基、c1-c8的烷氧基、c1-c8的烷氨基、c1-c8的烷基羰基、c1-c8的烷氧羰基、c1-c8的烷基羰氧基、3-8元环烷基。
[0042]
本发明的甾体磷酸酯化合物，其选自：
[0043][0044]
[0045]
本发明的某些甾体磷酸酯化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
[0046]
本发明的某些甾体磷酸酯化合物可以具有不对称碳原子(光学中心)或双键。外消旋体、对映体、非对映体、立体异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。
[0047]
定义和说明：
[0048]
下文是本说明中使用的术语定义。为本文的基团或术语所提供的初始的定义单独的或作为其它基团的一部分应用于本说明书全篇中的基团或术语，另有指示除外。
[0049]
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0050]
术语“烷基”和“烷”指含有1-12个碳原子的饱和烃，包含直链、支链或环烷烃。示例性的“烷基”包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、正己基、庚基、辛基、环丙基等。
[0051]
术语“烯基”指含有2-12个碳原子和至少一条碳-碳双键的直连或支链烃基。示例性的这类基团包括乙烯基或烯丙基。
[0052]
术语“炔基”指含有2-12个碳原子和至少一条碳-碳三键的直连或支链烃基。示例性的这类基团包括乙炔基。
[0053]
术语“芳基”指含有1-5个芳族环的环状芳族烃基，尤其是单环或双环基团，且包含5-20个碳原子。示例性的这类基团包括苯基、联苯基或萘基等等。如果含有两个或多个芳族环(双环等)，则芳基的芳族环可以在单一点上连接 (例如联苯基)或者稠合的(例如萘基、菲基等)。
[0054]
术语“杂环”指在至少一个含碳原子的环中具有至少一个杂原子的完全饱和或者部分不饱和或完全不饱和的、包括芳族(即“杂芳族”)的3-8元环状基团。含杂原子的杂环基的每个环可以具有1、2、3或者4个选自氮原子、氧原子和/或刘园子的杂原子，其中氮和硫杂原子可以任选被氧化和但杂原子可以任选被季铵化。示例性的单环杂环基包括但不限于氮杂环丁基、吡咯烷基、吡咯基、氧杂环丁基。吡咯啉基、咪唑基。咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基，噁唑烷基、异恶唑啉基、异恶唑基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基等等。
[0055]
术语“烷氧基”指烷基与氧原子相连的基团；
[0056]
术语“烷氨基”指烷基与氮原子相连的基团。
[0057]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明甾体磷酸酯化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的甾体磷酸酯化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的甾体磷酸酯化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得
酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的甾体磷酸酯化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
[0058]
优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体甾体磷酸酯化合物，由此再生甾体磷酸酯化合物的中性形式。甾体磷酸酯化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
[0059]
本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明甾体磷酸酯化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体甾体磷酸酯化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体甾体磷酸酯化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟基、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。
[0060]
术语“手性的”是指具有镜像配偶体的不可叠加性质的分子，而术语“非手性的”是指可以在其镜像配偶体上可叠加的分子。
[0061]
术语“立体异构体”指具有同一化学构成，但是原子或基团在空间的排列不同的化合物。
[0062]
术语“非对映体”指具有两个或更多个手性中心并且其分子互相不是镜像的立体异构体。非对映体具有不同的物理性质，例如熔点，沸点，光谱性质，和反应性。非对映体的混合物在高分辨率的分析方法下，例如电泳和谱法，可以分离。
[0063]
术语“”，是指在某种程度上它涉及一种疾病或状况，包括预防疾病或状况发生，抑制疾病或状况，消除疾病或状况，和/或解除疾病或状况的一种或多种症状。
[0064]
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体甾体磷酸酯化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些甾体磷酸酯化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
[0065]
本发明中公开的新型甾体磷酸酯类化合物，除具有更高的列腺癌细胞的抑制效果外，经肝毒性试验，惊喜的发现，这一系列的化合物能够明显降低现在临床上使用的雄性激素受体拮抗剂药物的通常出现的肝毒性副作用，这些化合物有望成为晩期前列腺癌的雄性激素受体拮抗改良型候选药物。
附图说明
[0066]
图1表示的是本发明肝毒性试验结果：a.空白组b.阿比特龙高剂量组c. 化合物ar01-1高剂量组d.化合物ar01-3高剂量组e.化合物ar01-9高剂量组。
具体实施方式
[0067]
这里，例如在下面的实施例中提供了本发明的甾体磷酸酯化合物的许多示例性制备方法。下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。本发明的某些能够用作制备本发明的其它化合物用的中间体。
[0068]
使用可商购的化合物ar01-1-1、氯化镁、氯化锌、碳酸氢铵、碳酸氢钠、焦磷酰氯、氯磷酸二乙酯、氯膦酸二苄酯、氯膦酸二苯酯作为起始物料合成本发明甾体磷酸酯化合物。
[0069]
实施例1：(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(2-(膦酰基) 乙酰基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊酸菲-17-基丙酸盐 (化合物ar01-1)
[0070]
合成路线：
[0071][0072]
制备方法：
[0073]
氮气保护下将的四氢呋喃(100ml)和化合物(ar01-1-1)(8.05g， 20.0mmol)(ar01-1-1)加入反应瓶中，降温至-40℃～-30℃。将焦磷酰氯(6.04g， 24.0mmol)加入至四氢呋喃(10ml)中，缓慢滴入反应瓶，滴加过程中反应液温度应保持在-40℃～-30℃，保温搅拌反应，tlc监测反应完全后，向体系缓慢加入水(20ml)，升温至0c～5℃，待水解完成后，加碳酸氢钠调节ph值为7-8，加入甲苯(50ml)，分层，水相用盐酸调ph＝3～4，过滤，干燥，得化合物ar01-1粗品，将粗品加入到甲基叔丁基醚/1,2-甲氧基丁烷(1:2)中，升温至45℃，保温搅拌反应，反应结束后缓慢降至室温，过滤，干燥得ar01-1精制品(8.27g)，收率85.7％。esi-ms(+):m/z＝482.9。1h nmr(cdcl3)：δ5.77(s,1h)， 4.60～4.87(m,2h)，3.44～3.56(m,1h)，2.85(s,1h)，0.70～2.43(m,30h)。
[0074]
实施例2：2-((8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(丙酰氧基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烷[a]菲-17-基)-2-氧乙基磷酸酯二钠盐的制备(化合物ar01-2)
[0075]
合成路线：
[0076][0077]
制备方法：
[0078]
取上述实施例1制备所得化合物ar01-1(9.66g，0.02mol)加入到30ml 乙醇中，冷却至0～10℃，滴加溶有3.4g碳酸氢钠(0.04mol)的水溶液10ml，维温反应，待反应完毕，20～30℃减压蒸出乙醇，加入20ml丙酮，析晶，过滤，干燥，得ar01-2(9.24g)，收率87.8％。esi-ms(+):m/z＝549.18。
[0079]
实施例3：2-((8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(丙酰氧基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烷[a]菲-17-基)-2-氧乙基磷酸酯锌盐的制备(化合物ar01-3)
[0080]
合成路线：
[0081][0082]
制备方法：
[0083]
取上述实施例2制备所得化合物ar01-2(10.52g，0.02mol)加入到20ml 水中中，20～30℃下，滴加溶有1.36g氯化锌(0.01mol)的水溶液10ml，维温反应，反应过程析出固体，待反应完毕，过滤，干燥，得ar01-3(9.96g)，收率91.2％。esi-ms(+):m/z＝567.10。
[0084]
实施例4：2-((8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(丙酰氧基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烷[a]菲-17-基)-2-氧乙基磷酸酯镁盐的制备(化合物ar01-4)
[0085]
合成路线：
[0086]
[0087]
制备方法：
[0088]
参考实施例3合成工序，以氯化镁替换氯化锌，合成化合物ar01-4(3.21g)，收率88.2％。esi-ms(+):m/z＝527.20。
[0089]
实施例5：2-((8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(丙酰氧基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烷[a]菲-17-基)-2-氧乙基磷酸酯二氨盐的制备(化合物ar01-5)
[0090]
合成路线：
[0091][0092]
制备方法：
[0093]
参考实施例2，以碳酸氢铵替换碳酸氢钠，合成化合物ar01-5(2.11g)，收率86.3％。esi-ms(+):m/z＝539.28
[0094]
实施例6：(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-(2-(二乙氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-10,13-二甲基-3-氧基-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊酸菲-17-基丙酸盐的制备(化合物ar01-6)
[0095]
合成路线：
[0096][0097]
制备方法：
[0098]
化合物ar01-1-1(4.03g，10mmol)、dmap(0.12g，1mmol)和三乙胺 (1.1g，11mmol)溶于thf(100ml)中。通过注射器在30分钟内加入氯磷酸二乙酯(1.9g，11mmol)。使混合物在室温下反应过夜。然后用饱和nh4cl 水溶液淬火混合物，用甲基叔丁基醚(75mlx3)萃取。将合并的有机相在无水na2so4上干燥，然后浓缩得到粗产物，其通过柱层析(用石油洗脱)纯化 ether:ethyl acetate＝5:1-2:1)，得产物ar01-6(3.65g)，收率67.7％。esi
‑ꢀ
ms(+):m/z＝539.29。
[0099]
实施例7：(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-(2-(二苯氧磷酰基)氧基)乙酰基)
‑ꢀ
10,
13-二甲基-3-氧基-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊酸菲
‑ꢀ
17-基丙酸盐的制备(化合物ar01-7)
[0100]
合成路线：
[0101][0102]
制备方法：
[0103]
以氯膦酸二苯酯替换氯磷酸二乙酯，参考实施例6合成工序，制备得化合物ar01-7(1.23g)，收率63.9％。esi-ms(+):m/z＝635.28。
[0104]
实施例8：(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-(2-(二(苄氧基)磷酰基)氧基)乙酰基)-10,13-二甲基-3-氧基-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊酸菲酯的制备(化合物ar01-8)
[0105]
合成路线：
[0106][0107]
制备方法：
[0108]
以氯膦酸二苄酯替换氯磷酸二乙酯，参考实施例6合成工序，制备得化合物ar01-8(1.43g)，收率66.2％。esi-ms(+):m/z＝663.32。
[0109]
实施例9：2-((8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-3-氧代-17-(丙酰氧基)-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊烷[a]菲-17-基)-2-氧乙基磷酸酯二银盐的制备(化合物ar01-9)
[0110]
合成路线：
[0111][0112]
制备方法：
[0113]
参考实施例3合成工序，以硝酸银替换氯化锌，合成化合物ar01-9(0.94g)，收率85.7％。esi-ms(+):m/z＝695.02。
[0114]
实施例10：(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-10,13-二甲基-17-(2-(2-氧化-1,3,2
‑ꢀ
二氧磷酚-2-基)氧基)乙酰基)-3-氧代-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢
ꢀ‑
1h-环戊酸菲-17-基丙酸盐的制备(化合物ar01-10)
[0115][0116]
化合物ar01-10-sm的制备：
[0117]
完全按照文献tetrahedron:asymmetry 11(2000)125
–
138所描述的方法合成化合物ar01-10-sm。
[0118]
化合物ar01-10的制备：
[0119]
以化合物ar01-10-sm替换氯磷酸二乙酯，参考实施例6合成工序，制备得化合物ar01-10(1.33g)，收率62.1％。esi-ms(+):m/z＝523.25。
[0120]
为了阐明本发明的化合物显示出已知于临床应用的一线抗雄激素药物(例如阿比特龙)，提高了活性，并降低临床上使用的雄性激素受体拮抗剂药物的副作用(例如对肝脏的毒性)，设计一系列的体外研究。
[0121]
实施例11：对前列腺癌细胞的抑制活性测试
[0122]
前列腺癌22rv1细胞按照5000个细胞/孔，加入到平底96孔细胞培养板中，体积为100μl，贴壁生长12h后，加入测试化合物，终体积200μl；测试化合物从最高100um浓度开始，2倍浓度梯度稀释，共6个浓度；培养48h 后，加入10μl cell counting kit-8细胞计数试剂(cck-8)，孵育4h后，使用酶标仪检测450nm吸收值。使用graphpadprism5.0计算化合物ic50值，结果如表1所示：
[0123]
表1不同化合物抑制前列腺癌细胞试验结果数据表
[0124]
化合物名称ic50(μm)阿比特龙＞50ar01-15.5ar01-214.2ar01-37.2ar01-410.2ar01-57.9ar01-621.5ar01-714.2ar01-85.3ar01-94.8ar01-1011.8
[0125]
从表1中可以看出，本发明的系列化合物相对阿比特龙均具有显著前列腺癌细胞抑制活性。
[0126]
实施例12：小鼠前列腺癌模型试验
[0127]
spf级昆明小鼠(km小鼠)，雄性，6-7周龄，体重15-20g。将小鼠分为荷瘤对照组及给药组，收集处于对数生长期的rm-1细胞，接种细胞密度为 5
×
106cells/ml，用75％酒精擦拭小鼠右前肢腋窝处，每只注射0.2ml。成瘤后，荷瘤对照组每天口腔注射生理盐水200μl，给药组分别口腔注射阿比特龙、 ar01-1、ar01-2、ar01-3、ar01-4、ar01-5、ar01-6、ar01-7、ar01-8、 ar01-9、ar01-10各0.04mg/g，给药30天后脱颈处死小鼠，分离皮下肿瘤称重。将给药物处理的一组大鼠的瘤重与荷瘤对照组的瘤重进行对照比较，计算肿瘤抑制作用百分比。结果如表2所示。
[0128]
抑瘤率％＝(荷瘤对照组瘤重-化合物样品瘤重)/荷瘤对照组瘤重*100％
[0129]
表2小鼠前列腺癌细胞抑制作用
[0130]
化合物名称瘤重(g)抑瘤率％荷瘤对照组5.02/阿比特龙3.5130.1ar01-10.7385.5ar01-22.4750.8ar01-30.8084.1ar01-41.9361.6ar01-52.1257.8ar01-62.0259.8ar01-71.3573.1ar01-81.6666.9ar01-90.5489.2ar01-102.4451.4
[0131]
由表2小鼠的前列腺癌抑制试验数据显示，相对于阿比特龙的30.1％的抑瘤率，本发明化合物ar01-1、ar01-2、ar01-3、ar01-4、ar01-5、ar01
‑ꢀ
6、ar01-7、ar01-8、ar01-9、
ar01-10的抑制前列腺肿瘤的抑瘤率均大于 50％，其中，化合物ar01-1、ar01-3、ar01-9的抑制前列腺肿瘤的抑瘤率大于80％，显示出显著的抑制前列腺癌的作用。
[0132]
实施例13：肝毒性试验检测：
[0133]
取无特定病原体(spf)级sd大鼠(120～140g)130只，雌雄各半。饲养环境: 温度20～25℃，湿度40％～70％，雌雄分开，每笼5只。按随机分配法分为，空白对照组1组(10只)，阿比特龙1组，实验组3组，每组10只，阿比特龙组和实验组分为低、中、高3个剂量组。以阿比特龙临床常用剂量为依据，按成人(60kg)处方日推荐用量(1.0g)的临床等效量的4、2、1倍设计，设定高、中、低剂量分別为66.8mg/kg、33.4mg/kg、16.7mg/kg；空白对照组(等体积蒸馏水)，阿比特龙组和实验组每日灌胃给药1次(1ml/100g大鼠体质量)，每周称体质量1次，根据体质量调整药量，连续给药60d。
[0134]
试验方法：
[0135]
(1)一般状况观察:每周称体质量1次，每天观察用药后大鼠精神状态、毛、进食、排泄物、活动等情况。
[0136]
(2)血常规检测：分别于用药后20、40、60d采集大鼠血液,检测血常规。
[0137]
(3)肝功能检测：最后1次给药前12h禁食，正常饮水，空白对照组，等体积蒸馏水，其他各剂量组大鼠灌胃给药，2h后取大鼠眼球静脉血，静置30min 后离心，取上层血清，按相关试剂盒说明书要求进行检测，测定谷丙转氨酶 (alt)、和谷草转氨酶(ast)活性。
[0138]
(4)组织病理学检测：
[0139]
大鼠取血后立即解剖大鼠，取大鼠肝脏，将周围结缔组织剔除后放入生理盐水中漂洗，然后用滤纸拭干表面液体，称重并计算其肝脏指数(肝脏系数＝肝脏质量/体质量)
×
100％。另取肝脏右叶，以10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，用常规he染，光学显微镜下观察其组织形态学变化。分别于给药后20、 40、60d处死部分大鼠，摘取肝脏，观察其形态、颜、质地，并进行肝脏组织病理检查。
[0140]
数据处理：
[0141]
统计学处理应用spss13.0统计软件进行统计分析,组间比较使用t检验及方差分析，计量数据采用表示。p《0.05为差异有统计学意义。
[0142]
试验结果：
[0143]
(1)用药期间，大鼠进食、排泄物、活动情况较为正常，毛无明显异常变化，各组无病死例数。
[0144]
(2)阿比特龙组和实验组大鼠体质量在给药20、40、60d时体质量均在正常范围，各组之间比较，差异无统计学意义(p≥0.05)。结果见表3。
[0145]
表3各组大鼠给药60d体质量变化(g,n＝10)
[0146][0147]
(3)血常规检测
[0148]
大鼠在给药20、40d时血常规各指标均在正常范围内，阿比特龙组与实验组的各剂量组与空白组之间比较，差异无统计学意义p》0.05)；给药60d时，阿比特龙组与空白组之间比较，出现显著差异，而实验组的各剂量组血常规各指标在正常范围内，与空白组之间，差异也无统计学意义(p》0.05)。结果见表 4。
[0149]
表4大鼠给药60d时血常规检测结果比较(n＝10)
[0150][0151]
(4)肝功能检测
[0152]
与空白组比较，阿比特龙组大鼠血清ast、alt数值均处于较高范围内，而不同化合物各剂量组血清ast、alt内水平较为正常,与空白组之间比较，差异也无统计学意义(p》0.05)，但是能够发现，随着剂量的增大，ast、alt 数值逐渐增大，成一定剂量依赖关系。结果见表5。
[0153]
表5大鼠给药60d时肝功能检测结果比较(n＝10)
[0154]
[0155][0156]
(5)肝/体比值
[0157]
与空白组对比，阿比特龙组各剂量组均导致了肝/体比值增加,而实验组各剂量均没有出现显著差异(p＞0.05)。结果见表6。
[0158]
表6大鼠给药60d时肝脏器指数结果比较(n＝10)
[0159]
[0160][0161]
(6)肝脏组织病理学检测
[0162]
肉眼观察：空白组和实验组的各剂量组大鼠肝脏，其形态正常，质地柔软，红润光泽，未见结节、包块、囊肿等。
[0163]
he染后光镜下观察：阿比特龙组各剂量组大鼠肝脏，出现不同程度损伤，主要表现为肝细胞肿胀，且有少部分可见小灶性或单细胞坏死，坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，伴炎症细胞浸润(阿比特龙高剂量见图b)；而空白组(空白组见图a)和实验组的各剂量组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞未见肿胀、坏死，中央静脉未见扩张，汇管区无增生，未见炎性细胞浸润，部分肝细胞可见小泡性脂肪变性，40d时部分肝细胞出现轻度浊肿，但各组之间比较，差异无统计学意义(p》0.05)；60d时肝小叶结构完整，肝细胞边界清晰，中央静脉未见扩张，汇管区无增生，未见炎性细胞浸润，部分肝细胞可见大、小泡性脂肪变性，部分肝细胞出现轻、中度水样变性，但各组之间比较，差异无统计学意义(p》0.05)(化合物ar01-1、化合物ar01-3和化合物ar01-9高剂量分别见图c、d和e)。见图1。
技术特征：
1.一种如式(ⅰ)所示甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，式(ⅰ)中，r0选自下列基团或原子：h、-och2och3、-och3、-oac、-oh、＝noh、＝nh、或＝o；虚线表示有无双键；y选自o或s；r1和r2分别独立地选自阳离子、氢、或被一个或多个基团a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c1-c12烷氨基、3-8元环烷基、3-8元杂环、c5-c20芳基；或者，r1和r2相连，共同与p及与r1、r2分别相连的o共同组成5-7元环；r3选自被一个或多个基因a取代或未取代的下列基团：c1-c12烷基、c1-c12烷酰基、c5-c20芳基、或芳酰基；基团a选自：卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基、羟基、c1-c8的烷基、c1-c8的烷氧基、c1-c8的烷氨基、c1-c8的烷基羰基、c1-c8的烷氧羰基、c1-c8的烷基羰氧基、3-8元环烷基。2.根据权利要求1所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，其中，r0选自h、-och3、-oh、＝noh或＝o，优选h或＝o。3.根据权利要求1或2所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，所述甾体磷酸酯化合物结构式(ⅱ)，
式(ii)中取代基的定义如权利要求1式(i)中所定义的。4.根据权利要求1-3中任一项所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，r3选自c1-c12烷酰基，优选地，r3选自c1-c8酰基。5.根据权利要求1-4中任一项所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，r1和r2分别独立的选自：碱金属阳离子、碱土金属阳离子、季铵盐类、铵根离子、锌离子、银离子；优选为li
+
、na
+
、k
+
、zn
+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
、铵根离子、或者n(c
1-c
4-烷基)
4+
。6.根据权利要求1-5中任一项所述的部分甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体，选自以下化合物中一种：
7.包含如权利要求1-6中任一项所述的甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药物组合物。8.权利要求1-6所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或互变异构体，及权利要求7的药物组合物在制备用于与雄性激素受体活性相关病症的药物中的用途。9.权利要求1-6所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或互变异构体，及权利要求7的药物组合物在制备用于对激素疗法敏感和/或不敏感的患者的前列腺癌的药物中的用途。10.权利要求1-6所述甾体磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或互变异构体，及权利
要求7的药物组合物在制备用于脱发或再生头发的药物中的用途。
技术总结
本发明公开了一类甾体磷酸酯化合物、药学上可接受的盐、互变异构体，及其制备方法、药物组合物和用途，该甾体磷酸酯化合物是一类几乎无肝毒性的化合物，可用于预防和雄性激素受体相关的疾病，如前列腺癌的药物用途。具体涉及式(Ⅰ)所示甾体磷酸酯化合物或其药学上可接受的盐，其中各取代基的定义详见说明书。其中各取代基的定义详见说明书。其中各取代基的定义详见说明书。
