毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用与流程
1.本发明涉及一种毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用，属于合成生物学领域。
背景技术：
2.现有技术通过单一的表达果糖基转移酶，将酶分离纯化固定后催化蔗糖生产低聚果糖，或者使用2次发酵技术分别表达果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶，然后将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶分别分离纯化固定后共同催化蔗糖生产低聚果糖。单一的表达果糖基转移酶再将酶分离纯化固定后催化蔗糖生产低聚果糖时，在反应过程中会产生葡萄糖副产物，对生产低聚果糖的反应有抑制作用，使得低聚果糖的转化率很低。在使用2次发酵技术分别表达果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶，然后将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶分别分离纯化固定后共同催化蔗糖生产低聚果糖时，发酵次数多，分离纯化步骤繁琐，使得发酵的效率低成本高。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种表面表达葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母。
4.本发明采取的技术方案为：
5.一种毕赤酵母，其特征在于其细胞表面表达如seq id no.7所示的蛋白。
6.本发明还公开了上述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。
7.优选的，其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。
8.本发明还公开了上述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：
9.(1)化学合成如seq id no.6所示的融合基因anc-l-gody-l-ftfx，其中融合基因序列包含毕赤酵母锚定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基转移酶基因序列，毕赤酵母锚定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基转移酶基因序列三者以融合基因形式连接，毕赤酵母锚定蛋白基因序列与葡萄糖氧化酶基因序列之间有连接肽序列，葡萄糖氧化酶基因序列与果糖基转移酶基因序列之间有连接肽序列，融合基因序列两端包含ecori和not1的酶切位点序列，以及载体ppic9k的同源臂序列；
10.(2)将步骤(1)合成的融合基因片段和载体ppic9k分别经ecori和not1双酶切；
11.(3)将酶切后的融合基因片段与酶切后的ppic9k载体连接，使融合基因构建到载体ppic9k中；
12.(4)将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；
13.(5)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒ppic9k-anc-l-gody-l-ftfx；
14.(6)将质粒ppic9k-anc-l-gody-l-ftfx线性化；
15.(7)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面表达葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母。
16.优选的，步骤(3)中采用t4 dna连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的ppic9k载体。
17.优选的，步骤(6)中将质粒用saci酶切线性化。
18.本发明具有以下有益效果：
19.本发明将葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶展示在毕赤酵母表面，采用该毕赤酵母全细胞催化生产低聚果糖，在生产的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，可以有效提高低聚果糖的转化率。且本发明还发现，表面展示葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母比果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶融合酶的毕赤酵母在催化生产低聚果糖时酶活更高，低聚果糖的转化率更高。因此，本发明的毕赤酵母可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。
附图说明
20.图1为本发明与现有技术相比的流程对照图。
21.图2为本发明与现有技术相比的低聚果糖转化率对照图。图中标记：a：对比例1中使用表面展示果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶的毕赤酵母全细胞催化蔗糖产低聚果糖，转化率约为50％；b：使用实施例1的表面展示葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶毕赤酵母全细胞催化蔗糖产低聚果糖，转化率达到60％以上；c：对比例2中单独使用果糖基转移酶分离纯化固定后催化蔗糖产低聚果糖，低聚果糖转化率约40％；d：葡萄糖对照；e：低聚果糖标准样对照；f：蔗糖对照。
具体实施方式
22.为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。附图1可以展示本发明与现有技术相比的流程对照。
23.对比例1将融合果糖基转移酶-连接肽-葡萄糖氧化酶展示在毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化生产低聚果糖的应用，包括如下步骤：
24.(1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因、果糖基转移酶基因和连接肽的序列，如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4；
25.(2)化学合成如seq id no.5所示的锚定蛋白-连接肽-果糖基转移酶-连接肽-葡萄糖氧化酶融合基因anc-l-ftfx-l-gody；融合基因序列两端包含ecori和not1酶切位点序列和载体ppic9k的同源臂序列；
26.(3)载体ppic9k均经ecori和not1双酶切，酶切体系如下：
[0027][0028]
(4)将带有同源臂的融合基因片段anc-l-ftfx-l-gody和酶切后的ppic9k载体重组，重组体系如下：
[0029][0030]
(5)将重组产物转化入大肠杆菌top10感受态细胞；
[0031]
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
[0032]
(7)pcr检测阳性克隆。菌检上游引物pf1:caaccaccatctcttcctttgc，下游引物pr1:gagccacggagatgttcaca；
[0033]
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-anc-l-ftfx-l-gody；
[0034]
(9)质粒均用saci酶切线性化，酶切体系如下：
[0035][0036]
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
[0037]
(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，5000rpm离心5min收集菌体；
[0038]
(12)将菌体涂布在his缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
[0039]
(13)通过3-5mg/ml g418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-anc-l-ftfx-l-gody；
[0040]
(14)将毕赤酵母工程菌p-anc-l-ftfx-l-gody转接入含有10-15ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至od600＝4-5；
[0041]
(15)5000rpm离心5min收集菌体；
[0042]
(16)菌体重悬于bmm培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱
导，培养4-5天，离心收集菌体；
[0043]
(17)以蔗糖为底物，使用全细胞催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖)+10mg全细胞
[0044]
反应时间：3h
[0045]
(18)跑plc检测酶切结果。结果如图2所示。
[0046]
对比例2单独表达果糖基转移酶的方法，包括如下步骤：
[0047]
(1)优化果糖基转移酶基因序列，如seq id no.3；
[0048]
(2)化学合成如seq id no.3所示的果糖基转移酶基因ftfx；基因序列两端包含ecori和not1酶切位点序列和载体ppic9k的同源臂序列；
[0049]
(3)基因片段和载体ppic9k均经ecori和not1双酶切，酶切体系如下：
[0050][0051]
(4)将基因片段与酶切后的ppic9k载体连接，连接体系如下：
[0052][0053]
(5)将连接产物转化入大肠杆菌top10感受态细胞；
[0054]
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
[0055]
(7)pcr检测阳性克隆。菌检上游引物pf1:actgtcgcaggaaatcagca，下游引物pr1:gcacctggggctactgaaat；
[0056]
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-ftfx；
[0057]
(9)质粒均用saci酶切线性化，酶切体系如下：
[0058][0059][0060]
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
[0061]
(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中，220rpm条件下进行
摇床培养1-2h，6000rpm离心5min收集菌体；
[0062]
(12)将菌体涂布在his缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
[0063]
(13)通过3-5mg/ml g418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌pftfx；
[0064]
(14)将毕赤酵母工程菌p-ftfx转接入含有10-15ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至od600＝4-5；
[0065]
(15)6000rpm离心5min收集菌体；
[0066]
(16)菌体重悬于bmm培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天；
[0067]
(17)离心去除菌体，得粗酶液；
[0068]
(18)酶纯化、固定；
[0069]
(19)以蔗糖为底物，使用果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖)+10u酶
[0070]
反应时间：3h
[0071]
(20)跑plc检测酶切结果。结果如图2所示。
[0072]
实施例1将融合葡萄糖氧化酶-连接肽-果糖基转移酶展示在毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化提高低聚果糖转化率中的应用，包括如下步骤：
[0073]
(1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因、果糖基转移酶基因和连接肽的序列，如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4；
[0074]
(2)化学合成如seq id no.6所示的锚定蛋白-连接肽-葡萄糖氧化酶-连接肽-果糖基转移酶融合基因anc-l-gody-l-ftfx；融合基因序列两端包含ecori和not1酶切位点序列和载体ppic9k的同源臂序列；
[0075]
(3)融合基因片段和载体ppic9k均经ecori和not1双酶切，酶切体系如下：
[0076][0077]
(4)将酶切后的融合基因片段与酶切后的ppic9k载体连接，连接体系如下：
[0078][0079]
(5)将连接产物转化入大肠杆菌top10感受态细胞；
[0080]
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
[0081]
(7)pcr检测阳性克隆。菌检上游引物pf1:tctgcctggactgagtacca，下游引物pr1:tggcatgtccctgctgattt；
[0082]
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-anc-l-gody-l-ftfx；
[0083]
(9)质粒均用saci酶切线性化，酶切体系如下：
[0084][0085]
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
[0086]
(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，4000rpm离心10min收集菌体；
[0087]
(12)将菌体涂布在his缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
[0088]
(13)通过3-5mg/ml g418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-anc-l-gody-l-ftfx；
[0089]
(14)将毕赤酵母工程菌p-anc-l-gody-l-ftfx转接入含有10-15ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至od600＝4-5；
[0090]
(15)4000rpm离心10min收集菌体；
[0091]
(16)菌体重悬于bmm培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天，离心收集菌体；
[0092]
(17)以蔗糖为底物，使用全细胞催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖)+10mg全细胞
[0093]
反应时间：5h
[0094]
(18)跑plc检测酶切结果。结果如图2所示。
[0095]
以上实验结果表明，本方法将融合酶葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶展示在毕赤酵母表面，可以全细胞催化生产低聚果糖的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，相比将融合酶果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶展示在毕赤酵母表面进行全细胞催化生产低聚果糖提高了低聚果糖的转化率。毕赤酵母表面展示融合酶葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶比融合酶果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶的酶活更高。因此，本发明可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。
[0096]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
技术特征：
1.一种毕赤酵母，其特征在于其细胞表面表达如seq id no.7所示的蛋白。2.权利要求1所述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。4.权利要求1所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：(1)化学合成如seq id no.6所示的融合基因anc-l-gody-l-ftfx；(2)将步骤(1)合成的融合基因片段和载体ppic9k分别经ecori和not1双酶切；(3)将酶切后的融合基因片段与酶切后的ppic9k载体连接，将融合基因构建到载体ppic9k中；(4)将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；(5)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒ppic9k-anc-l-gody-l-ftfx；(6)将质粒ppic9k-anc-l-gody-l-ftfx线性化；(7)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面表达葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母。5.根据权利要求4所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于：步骤(3)中采用t4 dna连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的ppic9k载体。6.根据权利要求4所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于：步骤(6)中将质粒用saci酶切线性化。
技术总结
本发明公开了一种毕赤酵母，其细胞表面表达如SEQ ID o.7所示的蛋白。还公开了其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用，及其制备方法。本发明将葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶展示在毕赤酵母表面，采用该毕赤酵母全细胞催化生产低聚果糖，在生产的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，可以有效提高低聚果糖的转化率。且本发明还发现，表面展示葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母比果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶融合酶的毕赤酵母在催化生产低聚果糖时酶活更高，低聚果糖的转化率更高。因此，本发明的毕赤酵母可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。低聚果糖的转化率。低聚果糖的转化率。
