促进中华鳖体外胚胎发育的方法
1.本发明涉及一种调控中华鳖胚胎发育的方法。属于生物技术领域。
背景技术：
2.胚蛋给养是通过注射将外源营养物质补充到孵化期胚蛋中的给养方式，也称卵内给养。目前，胚蛋给养主要应用与家禽中，大量研究结果表明，卵内给养可改善雏鸡肠道健康，增加肌肉和肝脏糖原储备，促进器官发育，提高机体免疫力。其中维生素和氨基酸在胚蛋给养中改善生长发育的研究较多。如卵内注射精氨酸对家鸽(columba livia)的孵化性能和生长发育具有影响；家鸽卵内注射组氨酸可以提高孵化率、缩短孵化周期、有利于肠道发育，但对后期生长性能几乎无影响。
3.胚胎期是中华鳖优良性状和个体生长发育的重要时期，易受到外界环境的影响。胚胎发育期间的营养限制可能妨碍胚胎发育，目前常见的方法是于大规模喷淋、饲喂等方式，虽然在一定程度上也可以干预胚胎发育过程，促进胚蛋发育，但存在用料不够精准、时机把握不佳等因素，无法充分发挥功效。
技术实现要素：
4.本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种能精准的促进中华鳖体外胚胎发育的方法。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于选择中华鳖发育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促进胚蛋发育。
6.胚胎期中华鳖在第14期胚胎背甲尚未发育完全，第16期才开始出现裙边，选择第15期是考虑在该性状出现之前的敏感期或关键时期进行营养调控，更有利于裙边组织的发育。而如果操作过早，胚胎死亡率会增大。
7.所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵气室内，不戳破卵膜，以免对胚蛋造成损伤，影响发育。
8.作为优选，其特征在于所述的脯氨酸溶解在氯化钠水溶液中形成注射液进行注射，注射量为2～10μl，脯氨酸浓度为10～30mg/ml，氯化钠百分比浓度为0～0.9％。
9.作为最佳，所述注射量为5μl，脯氨酸浓度为20mg/ml，氯化钠百分比浓度为0.9％。
10.作为优选，包括如下步骤：首先用75％乙醇对中华鳖卵表面进行消毒，接着用钻孔器在中华鳖卵气室位置开注射孔，通过微量进样器将脯氨酸的氯化钠溶液注射到卵气室内，注射完毕后用封口膜封住注射孔。注射孔不易太大，1mm左右比较合适。
11.与现有技术相比，本发明的优点在于：脯氨酸(proline，pro)是一种结构独特的亚氨基酸，被称为蛋白质的基本组成部分，是具有仲胺的唯一蛋白源氨基酸，有助于胶原蛋白的构建，对于维持生命、生长、摄食、营养利用、免疫、抵御环境和病原应激都是必需的，被归为是功能性氨基酸。中华鳖裙边富含胶原蛋白，而脯氨酸是构成胶原三螺旋结构的重要组成之一，因此采用脯氨酸可以促进胶原积累，得到更优品质的中华鳖个体。
12.通过胚蛋给养脯氨酸可以干预胚胎发育过程，提高中华鳖品质性状，相对于大规模喷淋、饲喂等方式，更能精准的发挥作用。裙边是中华鳖最具特征性的营养组织，脯氨酸能够在胚胎期就可以促进裙边生长和发育，有利于中华鳖幼体出壳后形成宽厚肥大裙边等优良品质性状。
附图说明
13.图1为实施例第22期和对比例第22期背甲比值对比图。
14.图2为实施例第22期和对比例第22期背甲指数对比图。
15.图3为实施例第22期和对比例第22期胚胎重对比图。
16.图4为实施例第22期和对比例第22期胚胎长对比图。
17.图5为实施例第22期和对比例第22期裙边比值对比图。
18.图6为实施例第22期和对比例第22期裙边指数对比图。
19.图7为实施例第22期和对比例第22期中华鳖裙边组织col1a1表达水平对比图。
20.图8为实施例第22期和对比例第22期中华鳖裙边组织col1a2表达水平对比图。
21.图9为实施例第22期天狼星红染显微照片。
22.图10对比例第22期天狼星红染显微照片。
23.图11为实施例第22期和对比例第22期天狼星红i型胶原百分占比对比图。
具体实施方式
24.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
25.实施例，首先用75％乙醇对中华鳖卵(发育在第15期的胚蛋)表面进行消毒，接着用钻孔器在中华鳖卵气室位置开注射孔，通过微量进样器将脯氨酸的氯化钠溶液注射到卵气室内，注射完毕后用封口膜封住注射孔。注射量5μl，脯氨酸的浓度为20mg/ml，氯化钠百分比浓度为0.9％。实施例中选用12个中华鳖卵。
26.对比例，首先用75％乙醇对中华鳖卵(发育在第15期的胚蛋)表面进行消毒，接着用钻孔器在中华鳖卵气室位置开注射孔，通过微量进样器将脯氨酸的氯化钠溶液注射到卵气室内，注射完毕后用封口膜封住注射孔。注射量5μl氯化钠水溶液，氯化钠百分比浓度为0.9％。对比例中选用12个中华鳖卵。
27.表一为实施例和对比例中华鳖卵重量统计：
28.序号实施例重量g对比例重量g12.35282.449722.32932.963032.75792.485942.63112.83952.67732.383662.83663.406172.56932.694282.89362.329093.26602.6440
102.98042.6797112.80773.2055123.68063.6419平均值和标准差2.8152
±
0.37572.8101
±
0.4193
29.结果：
30.存活率：由试验结果可知，实施例中中华鳖卵第22期孵化率为51％，对比例中中华鳖卵第22期的孵化率为42％，同等条件下实施例中的孵化率显著高于正常组(p＜0.05)。
31.对胚胎期中华鳖外部形态的影响：对实施例和对比例中胚胎在第22期进行取样，用游标卡尺对胚胎长、背甲长、背甲宽、裙边宽进行测量，用电子天平测定胚胎重，背甲重以及裙边重。试验结果结合图1～6所示，注射pro后，中华鳖胚胎更重，背甲裙边发育更好，总的来说，胚胎生长发育优于正常组。
32.对裙边组织i型胶原基因表达的影响：结合图7和图8所示，实施例中i型胶原基因表达量更高，有利于i型胶原的合成。
33.对裙边组织天狼星红染的影响：结合图9～图11所示，对比例裙边组织折光性不是很强，胶原纤维呈现亮红，实施例胶原纤维也呈现亮红，折光性更加明显。并且i型胶原蛋白百分占比结果表明，实施例显著高于对比例(p＜0.01)。
技术特征：
1.一种促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于选择中华鳖发育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促进胚蛋发育。2.根据权利要求1所述的促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵气室内。3.根据权利要求2所述的促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于所述的脯氨酸溶解在氯化钠水溶液中形成注射液进行注射，注射量为2～10μl，脯氨酸浓度为10～30mg/ml，氯化钠百分比浓度为0～0.9％。4.根据权利要求3所述的促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于包括如下步骤：首先用75％乙醇对中华鳖卵表面进行消毒，接着用钻孔器在中华鳖卵气室位置开注射孔，通过微量进样器将脯氨酸的氯化钠溶液注射到卵气室内，注射完毕后用封口膜封住注射孔。
技术总结
一种促进中华鳖体外胚胎发育的方法，其特征在于选择中华鳖发育在第15期的胚蛋，在胚蛋中添加脯氨酸促进胚蛋发育。进一步，所述的脯氨酸注射到胚蛋的卵气室内。通过胚蛋给养脯氨酸可以干预胚胎发育过程，提高中华鳖品质性状，相对于大规模喷淋、饲喂等方式，更能精准的发挥作用。发挥作用。发挥作用。
