一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法与流程
1.本发明涉及生物蛋白纯化的技术领域，尤其涉及一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法。
背景技术：
2.贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein，map)是贻贝足部分泌腺分泌出的一种蛋白复合物，具有促进细胞贴壁爬行、促进创面愈合、抑制瘙痒、广谱粘接、形成抗水保护膜等作用。近年来因其具有高强度，高韧性，防水性和可降解性等优点收到了广泛的关注，在生物医药方面得到了大力的推广和应用。
3.贻贝粘蛋白的获取途径主要为海洋紫贻贝足部提取，受原材料及提取工艺的限制，获取贻贝粘蛋白纯品的效率及产量较低，极大得限制了贻贝粘蛋白的应用，利用生物技术手段进行重组类贻贝黏蛋白的发酵生产成为现下的研究重点。
4.现有技术中，利用生物技术获取的大肠杆菌工程菌发酵表达纯化最终获得重组类贻贝粘蛋白冻干产品的报道日益增多，但冻干产品或纯化产品中内毒素高且去除困难，极大地限制了其产品在医疗器械领域的使用，
5.内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。内毒素相对分子质量从几千到几万不等，具有耐热性和化学稳定性，性质极不均一，目前很难到一种高效且通用的内毒素去除方法。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是利用生物技术获得的重组类贻贝粘蛋白产品含内毒素过高，提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素的去除方法，使产品的内毒素含量小于5eu/mg。
7.为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
8.一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，包括以下步骤：
9.s1，向被内毒素污染的蛋白制剂中加入含有尿素与氯化钠的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上样料液；
10.s2，用缓冲液平衡好层析柱，将所述上样料液过柱，收集穿柱料液；
11.s3，向穿柱料液中加入盐酸，进行酸热反应；
12.s4，对s3反应完的料液调节ph值至大于或等于3.0，经透析过滤浓缩收集截留液，得到内毒素含量小于或等于5eu/mg的产物。
13.本发明在内毒素的去除过程中加入了尿素，尿素在层析过程中具有增强内毒素挂柱以达到预期内毒素去除效果的作用，同时尿素在酸热反应的过程中还具有保护蛋白，防止蛋白在酸热反应的过程中分解的作用。
14.其进一步的技术方案为，所述被内毒素污染的蛋白制剂包含部分纯化的重组类贻
贝粘蛋白。例如，在一个或多个实施方案中，所述被内毒素污染的蛋白制剂为采用大肠杆菌工程菌发酵表达纯化获取重组类贻贝粘蛋白的中间产物。
15.其进一步的技术方案为，所述被内毒素污染的蛋白制剂包含高度纯化的重组类贻贝粘蛋白。例如，在一个或多个实施方案中，所述被内毒素污染的蛋白制剂为采用大肠杆菌工程菌发酵表达纯化获取的重组类贻贝粘蛋白冻干粉。
16.其进一步的技术方案为，所述步骤s1中，混合溶液中的尿素含量大于或等于4.0mol/l，氯化钠含量为1.5～2.0mol/l。例如，在一个或多个实施方案中，混合溶液中的尿素含量为4.0mol/l、5.0mol/l、6.0mol/l、7.0mol/l或8.0mol/l，氯化钠含量为1.5mol/l、1.7mol/l、1.9mol/l或2.0mol/l。
17.需要说明的是，考虑到混合溶液中尿素的溶解度，其含量一般不超过8mol/l。
18.可以理解的，混合溶液所用的溶剂为纯化水。
19.其进一步的技术方案为，所述步骤s1中，上样料液中含有的重组类贻贝粘蛋白含量为15～20g/l。
20.需要说明的是，上样料液中的重组类贻贝粘蛋白含量最好不超过20g/l，含量过高会导致料液粘度提升，层析时严重影响内毒素的挂柱效果，从而大幅度降低在层析步骤中去除内毒素的效率，可能会导致内毒素超标；含量过低的话会虽不会影响去除内毒素的效果，但会导致生产效率变低。因此，上样料液中的重组类贻贝粘蛋白含量应在适宜范围内，以15～20g/l为宜。例如，在一个或多个实施方案中，上样料液中含有的重组类贻贝粘蛋白含量为15g/l、16g/l、18g/l、或20g/l。
21.其进一步的技术方案为，所述步骤s2中，所述缓冲液为1.5～2.0mol/l的氯化钠溶液。例如，在一个或多个实施方案中，所述缓冲液中，氯化钠含量为1.5mol/l、1.7mol/l、1.9mol/l或2.0mol/l。
22.其进一步的技术方案为，所述步骤s2中，所述层析柱为苯基疏水层析柱。
23.其进一步的技术方案为，所述步骤s3中，加入盐酸至0.05～0.15mol/l。例如，在一个或多个实施方案中，所述步骤s3中，加入盐酸至0.05mol/l、0.07mol/l、0.09mol/l、0.12mol/l、0.14mol/l或0.15mol/l。
24.其进一步的技术方案为，所述步骤s3中，酸热反应的温度为80℃及以上，反应时间0.5～1h。例如，在一个或多个实施方案中，所述步骤s3中，酸热反应的温度为80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，反应时间0.5h、40min或1.0h
25.可以理解的，酸热反应的温度为不宜过高，以80～100℃为宜，以防止蛋白酸解，适宜的温度可以提高盐酸对内毒素的去除效率。
26.其进一步的技术方案为，所述步骤s4中，过滤方式为超滤。例如，在一个或多个实施方案中，采用10kd的超滤膜进行超滤。
27.其进一步的技术方案为，所述步骤s4中，采用纯化水进行透析。
28.其进一步的技术方案为，所述步骤s4中，还包括对截留液进行冷冻干燥。
29.在一个或多个实施方案中，所述步骤s4中，调节料液的ph值至大于或等于3.0，例如，采用氢氧化钠调节料液的ph值至3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.7。由于目标产物重组类贻贝粘蛋白为酸溶性蛋白，因此，ph值在3～6之间为宜，在3～5之间较佳，在3～4之间为最佳范围，ph值过高会存在目标蛋白在超滤过程中析出堵塞的风险。
30.与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
31.本发明提供的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，对需处理的被内毒素污染的蛋白制剂中加入尿素一起溶解，再过疏水柱层析，收集穿柱料液，进一步对穿柱料液进行酸热处理，经过超滤浓缩后可获得内毒素含量小于5eu/mg的目标蛋白产品。本发明提供的去除方法在去除目标蛋白内毒素的同时，能够获得较高的目标蛋白回收率，具有简单、高效的优点，可进行大批量工业化生产。
附图说明
32.图1为实施例1及对比例2酸热处理的样品电泳检测图：其中，泳道1：蛋白marker，泳道2：重组类贻贝粘蛋白10g/l对照品点样量10ul，泳道3：对比例2不含尿素的穿料液酸热处理样品点样量10ul，泳道4：实施例1含尿素的穿料液酸热处理样品点样量10ul。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
35.以下通过具体实施例来详细介绍本发明提供的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法能够获得内毒素含量小于5eu/mg的目标蛋白产品。
36.本发明实施例的内毒素含量采用《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则1143凝胶法进行检测。
37.本发明实施例所用的被内毒素污染的蛋白制剂为采用大肠杆菌工程菌发酵表达纯化获取的重组类贻贝粘蛋白冻干粉。在常规的生物工程技术提取纯化获得重组类贻贝粘蛋白的工艺流程中，通常是用大肠杆菌工程菌发酵表达获取包涵体，再经酸提盐析超滤冻干的流程取得重组类贻贝粘蛋白冻干粉，受大肠杆菌内毒素的影响以及提纯工艺限制，冻干粉产品中的内毒素含量大于20eu/mg、大于100eu/mg甚至大于500eu/mg，远高于实际应用的限度水平。
38.在其他实施例中，本发明提供的内毒素去除方法还可以直接应用在利用生物工程技术获得重组类贻贝粘蛋白的工业化生产过程中，向生产得到的部分纯化的蛋白产物执行本发明的步骤s1-s4。
39.实施例1
40.本发明实施例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
41.1)将5g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于250ml的含6m尿素及1.5m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
42.2)用1.9mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，
收集穿柱料液300ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量小于100eu/mg。
43.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.1mol/l，加热至81℃并保持35min，反应完毕后留样进行电泳检测，结果如图1的泳道4所示，显示蛋白较为稳定，无明显降解条带，说明目标蛋白在酸热处理中能够稳定存在。
44.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.5，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液400ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉4.72g，经检测，目标蛋白冻干粉中的内毒素含量小于5eu/mg，蛋白回收率为94.4％。
45.实施例2
46.本发明实施例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
47.1)将10g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于500ml的含4m尿素及2m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
48.2)用2.0mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，收集穿柱料液520ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量小于100eu/mg。
49.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.15mol/l，加热至84℃并保持31min，反应完毕后留样进行电泳检测，结果显示蛋白较为稳定，无明显降解条带。
50.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.2，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液410ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉9.21g，经检测，目标蛋白冻干粉中的内毒素含量小于5eu/mg，蛋白回收率92.1％。
51.对比例1
52.本发明对比例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
53.1)将5g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于250ml的含2m尿素及1.5m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
54.2)用1.9mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，收集穿柱料液304ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量大于100eu/mg。
55.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.1mol/l，加热至81℃并保持35min，反应完毕后留样电泳检测，结果显示蛋白较为稳定，无明显降解条带。
56.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.5，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液410ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉4.66g，经检测，目标蛋白冻干粉中的内毒素含量大于5eu/mg，目标蛋白回收率93.2％。
57.本对比例在步骤1)中添加的尿素含量为2mol/l，低于本发明限定的保护范围，由于尿素含量过低，导致上样料液在过柱层析的过程中内毒素挂壁效果差，使得穿柱料液中残留了大量的内毒素，而酸热处理对内毒素的去除量有限，因此，得到的目标蛋白冻干粉的内毒素含量大于5eu/mg。
58.对比例2
59.本发明对比例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
60.1)将5g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于250ml含1.5m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
61.2)用1.9mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，收集穿柱料液310ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量大于100eu/mg。
62.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.1mol/l，加热至81℃并保持35min，反应完毕后留样电泳检测，结果如图1的泳道3所示，显示目标蛋白有明显降解条带产生。
63.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.5，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液405ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉4.52g，经检测，目标蛋白冻干粉中的内毒素含量大于5eu/mg，蛋白回收率90.4％。
64.本对比例中，步骤1)未加入尿素，上样料液在过柱层析的过程中内毒素挂壁效果差，使得穿柱料液中残留了大量的内毒素，即使在后续的酸热处理中，通过提高盐酸浓度来保护目标蛋白，但由于缺少尿素，目标蛋白仍会在酸热处理中出现明显的降解。可见，尿素在酸热反应的过程中具有保护蛋白，防止蛋白在酸热反应的过程中分解的作用。
65.对比例3
66.本发明对比例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
67.1)将5g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于250ml的含6m尿素及1.5m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
68.2)用1.8mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，收集穿柱料液300ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量小于100eu/mg。
69.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.02mol/l，加热至81℃并保持35min，反应完毕后留样电泳检测，结果显示蛋白较为稳定。
70.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.5，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液220ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉4.68g，经检测目标蛋白冻干粉中的内毒素含量大于5eu/mg，目标蛋白回收率93.6％。
71.本对比例中，步骤3)的盐酸浓度为0.02mol/l，低于本发明限定的保护范围，虽然尿素的加入增强了内毒素过柱层析的效果，但在酸热处理中，盐酸浓度过低会导致对内毒素的去除效果不明显，因此，得到的目标蛋白冻干粉的内毒素含量大于5eu/mg。
72.对比例4
73.本发明对比例提供一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，该方法包括以下步骤：
74.1)将5g采用常规生物工程技术获得的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产品溶于250ml含6m尿素及1.5m氯化钠的纯化水中，使蛋白充分溶解，得到上样料液。
75.2)用1.9mol/l氯化钠缓冲液平衡好苯基疏水层析柱，将所述上样料液过柱层析，收集穿柱料液290ml，经检测，得到的穿柱料液中，内毒素含量小于100eu/mg。
76.3)向穿柱料液加入盐酸至浓度为0.1mol/l，加热至72℃并保持32min，反应完毕后留样电泳检测，结果显示蛋白较为稳定。
77.4)将步骤3)中反应完的料液冷却至室温，用2mol/l的氢氧化钠调节料液的ph至3.5，再以纯化水作为透析液经10kd超滤膜进行超滤脱盐浓缩，收集截留液385ml，将截留液冷冻干燥，获得目标蛋白冻干粉4.61g，经检测，目标蛋白冻干粉中的内毒素含量大于5eu/mg，蛋白回收率92.2％。
78.本对比例中，步骤3)的加热温度为72℃，低于本发明限定的温度范围，虽然尿素的加入增强了内毒素过柱层析的效果，但在酸热处理中，温度过低会导致对内毒素的去除效果不明显，因此，得到的目标蛋白冻干粉的内毒素含量大于5eu/mg。
79.综上，本发明提供的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，对需处理的被内毒素污染的蛋白制剂中加入尿素一起溶解，再过疏水柱层析，尿素的加入增强了内毒素的挂柱效果，得到的穿柱料液中，内毒素含量小于100eu/mg；再对穿柱料液结合酸热处理去除残留的内毒素；经过超滤浓缩后可获得内毒素含量小于5eu/mg的目标蛋白产品，尿素还会在酸热处理中起保护蛋白，防止目标蛋白分解的作用，从而获得较高的目标蛋白回收率。
80.在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
81.以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
技术特征：
1.一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，向被内毒素污染的蛋白制剂中加入含有尿素与氯化钠的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上样料液；s2，用缓冲液平衡好层析柱，将所述上样料液过柱，收集穿柱料液；s3，向穿柱料液中加入盐酸，进行酸热反应；s4，对s3反应完的料液调节ph值至大于或等于3.0，经透析过滤浓缩收集截留液，得到内毒素含量小于或等于5eu/mg的产物。2.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s1中，混合溶液中的尿素含量大于或等于4.0mol/l，氯化钠含量为1.5～2.0mol/l。3.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s1中，上样料液中含有的重组类贻贝粘蛋白含量为15～20g/l。4.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述缓冲液为1.5～2.0mol/l的氯化钠溶液。5.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述层析柱为苯基疏水层析柱。6.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s3中，加入盐酸至0.05～0.15mol/l。7.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s3中，酸热反应的温度为80℃及以上，反应时间0.5～1h。8.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述被内毒素污染的蛋白制剂包含部分纯化的重组类贻贝粘蛋白；或者所述被内毒素污染的蛋白制剂包含高度纯化的重组类贻贝粘蛋白。9.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s4中，过滤方式为超滤。10.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤s4中，还包括对截留液进行冷冻干燥。
技术总结
本发明公开了一种重组类贻贝粘蛋白内毒素的去除方法，涉及生物蛋白纯化技术领域。该方法包括：S1，向被内毒素污染的蛋白制剂中加入含有尿素与氯化钠的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上样料液；S2，用缓冲液平衡好层析柱，将所述上样料液过柱，收集穿柱料液；S3，向穿柱料液中加入盐酸，进行酸热反应；S4，对S3反应完的料液调节pH值至大于或等于3.0，经透析过滤浓缩收集截留液，得到内毒素含量小于或等于5EU/mg的产物。本发明提供的去除方法在去除目标蛋白内毒素的同时，能够获得较高的目标蛋白回收率，具有简单、高效的优点，可进行大批量工业化生产。业化生产。业化生产。
