一种关节软骨纳米纤维微球支架及其制备方法
1.本发明涉及生物医用材料技术领域，具体而言，涉及一种关节软骨纳米纤维微球支架及其制备方法。
背景技术：
2.由损伤或疾病引起的关节软骨缺损严重威胁着人类的生命健康。随着人口老龄化等问题日益严峻，开发新的技术来修复受损软骨组织是非常有必要的。组织工程技术是将工程和生命科学结合起来，以达到改善、恢复或替代受损组织和器官的目的。在组织工程中，支架的设计尤为重要，支架由天然(如胶原蛋白、脱细胞基质)或合成材料制成，旨在模拟天然的三维细胞外基质(ecm)环境，以促进细胞增殖并形成具有特定形态和功能的组织或器官。
3.静电纺丝作为一种简单且通用的纳米纤维支架制造技术，在软骨组织工程中已得到了广泛应用。传统的静电纺丝支架的局限性在于，支架由紧密堆积的纳米纤维构成，支架表面只有表面的多孔结构，无法模拟天然的三维ecm结构。因此，开发一种具有稳定三维结构的关节软骨纳米纤维微球支架是非常有前景的。
技术实现要素：
4.本发明解决的问题是现有的静电纺丝支架无法模拟天然的三维ecm结构。
5.为解决上述问题，本发明提供一种关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，包括如下步骤：
6.s1：将可降解聚合物与天然高分子材料溶于溶剂中，制备纺丝液；
7.s2：将所述纺丝液通过静电纺丝设备进行静电纺丝，得到二维纳米纤维膜；
8.s3：对所述二维纳米纤维膜进行交联处理，得到交联后的二维纳米纤维膜；
9.s4：将所述交联后的二维纳米纤维膜置于介质中通过匀浆机进行粉碎处理，得到短纳米纤维分散液；
10.s5：将所述短纳米纤维分散液通过电喷法进行电喷，并在液氮接收剂中接收，得到冻结的短纳米纤维微球；
11.s6：对所述冻结的短纳米纤维微球进行冷冻干燥和交联处理，得到关节软骨纳米纤维微球支架。
12.可选地，所述纺丝液中所述可降解聚合物与所述天然高分子材料的质量比为1:4。
13.可选地，所述可降解聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乳酸中的至少一种；所述天然高分子材料选自明胶和丝素蛋白中的至少一种；步骤s1中的所述溶剂选自六氟异丙醇和二氯甲烷中的至少一种。
14.可选地，所述纺丝液的质量浓度为8％～15％。
15.可选地，步骤s3中对所述二维纳米纤维膜进行交联处理包括对所述二维纳米纤维膜进行戊二醛交联或热交联。
16.可选地，步骤s4中所述短纳米纤维分散液浓度为20mg/ml。
17.可选地，还包括：
18.s7：对所述关节软骨纳米纤维微球支架进行化学修饰。
19.可选地，对所述关节软骨纳米纤维微球支架进行化学修饰包括：将所述关节软骨纳米纤维微球支架浸泡于单宁酸和srcl2混合溶液中，冲洗后进行冷冻干燥。
20.可选地，所述混合溶液中所述单宁酸的浓度为3mg/ml，所述srcl2的浓度为0.1m。
21.本发明的另一目的在于提供一种关节软骨纳米纤维微球支架，通过如上所述的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法进行制备。
22.与现有技术相比，本发明提供的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法具有如下优势：
23.本发明提供的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，以可降解聚合物与天然高分子材料为原料，依次经静电纺丝、交联粉碎、电喷处理以及冷冻干燥和再次交联后，得到机械结构稳定，且具有三维的多孔纳米纤维形貌的支架，该支架表面及内部均具有丰富的多孔结构，能够模拟天然的三维ecm结构，生物相容性良好，有利于患者术后快速的恢复。
附图说明
24.图1为本发明实施例1制备的关节软骨纳米纤维微球支架的扫描电镜图；
25.图2为本发明实施例1制备的关节软骨纳米纤维微球支架的xps光谱；
26.图3为本发明实施例1制备的关节软骨纳米纤维微球支架的单宁酸和锶离子释放结果图；
27.图4为本发明实施例1制备的关节软骨纳米纤维微球支架在体内对关节炎引起的软骨损伤的修复结果图。
具体实施方式
28.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中表示，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.为解决现有的静电纺丝支架无法模拟天然的三维ecm结构的问题，本发明提供了一种关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
30.s1：将可降解聚合物与天然高分子材料溶于溶剂中，制备纺丝液；
31.s2：将纺丝液通过静电纺丝设备进行静电纺丝，得到二维纳米纤维膜；
32.s3：对二维纳米纤维膜进行交联处理，得到交联后的二维纳米纤维膜；
33.s4：将交联后的二维纳米纤维膜置于介质中通过匀浆机进行粉碎处理，得到短纳米纤维分散液；
34.s5：将短纳米纤维分散液通过电喷法进行电喷，并在液氮接收剂中接收，得到冻结的短纳米纤维微球；
35.s6：对冻结的短纳米纤维微球进行冷冻干燥和交联处理，得到关节软骨纳米纤维
微球支架。
36.本技术首先以可降解聚合物与天然高分子材料为原料通过静电纺丝来制备二维纳米纤维膜，进一步经交联处理来提高结构的稳定性后，进行粉碎处理，得到分散均匀的短纳米纤维分散液；将分散均匀的短纳米纤维分散液通过电喷法并在低温接收剂液氮中接收，当短纳米纤维分散液滴由电喷射出针头后，在液氮中接收能快速冻结携带有短纳米纤维的液滴，从而维持其球状，得到冻结的短纳米纤维微球，进一步对该冻结的短纳米纤维微球进行冷冻干燥和再次交联处理，即可得到具有稳定结构，以及三维的多孔纳米纤维形貌的关节软骨纳米纤维微球支架。
37.本发明提供的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，以可降解聚合物与天然高分子材料为原料，适用的材料广泛，因此适用性广，可行性强；依次经静电纺丝、交联粉碎、电喷处理以及冷冻干燥和再次交联后，得到机械结构稳定，且具有三维的多孔纳米纤维仿生形貌的支架，该支架表面及内部均具有丰富的多孔结构，能够模拟天然的三维ecm结构，生物相容性良好，有利于患者术后快速的恢复。
38.此外，由于制备的关节软骨纳米纤维微球支架具有纳米微球结构，且孔结构丰富，一方面能够适用于不规则组织的缺损修复，能够更好的填补缺损，另一方面具有可注射性，因此，可通过微创注射的方式进行组织修复，避免了开放性手术带来的感染风险高和愈合周期长等缺点，有助于加快术后愈合。
39.为保证骨修复效果，本发明优选步骤s1的纺丝液中可降解聚合物与天然高分子材料的质量比为1:4；其中可降解聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乳酸中的至少一种；天然高分子材料选自明胶和丝素蛋白中的至少一种；步骤s1中的溶剂选自六氟异丙醇和二氯甲烷中的至少一种。
40.进一步的，本发明优选纺丝液的质量浓度为8％～15％，并优选静电纺丝的工艺参数为：电压10kv～12kv，接收距离10cm～15cm，纺丝液流速1.0ml/h～1.2ml/h。
41.为保证支架的机械性能，本发明优选步骤s3中对二维纳米纤维膜进行交联处理包括对二维纳米纤维膜进行戊二醛交联或热交联，并进一步优选交联时间为3h～6h。
42.本技术优选步骤s4中的介质为去离子水或叔丁醇；步骤s4中匀浆机转速为10000rpm，匀浆时间为30min，短纳米纤维分散液浓度为20mg/ml。
43.由于本技术中的纳米微球结构是通过电喷法得到，因此本技术提供的关节软骨纳米纤维微球支架的直径可通过调控电喷过程中的电压、泵出速率和接收距离等参数来控制，本技术步骤s5中电喷的工艺参数为，施加的电压可以是6kv、8kv和10kv中的一种，本技术优选施加的电压是8kv，泵出速率为3ml/h，接收距离为10cm。
44.进一步，本技术优选步骤s6中冷冻干燥的参数为，真空度0.5pa～1pa，干燥温度-80℃，干燥时间24h～48h；冷冻干燥后的纳米纤维微球需要经交联来增强短纳米纤维之间的联系，使得微球具有更加稳定的机械性能，并进一步优选步骤s6中的交联工艺为戊二醛交联，交联的时间为6h。
45.此外，为进一步增强关节软骨纳米纤维微球支架的生物功能性，本技术优选制备方法还包括：
46.s7：对关节软骨纳米纤维微球支架进行化学修饰，以便于通过化学修饰进一步扩展其生物功能性。
47.进一步的，本技术优选对关节软骨纳米纤维微球支架进行化学修饰包括：将关节软骨纳米纤维微球支架浸泡于单宁酸和srcl2混合溶液中，冲洗后进行冷冻干燥。
48.其中单宁酸能缓解关节炎症，从而减缓软骨的退行性病变，sr
2+
能够促进软骨细胞特异性基质(如二型胶原、糖胺聚糖)的分泌，以使制备的关节软骨纳米纤维微球支架能够用于缓解关节炎症，促进关节修复。
49.具体的，为保证关节软骨纳米纤维微球支架的功能化效果，本技术优选混合溶液中所述单宁酸的浓度为3mg/ml，srcl2的浓度为0.1m。
50.本发明提供的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，工艺简单，易于操作；制备所得的关节软骨纳米纤维微球具有多孔的纳米纤维仿生形貌，生物相容性良好，具有可注射性和抗炎性能，可用于关节炎的微创。
51.此外，本技术提供的关节软骨纳米纤维微球支架具有单宁酸和锶离子的缓释效应，可维持较长时间的抗炎和软骨修复功能；该支架除了能有效缓解关节炎症，还可以促进软骨特异性基质的分泌，在关节炎的微创中具有广阔的应用前景。
52.本发明的另一目的在于提供一种关节软骨纳米纤维微球支架，通过如上所述的关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法进行制备。
53.本发明提供的关节软骨纳米纤维微球支架，具有三维的多孔纳米纤维仿生形貌，支架表面及内部均具有丰富的多孔结构，能够模拟天然的三维ecm结构，生物相容性良好，有利于患者术后快速的恢复。
54.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
55.实施例1
56.本实施例提供一种关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
57.s1：配制纺丝液：称取0.8g明胶和0.2g聚乳酸(pla)溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，配成质量浓度为10％的明胶/pla纺丝液；
58.s2：制备二维纳米纤维膜：通过静电纺丝制备明胶/pla二维纳米纤维膜，12kv高压与注射器针头相连，溶液泵出速率为3ml/h，用铝箔接收纳米纤维膜，接收距离为8cm～10cm，得到二维纳米纤维膜；
59.s3：交联纳米纤维膜：配置5％(w/v)的戊二醛酒精溶液50ml，将其置于密闭的玻璃罐中，将纳米纤维膜置于罐内，通过戊二醛酒精蒸气熏蒸进行交联，交联时间为6h，得到交联后的二维纳米纤维膜；
60.s4：将交联后的明胶/pla纳米纤维膜剪成0.5cm
×
0.5cm大小的碎片，称取2g加入到含有100ml去离子水中的烧杯中，用匀浆机将纳米纤维膜粉碎成短纳米纤维分散液，转速为10000rpm，处理时间为30min，得到短纳米纤维分散液；
61.s5：采用电喷法制备了纳米纤维微球；将浓度20mg/ml的短纤维分散液加载到装有21g钝头针的10ml注射器中，助推速率为2.0ml/h；将一块铝箔浸入液氮中作为纳米纤维微球的接收器；电喷过程中，施加的外加电压为8kv，针尖到接收器的距离为10cm，得到冻结的短纳米纤维微球；
62.s6：将冻结的短纳米纤维微球转移到冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；随后，在戊二醛
酒精蒸汽中熏蒸12h，以增强微球的机械性能，得到关节软骨纳米纤维微球支架；
63.s7：将关节软骨纳米纤维微球支架浸泡在浓度为3mg/ml的单宁酸和0.1m的srcl2混合溶液中10min，随后用去离子水冲洗3遍，并冷冻干燥，得到功能化的关节软骨纳米纤维微球支架。
64.经检测，该实施例制备的关节软骨纳米纤维微球支架的直径为500μm，孔径为10～20μm。
65.实施例2
66.本实施例提供一种关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
67.s1：配制纺丝液：称取0.8g丝素蛋白(sf)和0.2g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，配成质量浓度为10％的sf/plga纺丝液；
68.s2：制备二维纳米纤维膜：通过静电纺丝制备sf/plga二维纳米纤维膜，12kv高压与注射器针头相连，溶液泵出速率为3ml/h，用铝箔接收纳米纤维膜，接收距离为8cm～10cm，得到二维纳米纤维膜；
69.s3：交联纳米纤维膜：配置5％(w/v)的戊二醛酒精溶液50ml，将其置于密闭的玻璃罐中，将纳米纤维膜置于罐内，通过戊二醛酒精蒸气熏蒸进行交联，交联时间为6h，得到交联后的二维纳米纤维膜；
70.s4：将交联后的sf/plga纳米纤维膜剪成0.5cm
×
0.5cm大小的碎片，称取2g加入到含有100ml去离子水中的烧杯中，用匀浆机将纳米纤维膜粉碎成短纳米纤维分散液，转速为10000rpm，处理时间为30min，得到短纳米纤维分散液；
71.s5：采用电喷法制备了纳米纤维微球；将浓度20mg/ml的短纤维分散液加载到装有21g钝头针的10ml注射器中，助推速率为2.0ml/h；将一块铝箔浸入液氮中作为纳米纤维微球的接收器；电喷过程中，施加的外加电压为8kv，针尖到接收器的距离为10cm，得到冻结的短纳米纤维微球；
72.s6：将冻结的短纳米纤维微球转移到冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；随后，在戊二醛酒精蒸汽中熏蒸12h，以增强微球的机械性能，得到关节软骨纳米纤维微球支架；
73.s7：将关节软骨纳米纤维微球支架浸泡在浓度为3mg/ml的单宁酸和0.1m的srcl2混合溶液中10min，随后用去离子水冲洗3遍，并冷冻干燥，得到功能化的关节软骨纳米纤维微球支架。
74.经检测，该实施例制备的关节软骨纳米纤维微球支架的直径为500μm，孔径为10～20μm。
75.实施例3
76.本实施例提供一种关节软骨纳米纤维微球支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
77.s1：配制纺丝液：称取0.8g明胶和0.2g聚乳酸(pla)溶于10ml六氟异丙醇(hfip)中，配成质量浓度为10％的明胶/pla纺丝液；
78.s2：制备二维纳米纤维膜：通过静电纺丝制备明胶/pla二维纳米纤维膜，12kv高压与注射器针头相连，溶液泵出速率为3ml/h，用铝箔接收纳米纤维膜，接收距离为8cm～10cm，得到二维纳米纤维膜；
79.s3：交联纳米纤维膜：配置5％(w/v)的戊二醛酒精溶液50ml，将其置于密闭的玻璃罐中，将纳米纤维膜置于罐内，通过戊二醛酒精蒸气熏蒸进行交联，交联时间为6h，得到交联后的二维纳米纤维膜；
80.s4：将交联后的明胶/pla纳米纤维膜剪成0.5cm
×
0.5cm大小的碎片，称取2g加入到含有100ml去离子水中的烧杯中，用匀浆机将纳米纤维膜粉碎成短纳米纤维分散液，转速为10000rpm，处理时间为30min，得到短纳米纤维分散液；
81.s5：采用电喷法制备了纳米纤维微球；将浓度20mg/ml的短纤维分散液加载到装有21g钝头针的10ml注射器中，助推速率为2.0ml/h；将一块铝箔浸入液氮中作为纳米纤维微球的接收器；电喷过程中，施加的外加电压为10kv，针尖到接收器的距离为10cm，得到冻结的短纳米纤维微球；
82.s6：将冻结的短纳米纤维微球转移到冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；随后，在戊二醛酒精蒸汽中熏蒸12h，以增强微球的机械性能，得到关节软骨纳米纤维微球支架；
83.s7：将关节软骨纳米纤维微球支架浸泡在浓度为3mg/ml的单宁酸和0.1m的srcl2混合溶液中10min，随后用去离子水冲洗3遍，并冷冻干燥，得到功能化的关节软骨纳米纤维微球支架。
84.经检测，该实施例制备的关节软骨纳米纤维微球支架的直径为300μm，孔径为10～15μm。
85.为对本技术制备的关节软骨纳米纤维微球支架的性能进行检测，本发明使用扫描电子显微镜(sem)、电感耦合等离子体光谱仪(icp-oes)、x射线光电子能谱(xps)等方法表征制备的关节软骨纳米纤维微球支架，包括其形貌、化学组成、单宁酸和锶离子的缓释等。此外，本发明还通过将微球注射入事先诱导为关节炎模型的兔子关节腔内来评价本发明制备的关节软骨纳米纤维微球支架在缓解炎症，促进关节再生中的应用潜能，具体测试结果如下：
86.(1)sem测试：
87.如图1所示，对关节软骨纳米纤维微球支架的表面形貌通过sem表征。其中，ms、tms、tsms分别代表未修饰单宁酸的微球、修饰了单宁酸的微球以及修饰了单宁酸/sr
2+
的微球；所有的微球都显示出纳米纤维的表面形貌，经由单宁酸修饰后微球的表面变得粗糙，并在微球的表面形成了条状物质，而且在在引入sr
2+
的tsms表面条状物质更加明显；在高倍镜下对纳米纤维段进行形态学检查，进一步发现tms和tsms的表面微观结构在修饰单宁酸后变得粗糙，一些单宁酸的小颗粒分布在纤维表面。
88.(2)xps测试
89.xps光谱进一步说明了微球和单宁酸/sr
2+
之间的相互作用(图2)。ms和tms中没有sr 3d光谱，tsms显示了sr 3d光谱。tms和tsms中的o1s光谱显示出比ms组(531.7ev)更高的键能(533.4ev)，表明微球成功修饰上了单宁酸。
90.(3)单宁酸和锶的释放测试
91.图3(左图)显示了48小时内单宁酸的释放结果，其中tms在初始阶段表现出突释，而tsms显示了稳定而缓慢的单宁酸释放，表明sr
2+
的引入可能有助于单宁酸形成配位键从而更稳定地存在于微球中；图3(右图)显示了tsms在8天内的sr
2+
释放行为，锶离子的释放率在初始阶段较高，在体外第8天达到0.04mg/ml的浓度。
92.(4)微球的体内软骨保护能力测试
93.在诱导为骨关节炎的兔子模型中，关节内注射ms、tms和tsms四周后，观察了膝关节的宏观外观，注射pbs和ms组的关节表面可以看到侵蚀和大面积的病变，而假手术组的关节表面则平滑且光亮。在tms和tsms组，关节表面光滑，显示出轻度的炎症，关节的特征与正常关节软骨的特征相似。
94.为了进一步了解软骨的变性和修复情况，采用h amp;e和蕃红/固绿染对关节进行了组织学分析，同时采用ii型胶原蛋白(检测软骨基质的分泌)和tnf-α(检测关节的炎症情况)对组织进行了免疫组织化学分析；如图4所示，pbs和ms组表现出明显的形态学变化，伴随着软骨基质的丧失、裂缝和纤维化；相反，tms和tsms组的关节形态和假手术组非常相似；另一方面，与pbs、ms和tsms组相比，tsms显示出更多的ii型胶原蛋白的沉积，而tnf-α的染较弱，说明tsms能促进软骨基质分泌的同时缓解关节炎症。
95.虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
