核衣壳

猫传染性腹膜炎病毒核衣壳蛋白的表达及间接ELISA法的建

立

熊炜;林颖峥;王艳;魏晓锋;王巧全;黄忠荣;胡建华;李健

【摘要】本研究对猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）N蛋白的编码基因进行克隆和原

核表达，并在纯化重组N蛋白的基础上，建立了FIPV抗体间接ELISA检测方法。

研究结果显示，该重组纯化的N蛋白具有良好的抗原反应性，可用于FIPV阳性血

清的筛查，为我国出入境检疫部门监控FIPV疫情提供技术支撑。%Inthis

study,thegeneofnucleocapsidprotein(Nprotein)offelineinfectious

peritonitisvirus(FIPV)

indirectELISAmethodwastablishedwiththepurifiedrecombi-nantN

ultsshowedthisrecombinantNproteinhadperfect

antigenreactivityofFIPVandcouldbeudtoscreenFIPVpositive

rum,andthestudywashelpfultomonitortheFIPVinfectionstatus.

【期刊名称】《中国动物检疫》

【年(卷),期】2014(000)002

【总页数】4页(P67-70)

【关键词】猫传染性腹膜炎病毒;核衣壳蛋白;基因克隆和表达;间接ELISA

【作者】熊炜;林颖峥;王艳;魏晓锋;王巧全;黄忠荣;胡建华;李健

【作者单位】上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上

海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海实验动物研究中心，上海

201203;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海

200135;上海实验动物研究中心，上海201203;上海出入境检验检疫局，上海

200135

【正文语种】中文

【中图分类】S852.659.6;S858.293

猫传染性腹膜炎（FIP）是由猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）引起的猫科动物的一种

慢性、渐进性、致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚或各种脏器出现肉芽肿病

变、致死率较高为主要临床特征[1-2]。FIPV在分类上属于套式病毒目

（Nidovirus）冠状病毒科冠状病毒属，它与猫肠道冠状病毒（FECV）同属于猫

冠状病毒（FCoV）[3]。FIPV的基因型为单股正链不分节段的RNA病毒，病毒粒

子呈螺旋状对称，有囊膜，囊膜表面有花瓣状纤突，在电子显微镜下呈日冕状。

FIPV编码4种主要结构蛋白，即刺突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、小包

膜蛋白（E蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）[3]。1963年Holzworth在美国首次

报道本病，但直到1977年才确定该病病原为冠状病毒。目前已报道的检测FIPV

的方法有血清学检测、RT-PCR、核酸探针检测、基因芯片检测等[4-10]。本研究

对FIPVN蛋白基因编码序列进行克隆和原核表达，并将其纯化后包被ELISA板，

初步建立了FIPV抗体间接ELISA检测方法。

1.1主要试剂Trizol、逆转录酶（SuperscriptII）购自Invitrogen公司；高保

真Taq酶（PfuultraII）购自Stratagene公司；RNA酶抑制剂、dNTP、DNA

Marker（DL2000、DL15000）、蛋白Marker、T4DNA连接酶购自Takara

公司；限制性内切酶BamHI和NotI购自NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物购

自Oxid公司；大肠杆菌感受态细胞（Top10F和BL21）、氨苄青霉素、质粒抽

取试剂盒、胶回收试剂盒、TMB试剂均购自天根生化公司；蛋白表达产物纯化采

用GE公司的HisTrapHP亲和柱及试剂。

1.2病毒FIPV由本室从美国菌种保藏中心（ATCC编号：FIPV-1145）引进并

保存。将该病毒在狗直肠瘤细胞系（A72）上扩增，细胞培养物冻融，3000

r/min离心，取上清液备用。

1.3引物参照GenBank中收录的FIPV毒株的N蛋白基因序列设计引物并在

该基因的上下游分别引入BamHI和NotI内切酶位点，扩增的N蛋白基因大小

为1134bp，其上游引物（FIPVNF）为：5’CGGGATCCATGGCCACAC

AGGGACAACGCGTC3’，下游引物（FIPVNR）为：5’CCGCTCGAGGTT

CGTAACCTCATCAATCATCTC3’。

1.4RNA抽提和目的基因扩增取200μLFIPV细胞培养物上清液，加1mL

Trizol试剂，用枪吹打20～30次；加入200μL氯仿，涡旋震荡30s混匀；

12000r/min离心15min；取上层水相，加500μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放

置20min；12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用1mLDEPC水配制的

75%乙醇清洗；7500r/min离心10min；弃上清，沉淀室温干燥10min；加

20μLDEPC水溶解RNA沉淀。取10μLRNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲

液4μL、0.1MDTT（二硫苏糖醇）2μL、dNTP1μL、下游引物（FIPVNR）1

μL、RNA酶抑制剂1μL、逆转录酶（SuperscriptII）1μL，置PCR仪上

42℃/50min、70℃/15min即得cDNA模板。在PCR管中，加cDNA模板3

μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液5μL、dNTP2μL、上下游引物（FIPVNF和

FIPVNR）各0.5μL、Taq酶（PfuultraII）1μL，加水补足总体积至50μL。将

PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94℃5min；然后94℃30s，56℃

30s，72℃90s，30个循环；最后72℃5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴

定。

1.5胶回收和质粒的抽提PCR产物和质粒载体经BamHI和NotI酶切后，采

用天根生化公司胶回收试剂盒进行基因片段的回收，方法见试剂盒说明书；质粒抽

提采用天根生化公司质粒提取试剂盒，方法见试剂盒说明书。

1.6目的基因连接至质粒载体质粒载体（pET23a）与PCR产物连接采用

Takara公司T4DNA连接酶，操作见试剂说明书。

1.7表达产物的SDS-PAGE电泳和Western-blots检测取500μL37℃培养

过夜的菌液，6000r/min离心5min，得细菌沉淀悬浮于50μLPBS中，加入蛋

白上样缓冲液后，煮沸裂解后进行SDS-PAGE电泳（胶浓度12%），分析蛋白电

泳条带。将表达的蛋白产物，用HisTrapHP亲和柱纯化后，进行蛋白电泳，并将

蛋白转印至硝酸纤维素膜上，再使用FIPV阳性血清和用辣根过氧化物酶标记的羊

抗猫HRP-IgG作为二抗，进行Western-blot，检测重组蛋白的生物学活性。

1.8His蛋白的纯化通过pET23质粒载体在大肠杆菌表达的FIPVN蛋白末端

引入组氨酸（His）的标记，采用GE公司生产的HisTrapHP对目的蛋白进行纯

化，具体操作见说明书。

1.9抗原包被浓度与阳性血清稀释度的确定以纯化的重组蛋白为包被抗原，采用

方阵试验方法，优化抗原包被浓度和阳性血清稀释浓度。取纯化FIPVN蛋白（浓

度测定为4.66μg/mL），用pH8.6磷酸盐按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、

1∶64、1∶128进行倍比稀释，再包被96孔ELISA板，每孔200μL，4℃过夜；

用PBST洗涤三次；每孔加入200μL40g/LPEG20000作为封闭液，37℃封闭

2h；用PBST洗涤三次；将FIPV阳性血清和阴性血清分别按1∶100、1∶200，

1∶400稀释后，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用lh；用PBST洗涤三次；

加入1∶2000稀释的羊抗猫HRP-IgG，每孔100μL，37℃作用1h；用PBST洗

涤三次；加TMB底物显色液，每孔100μL，37℃作用15min；最后每孔加入

100μL2mol/LH2SO4终止反应；在酶标仪上450nm处读取OD值。以阳性

血清的OD值接近1.0，P/N值（阳性血清OD450/阴性血清OD450）≥2.0的抗

原最大稀释度作为抗原的最适工作浓度。

2.1目的基因的RT-PCR扩增将FIPV毒株在A72细胞上扩增，提取细胞培养

物中的RNA，采用RT-PCR对FIPV的N蛋白基因进行扩增，通过引物将在目的

基因的5’端和3’端分别引入BamHI和NotI限制性内切酶位点。结果显示，

经RT-PCR从FIPV基因组中扩增出了条带单一特异性的基因片段，基因片段大小

为1148bp（去除终止子，并引入17bp的内酶切位点）（图1）。

2.2目的基因的克隆及产物的酶切鉴定将目的基因PCR产物进行胶回收后，用

BamHI和NotI进行双酶切，将其与同样进行酶切的质粒载体pET23a进行连接，

后转化大肠杆菌感受态细胞Top10F。经平板筛选，挑取阳性克隆进行质粒抽提和

酶切鉴定。结果显示，随机挑取的2个平板筛选阳性克隆（pET-23a-FIPV-N1和

pET-23a-FIPVN2）的质粒经酶切鉴定均释放出了与目的基因大小一致的阳性基因

片段（图2），将质粒进行核酸序列测定并与报道的FIPV株N蛋白基因

（Genbank登录号：AB086881）比对，其同源性为95.2%。

2.3目的基因的表达及抗原性鉴定将pET-23a-FIPV-N1质粒转化大肠杆菌感

受态细胞BL21，转化细菌摇菌培养6h后，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG

进行诱导表达，蛋白表达产物用SDSPAGE分析。结果显示，与空载体对照及未

经IPTG诱导表达的目的质粒转化细菌蛋白电泳图相比，pET-23a-FIPV-N1转化

的细菌经IPTG诱导后，其电泳蛋白谱中出现了分子量大小为45Kda的目的基因

表达产物（图3）。将表达的目的蛋白产物，用HisTrapHP亲和柱纯化后，进行

SDS-PAGE电泳、转膜，并使用FIPV阳性血清进行Western-blot分析，证实电

泳蛋白谱中出现的45Kda的重组蛋白具有良好的FIPV蛋白的反应原性（图4）。

2.4FIPV间接ELISA检测方法的建立经方阵实验测定，建立的FIPV间接

ELISA检测方法中，当FIPV阳性血清为l∶100稀释、FIPVN蛋白抗原的最佳包

被浓度为1.17μg/mL（稀释倍数1∶4）时，阳性血清的OD值接近于1.0，而阴

性血清的OD值均较低，分布于0.05～0.2之间（表1）。因此，确定FIPV阳性

血清的最佳工作浓度为1∶100，相应的FIPVN蛋白抗原的最佳包被浓度为1.17

μg/mL。

猫传染性腹膜炎在猫群发病率、死亡率均较高，尤其在多猫家庭和流浪猫聚集地多

发。该病在感染早期无特征性症状，出现临床症状后，预后多不良，目前RT-PCR

是检测该病最常用的方法。国内对该病的研究不多，报道的FIPV的检测方法有限。

由于FIPV是冠状病毒属的重要成员，尤其在2004年肆虐全球的“非典”（SARS）

之后，人们对冠状病毒的研究越来越重视。据报道，SARS是由一种新型的冠状病

毒（SARS-CoV）引起，它很有可能来源于果子狸，该动物分类上属于灵猫科动物

[11]。因此，监控猫科动物特别是野生猫科动物中FIPV的疫情，对控制FIPV的

传播，具有重要的公共健康安全意义。此外，由于FIPV易变异，血清型较多，而

其主要结构蛋白之一的N蛋白基因相对保守，可做为核酸检测和血清学检测的良

好靶点。基于上述背景，在已建立了FIPV核酸检测方法的基础上[5，10]，为丰

富FIPV检测技术体系，本研究对FIPV编码的N蛋白基因进行了克隆和原核表达，

并将重组N蛋白包被ELISA板，初步建立了FIPV抗体间接ELISA检测方法，该

体外重组N蛋白具有良好的抗原反应性，可用于FIPV阳性血清的筛查。后继，本

研究将采用更多的临床样本对建立的FIPV间接ELISA方法进行优化，并对方法的

特异性、稳定性和可靠性做进一步验证。总之，该FIPV抗体间接ELISA检测方法

的建立，为出入境口岸监控和诊断进境的犬猫科动物特别是猫科野生动物中FIPV

疫情提供了重要的技术支撑。

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