抗冻蛋白

1期·1·

收稿日期：2021-01-04

基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204028）；西藏农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室

开放项目（XZNKY-2020-C-007K05）

第一作者：贾银海（1977-），/0000-0002-5411-3620，博士，高级畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，

E-mail：****************

基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛

抗冻差异蛋白

贾银海1，张成福2，张强2，姬秋梅2，黄光云1，姜辉2，文信旺1，

黄明光1，彭夏云1，吴柱月1

（1广西畜牧研究所/广西家畜遗传改良重点实验室，南宁530001；2西藏农牧科学院畜牧兽医研究所/

省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨850000）

摘要：【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理，并进一步从营养学角度提高其代谢性能，为牦牛有效抵御外界

恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进

行挖掘，并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富集、KEGG信号通路注释、蛋白相互作用等

生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide），其中特有肽段（Uniquepeptide）序列为

18452个，定量获得4519个蛋白，最终筛选出144个差异蛋白，其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异

蛋白亚细胞定位到7个条目上，分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋

白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个；共鉴定到194个结构域。GO功能富集分析结果显示，生物过程主要富集

到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等，分子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活

性蛋白64个等，细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG数据

库中注释到205条KEGG信号通路，主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞

介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高，且冷诱导RNA结合

蛋白（CIRP）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT蛋白组学对牦牛

抗冻差异蛋白进行挖掘，结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个，下调蛋白55个），其中CIRP和HSP70在冷

应激条件下呈上调趋势，能促使牦牛肌体适应低温环境，可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。

关键词：牦牛；TMT蛋白组学；生物信息学；抗冻性；差异蛋白

中图分类号：S823.85文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）01-0001-11

优秀青年学者论坛

贾银海（1977-），博士，高级畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖研

究工作。先后主持或参与完成国家重点研发计划项目、中国科学院科技

援藏项目、中国科学院科技援疆项目、中国科学院科技支黔工程、云南省

科技计划项目、广西科技重大专项等40余项，在家畜（肉牛、肉羊、牦牛及

奶牛）等品种上开展了应激调控机制、营养代谢调控机制、胚胎工程技术

和生态养殖等基础研究工作。荣获云南省科技进步奖二等奖2项，广西

科技进步奖三等奖1项，昆明市科技进步奖二等奖1项，昆明市科技进步

奖三等奖1项及广西南宁市科技成果登记10项；获授权专利18项，出版专

著1部；在《Gene》《FrontiersinGenetics》《中国畜牧兽医》《南方农业学报》

等国内外权威学术期刊发表科技论文60余篇。

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2022，53（1）：1-11ISSN2095-1191；CODENNNXAAB

DOI：10.3969/.2095-1191.2022.01.001

53卷南方农业学报·2·

0引言

【研究意义】牦牛具有很强的抗逆能力，属于世

界第三大极地动物，是当今世界未被污染的三大物

种（北极熊、企鹅和牦牛）之一。青藏高原的牦牛数

量占全球牦牛总量的90%以上。据统计，2018年青

藏高原1.2亿ha的高寒草场上约有1600万头牦牛，是

世界上重要的牦牛资源库和主要生产基地（郝力仕，

2019）。在藏区牧民经济中，牦牛的乳、肉、皮、毛、绒

及其加工产品均是其他家畜无法替代；但高原气候

条件恶劣，冬季缺乏饲草料，导致牦牛营养不良及个

体生产性能下降，严重制约着牦牛产业的可持续发

展。低温环境所引起的冷应激，会导致牦牛抵抗能

力降低及采食量下降，甚至致使怀孕牦牛流产等（贾

银海等，2021）。因此，揭示牦牛抗冷适应能力的作

用机理，对保护牦牛品种资源及促进牦牛产业的可

持续发展具有重要意义。【前人研究进展】动物在受

到冷应激时，其机体通过增加产热以维持体温恒定。

在冷应激条件下，肌体会产生一系列变化，通过震颤

或非震颤产热（郝力仕，2019）。冷应激不仅影响动

物的生产性能，还会对动物的免疫能力及抗氧化能

力等造成不同程度的影响（郭爽等，2021；贾银海等，

2021）。决定动物抗寒性的因素诸多，包括皮肤表面

积、产热性能、蒸发损耗、代谢损耗、脂肪厚度、皮肤

厚度、体毛长度和细度及环境湿度等，许多动物在低

温条件下可合成重结晶抑制效应的抗冻蛋白，降低

体内的体液冰点，从而最大限度地保持体液的液体

状态（deMaayeretal.，2014）。至今，有关抗冻蛋白

（Antifreezeprotein，AFP）的研究主要集中在鱼类

TMTproteomicsandbioinformaticstoanalyzedifferential

proteinsincoldresistanceofyaks

JIAYin-hai1，ZHANGCheng-fu2，ZHANGQiang2，JIQiu-mei2，HUANGGuang-yun1，

JIANGHui2，WENXin-wang1，HUANGMing-guang1，PENGXia-yun1，WUZhu-yue1

（1AnimalHusbandryRearchInstituteofGuangxi/GuangxiKeyLaboratoryofLivestockGeneticImprovement，

Nanning530001，China；2InstituteofAnimalScienceandVeterinary，TibetAcademyofAgriculturalandAnimal

HusbandrySciences/StateKeyLaboratoryofHullessBarleyandYakGermplasmResourcesand

GeneticImprovement，Lhasa850000，China）

Abstract：【Objective】Toelucidatethemechanismofcoldresistanceofyakfromproteinlevel，andtofurtherim-

proveitsmetabolicperformancefromtheperspectiveofnutrition，soastoprovidescientificbasisforyaktoeffectivelyre-

sistharshclimateconditions.【Method】TheyakantifreezeproteinswereextractedbyTMTproteomicsincoldason

（January）andwarmason（August），andthesubcellularlocalizationanalysis，domainanalysis，GOfunctionalanalysis，

KEGGsignalingpathwayannotationanalysis，proteininteractionwereanalyzed.【Result】Atotalof21856peptideswere

identified，ere144subcellularproteins，

including89up-regulatedproteinsand55down-regulatedproteins.144yakantifreezedifferentialproteinsweresubcellu-

larmappedto7items，including56nuclearproteins，51cytoplasmicproteins，24plasmamembraneproteins，23extra-

cellularproteins，18mitochondrialproteins，of194domainswere

chmentoffunctionanalysisindicatedthat，biologicalprocessmainlyenrichedtocellprotein79，70

metabolicprocessproteinand42regulationprotein，molecularfunctionmainlyenrichedtocombinefunctionalprotein75

and64catalyticactivityoftheprotein，cel

144yakantifreezedifferentialproteinswereannotatedinto205KEGGsignalingpathwaysinKEGGdataba，which

mainlyinvolvedinribosomes，nitrogenmetabolism，cytoplasmicDNAnsing，invivothermogenesis，oxidativephos-

phorylation，oundthatL8IHE5hadthehighestcorrelation，andcold-in-

ducedRNA-bindingproteins（CIRP）andHSP70bindingproteinhadmoreinteractioninthenetwork.【Conclusion】Ac-

cordingtoTMTproteomics，144differentialantifreezeproteins（89up-regulatedproteinsand55down-regulatedpro-

teins）areidentified，amongwhichCIRPandHSP70areup-regulatedundercoldstress，whichcanpromoteyakbodyto

adapttolowtemperatureenvironment，andcanbeudascandidatemolecularmarkersforyakantifreezebreeding.

Keywords：yak；TMTproteomics；bioinformatics；coldresistance；differentialproteins

Foundationitems：GuangxiScienceandTechnologyMajorSpecialProject（GuikeAA17204028）；TibetAcademy

ofAgriculturalandAnimalHusbandrySciences/StateKeyLaboratoryofHullessBarleyandYakGermplasmResources

andGeneticImprovementOpen-project（XZNKY-2020-C-007K05）

1期·3·

（Inglital.，2006；Gamhametal.，2008）、昆虫

（Meisteretal.，2015）、植物（Jietal.，2017；Sperotto

etal.，2018）及菌类（Muñozetal.，2017）等物种上，

其中又以鱼类的研究最深入（钟其旺和樊廷俊，

2002；Martínez-Páramoetal.，2009；Duman，2015）。

Kim等（2019）对南极鱼亚目物种基因组中的高度保

守核苷酸片段（Conrvednucleotideelements，CNEs）

进化模式进行分析，结果发现南极鱼类对血红细胞

发生过程的调控是适应低温的一个重要机制；Daane

等（2020）研究表明，在长期的低温环境下CNEs存在

快速突变功能丢失的趋势；Ren等（2021）从基因层面

开展研究，发现通路MAPK在鱼类低温应激中占据

重要位置，且可能与其他重要的通路如TGF-Bata等

存在复杂联系。在高寒地区，植物在面对低温环境

也会产生抗寒机制的产物，但其含量远低于鱼类的

抗冻蛋白（Jietal.，2017）。在大部分昆虫体内都存

在抗冻蛋白，其含量较鱼类抗冻蛋白高10~100倍，且

其蛋白结构存在明显差异（Meisteretal.，2015）。此

外，有研究已将抗冻蛋白添加至化妆品中，通过皮肤

吸收能起到保护皮肤、防止皮肤冻伤的作用，即可用

于高级防冻化妆品（EvansandFletcher，2004；巩子

路，2015）。可见，抗冻蛋白对于不同物种发挥抗冷

性能均有重要意义。【本研究切入点】不同物种为适

应外界环境条件的变化，通常会产生应对环境条件

变化的相关产物，目前国内外针对抗冻蛋白已有深

入研究（钟其旺和樊廷俊，2002；Martínez-Páramoet

al.，2009；Duman，2015），但有关我国牦牛抗逆性及

其抗冻蛋白方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问

题】基于TMT（Tandemmasstag）蛋白组学及生物信

息学分析对牦牛抗冻蛋白进行筛选研究，旨在阐明

牦牛抗寒性能机理，并进一步从营养学角度提高其

代谢性能，为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供

科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试牦牛由西藏农牧科学院畜牧兽医研究所

改则县古姆乡和斯布牦牛养殖基地提供，分别于气

候寒冷的冬春季（1月）和气候温和的夏季（8月）采集

6~8岁经产牦牛耳组织样品，各8头，-80℃低温保存

备用。TMT分子标记试剂盒购自美国ThermoFisher

公司，BCA试剂盒购自南京诺威赞生物科技股份有

限公司，乙腈和超纯水购自FisherChemical公司，

SDS、三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）、尿

素及四乙基溴化铵等试剂购自Sigma公司。

1.2蛋白提取和肽段酶解

分别设寒冷季节组和温暖季节组，其中，寒冷

季节组3个重复（CON-1、CON-2和CON-3），温暖季

节组3个重复（T-1、T-2和T-3）。采用SDT裂解法（4%

SDS，100mmol/LTris/HCl，0.1mol/LDTT，pH7.6）

提取蛋白，取适量蛋白使用FASP（Filteraidedpro-

teomepreparation）进行胰蛋白酶酶解（Wiśniewski

etal.，2009），并以C18Cartridge对肽段进行脱盐；冻

干后的肽段加入40μL0.1%甲酸溶液复溶，应用

TMT标记不同样品中的同一蛋白，再以BCA法进行

定量分析（贾银海，2018）。

1.3TMT分子标记

取100μg肽段按TMT分子标记试剂盒说明分

别对各样品进行标记（葛泽勇，2018）。RP（反相）分

级：采用HighpHReverd-PhaPeptideFractiona-

tionKit对TMT标记的每组肽段等量混合后进行分

级（葛泽勇，2018）。以乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）

进行色谱柱平衡，将TMT标记肽段混合样品上样，低

速离心脱盐，然后依次用不同梯度浓度的高pH乙

腈溶液对结合肽段进行梯度洗脱。真空干燥后，以

12μL0.1%脂肪酸（FA）进行复溶，于280nm处测定

肽段浓度。阳离子交换柱（SCX）分级：采用AKTA

Purifier100对TMT标记的每组肽段混合后进行分级

（葛泽勇，2018）。缓冲液A液［10mmol/LKH2PO4，

25%乙腈，pH3.0］，B液（10mmol/LKH2PO4，500

mmol/LKCl，25%乙腈，pH3.0）。A液平衡色谱柱，

以1mL/min的流速经色谱柱进行分离。B液梯度如

下：0%，25min；0%~10%，25~32min；10%~20%，32~

42min；20%~45%，42~47min；45%~100%，47~52

min；100%，52~60min；60min后B液重设为0%

（蒋少秋，2020）。洗脱过程监测214nm处的吸光值

（OD214），每隔1min收集1次洗脱组分，冻干后采用

C18Cartridge进行脱盐（蒋少秋，2020）。

1.4LC-MS/MS数据采集

采用纳升流速的HPLC液相系统EasynLC对每

份样品进行分离（张弛，2020）。缓冲液A液为0.1%

甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为

84%）。95%的A液平衡色谱柱，样品通过进样器上

样至C18反相分析柱（ThermoScientificAcclaimPep-

Map100，100μm×2cm，nanoViperC18），采用B液线

性梯度分离，以300nL/min的流速流经分析柱（Ther-

moScientificEASYcolumn，10cm，ID75μm，3μm，

C18-A2），再用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析，并采

集数据（杨重晖，2020）。

贾银海等：基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

53卷南方农业学报·4·

1.5蛋白鉴定及定量分析

采用Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.4对

质谱分析原始数据进行鉴定及定量分析（贾银海，

2018）。

1.6生物信息学分析

1.6.1亚细胞定位分析采用CELLO（http://cello.

/）进行亚细胞定位预测，即以多重支

持向量机（multi-classSVM）的机器学习方法对公共

数据库中已知亚细胞定位信息的蛋白序列数据进行

建模，预测待检索蛋白亚细胞定位情况。

1.6.2蛋白结构域分析使用Pfam数据库的Inter-

ProScan数据包，采用运行扫描算法对蛋白序列进行

功能表征预测，以获得目标蛋白序列在Pfam数据库

中的结构域注释信息。

1.6.3GO功能富集分析利用Blast2GO对目标蛋

白集合进行GO功能富集分析，具体分析过程可归纳

为序列比对（BLAST）、GO条目提取（Mapping）、GO

注释（Annotation）及InterProScan补充注释（Annota-

tionaugmentation）等（贾银海，2018）。

1.6.4KEGG信号通路注释分析利用KAAS（KEGG

automaticannotationrver）对目标蛋白集合进行

KEGG信号通路注释分析（贾银海，2018）。

1.6.5蛋白相互作用网络分析依据IntAct（http://

/intact/）或STRING（http://

/）数据库分析蛋白间的连接数，预测

蛋白与蛋白间的相互作用关系，同时以CytoScape

3.2.1绘制蛋白相互作用网络结构图并进行分析（贾

银海，2018）。

1.6.6蛋白层次聚类分析首先对目标蛋白集合

的定量信息进行归一化处理，即归一化至（-1，1）区

间；使用ComplexHeatmapVersion3.4从抗冻差异蛋

白样本及其表达量2个维度进行分类，并生成层次聚

类热图（杨重晖，2020）。

2结果与分析

2.1牦牛抗冻蛋白鉴定结果

由图1和图2可知，经Mascot2.2鉴定和Pro-

teomeDiscoverer1.4定量分析共获得433236张总谱

图（Totalspectra）。其中蛋白谱图（Spectra）45950

张；肽段（Peptide）数量为21856个，其中特有肽段

（Uniquepeptide）数量为18452个；蛋白（Protein）数量

为4527个，定量到的蛋白数量为4519个。对牦牛抗

冻差异蛋白进行筛选，结果筛选获得144个差异蛋

白，其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。

2.2亚细胞定位预测结果

CELLO亚细胞定位预测结果表明，144个牦牛

抗冻差异蛋白定位到7个条目上（图3），分别是细胞

核（Nuclear）蛋白56个、细胞质（Cytoplasmic）蛋白51

个、质膜（Plasmamembrane）蛋白24个、细胞外（Ex-

tracellular）蛋白23个、线粒体（Mitochondrial）蛋白18

个及其他蛋白2个［细胞骨架（Cytoskeleton）蛋白1个

和溶酶体（Lysosome）蛋白1个］。

2.3蛋白结构域分析结果

通过评价鉴定获得蛋白在某个结构域条目下

图1牦牛蛋白鉴定信息统计结果

Fig.1Theinformationstatisticsofproteinidentificationinyak

图2牦牛抗冻差异蛋白定量分析结果

Fig.2Quantitativeresultofdifferentialproteinincoldresis-

tanceofyak

图3牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位分析结果

Fig.3Subcellularlocalizationanalysisofdifferentialprotein

incoldresistanceofyak

Plasmamembrane，24Extracellular，23

Mitochondrial，18

Cytoplasmic，51

Others，2

Nuclear，56

1期·5·

的富集水平及对应的差异蛋白，对牦牛抗冻差异蛋

白进行结构域分析，共鉴定到194个结构域，排名前

20位的结构域分析结果如图4所示。其中，Uteroglo-

binfamily（子宫珠蛋白家族）、Copper/zincsupero-

xidedismuta（SODC）（铜/锌超氧化物歧化酶）、Zn-

fingerinRanbindingproteinandothers（含锌指Ran

结合结构域蛋白）及Acetyltransfera（GANT）family

（C-酰胺化酶家族）是机体参与抗冻应答的相关蛋白。

2.4GO功能富集分析结果

对牦牛抗冻差异蛋白进行GO功能富集分析，结

果（图5）显示，生物过程（Biologicalprocess）主要富

集到细胞过程（Cellularprocess）蛋白79个、代谢过程

（Metabolicprocess）蛋白70个和生物调控（Biologi-

calregulation）蛋白42个等，分子功能（Molecular

function）主要富集到结合功能（Binding）蛋白75个和

催化活性（Catalyticactivity）蛋白64个等，细胞组分

（Cellularcomponent）主要富集到细胞部分（Cell

part）蛋白89个和细胞（cell）蛋白89个等。在生物过

程中，Cellularcarbohydratemetabolicprocess（细胞

碳水化合物代谢过程）上调，而Energyrervemeta-

bolicprocess（能量储备代谢过程）、Oxidation-reduc-

tionprocess（氧化还原反应过程）、Cellularglucan

metabolicprocess（细胞糖代谢过程）、Regulationof

glucometabolicprocess（细胞糖代谢调控过程）及

Cellularcarbohydratecatabolicprocess（细胞碳水化

合物分解代谢过程）等条目下调；在分子功能中，Ox-

idoreductaactivity（氧化还原酶活性）上调，而Anti-

oxidantactivity（抗氧化活性）、Transaminaactivity

（转氨酶活性）及Catalyticactivity（催化活性）等条目

下调；在细胞组分中，Integralcomponentofmem-

brane（膜的整体组分）及Intrinsiccomponentofmem-

brane（膜的内在成分）等条目上调，而Mitochondrial

outermembrane（线粒体外膜）、Postsynap（突触后

膜）、Nuclearoutermembrane-endoplasmicreticulum

membranenetwork（核外膜—内质网膜网络）等条目

下调。

图4牦牛抗冻差异蛋白结构域分析结果

Fig.4Proteindomainanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

结

构

域

名

称

（

T

o

p

2

0

）

D

o

m

a

i

n

n

a

m

e

富集程度Enrichmentlevel

贾银海等：基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

53卷南方农业学报·6·

图5牦牛抗冻差异蛋白GO功能富集分析结果

Fig.5GOfunctionenrichmentanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

蛋白数量Numberofprotein

G

O

条

目

名

称

G

O

T

e

r

m

s

n

a

m

e

2.5KEGG信号通路注释分析结果

根据KEGG数据库对牦牛抗冻差异蛋白进行分

类注释，结果显示共注释到205条KEGG信号通路。

表1为注释获得的前10条KEGG信号通路，主要涉及

核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、

氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。

2.6牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析结果

由CytoScape3.2.1绘制的牦牛抗冻差异蛋白相

互作用网络结构图（图6）可看出，关联度排名前10位

的抗冻差异蛋白为L8IHE5、L8I961、A0A6B0RV13、

A0A6B0RUX6、A0A6B0QW44、A0A6B0QZV0、

L8I1Z6、A0A6B0RR94、A0A6B0RJ65和L8IPU4，关

联度最高的是L8IHE5。其中，A0A6B0RV13为冷诱

导RNA结合蛋白（ColdinducibleRNAbindingpro-

tein，CIRP），L8I1Z6为HSP70结合蛋白。CIRP和

HSP70蛋白在冷应激条件下均呈上调趋势，可作为

牦牛抗冻性育种的候选蛋白基因。

2.7牦牛抗冻差异蛋白的表达量聚类分析结果

由图7可知，对6个样品组的抗冻差异蛋白定量

数据（样本维度和表达量维度）进行分层聚类分析，

1期·7·

通路号PathwayID

Bom03010

Bom00910

Bom04623

Bom04714

Bom00190

Bom04657

Bom04020

Bom04979

Bom04142

Bom04612

通路名称Pathwayname

核糖体

氮代谢

胞质DNA感受

动物体内生热作用

氧化磷酸化

白细胞介素-17

钙离子信号

胆固醇代谢

溶酶体

抗原处理和表示信号

通路数量Pathwaynumber

2

1

1

1

1

1

1

1

1

1

基因名称Genename

L8IHE5/A0A6B0QRF1

L8IQC8

L8I6W3

L8HSQ2

L8HRN2

L8HMR5

A0A6B0RMJ1

A0A6B0RCD8

L8IFQ8

L8HQ73

P

0.00663

0.00626

0.00110

0.00729

0.00694

0.00133

0.00155

0.00177

0.00309

0.00398

表1牦牛抗冻差异蛋白KEGG信号通路注释分析结果（排名前10）

Table1TheresultsofKEGGsignalpathwayannotationofdifferentialproteinincoldresistanceofyak（Top10）

图6牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析结果

Fig.6Networkinteractionanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

每列代表1组样品（横坐标为样品信息），每行代表

1个蛋白（纵坐标为显著差异表达蛋白），其中，红色

代表显著上调蛋白，蓝色代表显著下调蛋白，灰色部

分代表无蛋白信息。分层聚类分析结果显示：寒冷

季节组（CON-1、CON-2和CON-3）牦牛抗冻差异蛋

白表达量的上调和下调趋势较一致，CON-2和CON-3

先聚为一类，再与CON-1聚为一类；温暖季节组（T-1、

T-2和T-3）牦牛抗冻差异蛋白表达量的上调或下调

趋势与寒冷季节的基本一致，T-2和T-3先聚为一类，

再与T-1聚为一类，最终形成与寒冷季节组（CON-1、

CON-2和CON-3）明显不同的簇。

3讨论

TMT是ThermoScientific公司推出的一种应用

广泛、基于体外同位素标记的相对与绝对定量蛋白

组学技术，利用同位素试剂标记蛋白酶解后产生的

贾银海等：基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

53卷南方农业学报·8·

图7牦牛抗冷差异蛋白的分层聚类分析结果

Fig.7Hierarchicalclusteranalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

CON-1CON-2CON-3T-1T-2T-3

-0.4-0.20.00.20.4

1期·9·

多肽，可同时比对分析多达16种样品间的蛋白表达

量（Rostal.，2004）。TMT标记的不同样本中同一

蛋白均表现出相同的质荷比，等量混匀后，经高质

量、高精度和高分辨率的质谱分析，可保持良好的质

量偏差，其鉴定结果准确可靠；经数据库分析即可获

得不同样本中各蛋白的相对定量比值，进而筛选出

差异表达蛋白。本研究采用TMT结合液相色谱和串

联质谱联用的方法成功对牦牛耳组织蛋白进行分离

和鉴定，结果鉴定获得特有肽段（Uniquepeptide）序

列18452个，鉴定获得4527个蛋白（Protein），其中定

量到的蛋白数量为4519个。可见，TMT可标记所有

肽段，适用于任何类型的样本鉴定，具有高通量的特

点，且可信度高。

本研究应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节和

温暖季节的牦牛抗冻蛋白进行挖掘，并对鉴定到的

牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富

集及KEGG信号通路注释等生物信息学分析。在亚

细胞定位分析中，144个牦牛抗冻差异蛋白共鉴定到

7个条目上，分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51

个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18

个、细胞骨架蛋白1个及溶酶体蛋白1个。在结构域

分析中，共鉴定到194个结构域，其中，子宫珠蛋白家

族上调，可能与动物肌体防御外界不同环境条件变

化，促进肺组织发育及提高自身免疫力有关（厉双慧

等，2020）；铜/锌超氧化物歧化酶和C-酰胺化酶家族

下调，则与高寒缺氧条件下机体内摄入的抗氧化营

养素（铜和锌）不足，不能维持自由基低浓度的动态

平衡，新陈代谢功能及抵抗力降低有关，与贾银海等

（2021）研究牦牛毛微量元素与其抗寒性能的关联分

析结果一致。GO功能富集分析结果显示，在生物过

程中，细胞碳水化合物代谢过程上调，而能量储备代

谢过程、氧化还原反应过程、细胞糖代谢过程、细胞

糖代谢调控过程及细胞碳水化合物分解代谢过程等

下调；在分子功能中，氧化还原酶活性上调，而抗氧

化活性、转氨酶活性及催化活性等下调；在细胞组分

中，膜的整体组分和膜的内在成分等上调，线粒体外

膜、突触后膜及核外膜—内质网膜网络等则下调。

根据KEGG数据库对牦牛抗冻差异蛋白进行分类注

释，结果共注释到205条KEGG信号通路，主要涉及

核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作

用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等

通路。

本研究还鉴定出冷诱导RNA结合蛋白（CIRP），

该蛋白是在哺乳动物细胞内首个发现的冷休克蛋

白，由172个氨基酸残基组成，含有2个明显的结构域

（Leeetal.，2015）。已有研究表明，缺氧、紫外线辐

射、缺糖、热应激和过氧化氢均可调节大鼠血清中

CIRP的表达，提示CIRP是一种应激反应蛋白（Lleon-

art，2010）。在应激条件下，肠系膜细胞可从细胞核

迁移至细胞质，通过其靶基因3'端的结合位点调节

mRNA稳定性（Sakuraietal.，2006）。CIRP参与多种

细胞过程，包括细胞增殖、细胞存活、昼夜节律调节、

端粒维持及肿瘤的形成和发展（Lleonart，2010）。

CIRP在25℃下被诱导产生（Sakuraietal.，2006），特

别是在低温、缺氧和强紫外线的胁迫下，其表达量显

著增加，表明冷诱导产生的CIRP能促使牦牛肌体适

应低温环境（Al-FageehandSmales，2009）。

热休克蛋白（HSPs）是由细胞核内高度保守的

热应激基因所编码（Lanneauetal.，2008）。HSPs作

为蛋白分子伴侣存在，参与细胞内蛋白肽链空间结

构的形成，促进蛋白向内质网移动，对调节细胞稳态

具有重要作用（黄建芳等，2015；伍钢等，2020）。此

外，HSPs能被冷应激过后的复温过程所诱导（Lan-

neauetal.，2008）。在冷应激条件下HSPs能迅速表

达，因此可作为冷应激反应的分子生物标记。本研

究从牦牛耳组织蛋白中鉴定获得HSP70、HSP90、

HSP110和HSP27，尤其是HSP70当肌体受到冷应激

时会显著升高，与其能与细胞内其他分子以不稳定

的结构结合有关。

4结论

基于TMT蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行

挖掘，结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白

89个，下调蛋白55个），其中CIRP和HSP70在冷应激

条件下呈上调趋势，能促使牦牛肌体适应低温环境，

可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。

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（责任编辑兰宗宝）

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