pparγ

PPARγ介导卡托普利改善高糖诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗

的作用

严国强;陈春香;陈芳辉;高艳;储佳佳;李腾;黄起壬

【摘要】AimToinvestigatetheroleofcaptoprilininsulinresistanceof

ementeffect

ECs

wereededina6-wellplateandwereran-domlydividedinto5

groups,namely,controlgroup,IRgroup,IRtogetherwithdifferentCap

concentrations(low,mediumandhighconcentration),respectively.

ementeffectofCaponinsulinresistancewasmediatedby

PPARγwereran-domlydividedinto6

groups,namely,controlgroup,control+PPARγinhibitor(PI)(1.0μmol·L-1)

group,IRgroup,IR+PI(1.0μmol·L-1)group,IR+Cap(1×10-5mol·L-1)

group,andIR+Cap+PI(1.0μmol·L-1)icatorsweredetected.

ResultsAfterHUVECswereincubatedwithmediacontaining33mmol·L-1

ofglucofor48h,theNOlevelsweresignificantlydecreadwhileET-1

levelsweresignificantlyelevated,showingasignificantdiffer-encebetween

IRgroupandcontrolgroup(P<0.01).Theexpressionlevelsof

PPARγmRNAanditsproteinweresomewhatup-regulated,buttherewas

nosignifi-cantdifferencebetweenIRgroupandcontrolgroup

(P>0.05).WhentheHUVECsinIRgroupweretreatedwithDMEM

containinggluco(33mmol·L-1)for48handinsulinfor30min,the

expressionlevelsofPPARγmRNAanditsproteininCapgroupsweresimi-

lartothointheIRgroup,andtherewasnosignifi-cantdifference

betweenthetwogroups(P>0.05);however,theexpressionlevelsof

phosphorylatedPPARγproteininCapgroupswereincreadcompared

withIRgroup(P<0.05).ThelevelsofNOweresig-nificantlyincread

whereasthelevelsofET-1weredecreadinCapgroups,whichhad

significantdiffer-encescomparedwithIRgroup(P<0.05).Nonethe-

less,pre-treatingwithGW9662,aPPARγinhibitor,theimprovementeffects

sionsCaptoprilcouldimprove

highgluco-inducedinsulinresistanceofendothelialcellsmediatedby

PPARγ,andtheunderlyingmechanismsarerelatedtotheactivationof

PPARγ,ratherthanitxpression.%目的：研究卡托普利（captopril，Cap）对

高糖（highglu-co，HG，33mmol·L－1）诱导的人脐静脉内皮细胞

（humanumbilicalveinendotheliumcells，HUVECs）胰岛素抵抗（insulin

resistance，IR）的作用及机制。方法首先观察Cap对HG（33mmol·L－1）

诱导的HUVECsIR的改善作用。实验随机分为5组，即正常对照（Control）组、

IR组、IR＋CapⅠ（1×10－6mol·L－1）组、IR＋CapⅡ（1×10－5mol·L－

1）组、IR＋CapⅢ（1×10－4mol·L－1）组。其次证实Cap改善HG（33

mmol·L－1）诱导HUVECsIR的作用是由PPARγ介导。实验随机分为6组，即

Control组、IR组、IR＋Cap（1×10－5mol·L－1）组、PPARγ抑制剂

GW9662（PI，1.0μmol·L－1）组、IR＋PPARγ抑制剂（IR＋PI，1.0μmol·L

－1）组、IR＋Cap＋PPARγ抑制剂（IR＋Cap＋PI，1.0μmol·L－1）组，除

Control组和PI组外，所有各组先用含33mmol·L－1葡萄糖的DMEM培养

48h，Cap各组再加不同浓度的Cap处理4h，最后胰岛素（100nmol·L－1）

处理30min，抑制剂组再加抑制剂（1.0μmol·L－1）处理1h，最后进行指标检

测。结果IR组NO水平明显降低、ET-1含量明显升高，提示细胞已产生IR，但

PPARγmRNA和蛋白表达水平与Control组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；

Cap呈浓度依赖性逆转HG诱导NO和ET-1水平的改变，明显增加磷酸化

PPARγ（P-PPARγ）水平，说明其可明显改善HG诱导的IR，但对

PPARγmRNA和蛋白表达水平无明显影响（vsIR，P＞0.05）；加PI处理后，

Cap改善IR的作用完全取消，提示Cap改善IR的作用是由PPARγ介导。结论

Cap可通过PPARγ介导改善高糖所致血管内皮细胞IR，其机制可能与PPARγ表

达水平无关，而与PPARγ激活有关。

【期刊名称】《中国药理学通报》

【年(卷),期】2015(000)004

【总页数】6页(P532-536,537)

【关键词】卡托普利;高糖;人脐静脉内皮细胞;胰岛素抵抗;PPARγ;NO;ET-1

【作者】严国强;陈春香;陈芳辉;高艳;储佳佳;李腾;黄起壬

【作者单位】江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006;江西省基础药理学重点实验室;南昌大学药学院药理学教研室，江西

南昌330006

【正文语种】中文

【中图分类】R322.12;R458.5;R543.02;R587.1;R972.4;R977.6

现代医学研究表明，血管内皮胰岛素抵抗是糖尿病发生血管并发症的始动环节，是

滋生多种代谢相关疾病的共同“土壤”[1-2]。但目前，国内外对其发病机制尚不

完全清楚。因此,阐明血管内皮IR发生的分子机制，发现糖尿病防治药物新的分子

作用靶点及开发新的防治药物，对于降低糖尿病患者心脑血管事件发生，改善患者

生存质量具有重要意义。PPARγ是过氧化物增殖酶体激活受体超家族(PPARs)的

成员之一，是体内糖代谢和脂肪细胞分化的重要调节因子，是胰岛素增敏剂噻唑烷

二酮类的靶标[3]，能改善血管内皮细胞对胰岛素的敏感性，机制可能与其激活了

PPARγ依赖的胰岛素信号转导途径有关。另外，PPARγ也能在配体依赖方式下通

过抑制其他转录因子，如NF-κB及活化剂蛋白-1家族，从而直接地抑制促炎症基

因的表达[4-5]。研究证实前列腺素衍生物如15-脱氧前列腺素J2(15-d-PGJ2)是

PPARγ的天然激动剂[6-7]。

卡托普利(captopril，Cap)是第一代的血管紧张素转化酶抑制剂，临床广泛用于合

并了糖尿病的高血压或心衰患者的治疗。有研究证实，Cap可通过增加前列腺素

衍生物、缓激肽(bradykinin,BK)水平来改善IR[8-9]，那么，它能不能通过直接改

变PPARγ的表达或活性来改善IR，目前相关报道甚少，因此，本实验探讨卡托普

利改善内皮细胞胰岛素抵抗的机制，为寻找糖尿病血管病变防治的分子靶点拓展新

的思路。

1.1细胞株及血清培养基实验用HUVECs株购自美国ATCC(CatalogNo:CRL-

1730)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基购自

GibcoBRL公司。

1.2药品及试剂NO检测试剂盒购自BeyotimeInstituteofBiotechnology；ET-

1试剂盒购自上海RD生物公司；卡托普利购自上海普康公司；PPARγ抑制剂

(GW9662)购自美国Sigma；PPARγ多克隆抗体购自美国CellSignaling；

PPARγ磷酸化抗体购自美国SantaCruzBiotechnology；β-actin多克隆抗体购

自美国SantaCruz；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、RNA

酶抑制剂、dNTP、Oligo(dT)15、Taq酶均购自PromegaCorporation；引物购

自上海捷瑞生物公司；其它各种化学试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.3实验分组及处理方法

1.3.1Cap对HG诱导的HUVECsIR的改善作用将HUVECs均匀接种在六孔培养

板上，随机分为5组，即Control组、IR组、IR+CapⅠ(1×10-6mol·L-1)组、

IR+CapⅡ(1×10-5mol·L-1)组、IR+CapⅢ(1×10-4mol·L-1)组。除Control组

(5.5mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养48h)外，所有各组先用含33mmol·L-1葡

萄糖的DMEM培养48h，Cap各组再加不同浓度的Cap处理4h，最后胰岛素

(100nmol·L-1)处理30min，收集细胞上清液和细胞，分别进行指标检测。

1.3.2Cap改善HG诱导HUVECsIR的作用是由PPARγ介导将HUVECs均匀接

种在六孔培养板上，随机分为6组，即Control组、IR组、IR+CapⅡ(1.0×10-

5mol·L-1)组、PPARγ抑制剂GW9662(PI，1.0μmol·L-1)组、IR+PPARγ抑制

剂(IR+PI，1.0μmol·L-1)组、IR+Cap(1.0×10-5mol·L-1)+PPARγ抑制剂

(IR+Cap+PI，1.0μmol·L-1)组，除Control组和PI组(5.5mmol·L-1葡萄糖的

DMEM培养48h)外，所有各组先用含33mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养48h，

Cap各组再加不同浓度的Cap处理4h，最后胰岛素(100nmol·L-1)处理30

min，抑制剂组再加抑制剂GW9662(1.0μmol·L-1)处理1h，收集细胞上清液和

细胞，分别进行以下指标检测。

1.4HUVECs中NO、ET-1水平的检测(a)参照碧云天生物技术研究所一氧化氮检

测试剂盒的使用说明，先做出标准曲线，然后根据各组吸光度，计算出各组NO

的含量。(b)参照人内皮素(ET)酶联免疫试剂盒的使用说明，先做出标准曲线，然

后根据各组吸光度，计算出各组ET-1的含量。

1.5Westernblot检测HUVECs内PPARγ、P-PPARγ蛋白的表达细胞经实验因

素处理后，经PBS清洗后，用RIPA裂解液进行裂解，蛋白浓度用BCA试剂盒进

行测定，细胞裂解物溶于上样缓冲溶液煮沸后经10%的SDS-PAGE电泳分离，并

电转到PVDF膜上，取出后将膜放入质量浓度均为50g·L-1的脱脂牛奶或者BSA

中封闭2h，再用TBST洗膜3次，每次15min。将膜放入一抗中(1∶750)，4℃

孵育过夜。TBST冲洗膜后，将膜放入相应的二抗(1∶2000)中，室温平摇2h后，

漂洗3次，每次20min，用ECL化学发光法进行检测。将曝光条带进行X光胶

片扫描后，在医学图形分析系统ImageTool软件上进行分析，将所得PPARγ蛋

白带的综合密度分别除以对应组β-actin的综合密度后，Excel表中进行分析。

1.6HUVECsPPARγmRNA表达检测PCR扩增所用引物由上海生物工程有限公

司合成，PPARγ上游引物：5′-TCTGGCCACCAACTTTGGG-3′；下游引物：5′-

CTTCACAAGCATGAACTCCA-3′，PCR扩增片段长度为360bp。内参β-actin

上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物：5′-TGGAAGGTGG

ACAGCGAGG-3′，PCR扩增片段长度为268bp。PCR扩增体系为25μL，其中

cDNA为5μL，上、下游引物各1.0μL，2XTag酶为12.5μL，再用无菌三蒸水

补至25.0μL。PCR循环参数为30，94℃预变性5min，94℃变性45s，扩增

PPARγ为61℃退火30s，扩增β-actin为55℃退火45s，72℃延伸45s，最后

72℃延伸5min。取扩增产物6μL上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在透射紫外光

分析仪下摄影，并在电脑上用ImageTool图像处理软件进行处理。

1.7统计学处理各实验组数据以±s表示，采用统计软件SPSS12进行方差齐性检

验、单因素方差分析，组间比较用LSD法。

2.1Cap呈浓度依赖性改善HG诱导HUVECs胰岛素抵抗血管内皮IR评价指标常

用血清或培养上清液中NO和ET-1水平来表示。IR组与Control组比较，NO水

平明显降低、ET-1水平明显升高(P<0.01vsControl)；用低剂量的卡托普利处理

4h后，与IR相比NO水平明显升高且差异有显著性(P<0.05vsIR)，而ET-1水

平与IR组比较组间差异没有统计学意义(P>0.05)；中、高剂量的卡托普利处理后，

NO升高更明显(P<0.01vsIR)，ET-1水平明显降低(P<0.05)，见Fig1。

2.2Cap改善HG诱导HUVECs胰岛素抵抗是由PPARγ介导见Fig2。PI组与

Control组比较，NO、ET-1水平无明显差异(P>0.05)；IR+PI组与IR组比较，

NO、ET-1水平差异也无统计学意义(P>0.05)；IR+Cap组与IR组相比NO水平

明显升高、ET-1水平明显下降(P<0.01)；而IR+Cap+PI组与IR+Cap组相比

NO水平明显下降、ET-1水平明显升高(P<0.01)。

2.3Cap对HUVECs胰岛素抵抗时PPARγmRNA表达的影响PPARγmRNA各

组样本均由对应的β-actin条带的扫描值标化再与Control组比较。PPARγ

mRNA在正常HUVECs中呈基础性表达；HUVECs暴露在高糖培养液中48h后，

PPARγmRNA的表达与Control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Cap组

中内皮细胞的PPARγmRNA的表达量与IR组相比组间无明显差异(P>0.05)，见

Fig3。

2.4Cap对HUVECs胰岛素抵抗时PPARγ和P-PPARγ蛋白表达的影响PPARγ

各组样本均由对应的β-actin条带的扫描值标化。PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白在

正常HUVECs中呈基础性表达。IR组中PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白表达量无明

显变化，与Control组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；Cap组中内皮细胞的

PPARγ蛋白的表达量与IR组相比亦无明显差异(P>0.05)；而低、中剂量Cap组

中内皮细胞的P-PPARγ蛋白的表达量较IR明显升高，差异具有统计学意义

(P<0.05)；而高剂量Cap组与IR组相比P-PPARγ蛋白的表达无明显差异

(P>0.05)，见Fig4。

卡托普利可以改善胰岛素抵抗，已有大量的资料证实。可能的作用机制目前有以下

几个方面：通过扩血管效应，增加骨骼肌的血流，可促使葡萄糖和胰岛素向胰岛素

敏感组织释放，增加葡萄糖的利用；通过改善胰腺的血液循环从而提高胰岛β细

胞的代谢，促进胰岛素分泌，加强靶细胞功能，提高胰岛素的生物效应，改善胰岛

素抵抗[10-11]；Captopril还能通过抑制血管紧张素转换酶活性，使组织内BK降

解减少，局部血管BK浓度增高，BK具有扩张血管和降压作用，BK是血管内皮L-

精氨酸-NO途径的重要激活剂，它作用于内皮的β2受体能引起血管内皮超极化因

子及NO的释放，BK降解减少还能进一步促进15-d-PGJ2合成，而15-d-PGJ2

是PPARγ的天然激动剂。

在我们的前期工作中，从整体动物、细胞和分子水平观察了PPARγ经典配体如罗

格列酮(RG)或匹格列酮(PG)对高糖诱导血管内皮胰岛素抵抗的作用，探讨了其可

能的作用机制。结果表明，无论RG或PG预处理和后处理，PG和RG均能明显

改善HG诱导HUVEC胰岛素抵抗，其机制是通过非经典PPARγ依赖的NF-κB

转录抑制途径(underrevision)。PPARγ表达很广泛，包括脂肪细胞、内皮细胞、

血管平滑肌细胞、巨噬细胞和心肌细胞等[12]。

本实验中，卡托普利改善胰岛素抵抗是否通过PPARγ来介导的目前机制还并不清

楚。实验中用高糖(33mmol·L-1)处理内皮细胞48h后再用胰岛素处理0.5h，取

其细胞上清测NO和ET-1水平，发现其NO水平比正常组明显下降，且差异具有

统计学意义；ET-1水平明显升高，且差异具有统计学意义。证明胰岛素抵抗的模

型建立成功。胰岛素抵抗模型建立后，在预实验中，我们设计了卡托普利浓度梯度

(10-8～10-2mol·L-1)，结果发现，浓度≤10-7mol·L-1时，Cap对细胞活力和

胰岛素抵抗程度均没有影响；而浓度≥10-3mol·L-1时，细胞活力明显下降，表

现出明显地细胞毒性。因此，我们就选择了1.0×10-5mol·L-1的浓度。用Cap处

理4h后，其NO水平比IR组明显升高，ET-1水平比IR组明显降低，PPARγ蛋

白表达水平与IR组相比无明显改变，但P-PPARγ蛋白表达水平比IR组升高。结

合文献资料可能存在机制：在高糖和胰岛素的刺激下，内皮细胞受损，导致NO

的分泌减少，ET-1的分泌增多，而这两类物质动态平衡维持着血管的正常状态和

功能。用Cap处理4h后，Cap可以使内皮细胞内BK的减少，进而促进15-d-

PGJ2的生成，15-d-PGJ2是PPARγ的天然激动剂，可以使PPARγ磷酸化途径

被激活，进而改善胰岛素抵抗。

综上所述，卡托普利可以促使P-PPARγ蛋白的表达上调，PPARγ与胰岛素信号

之间亦存在着正反馈机制；PPARγ可通过转录激活作用增加靶基因的表达或激活

来发挥作用。活化的PPARγ能抑制脂肪细胞表达肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，减轻

TNF-α诱发的胰岛素抵抗，且通过增加c-CBL相关蛋白及胰岛素受体底物2的表

达，增强胰岛素的信号转导，从而改善胰岛素抵抗。

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