dgge

.1

Jan.

，

2020

第48卷第1期酿酒

*°*

"年"月LIQUORMAKING

文章编号:1°°2

—8110(2)21

)°1—

°°37-°5首届“

川酒杯

”全国白酒技术

论文有奖征文大赛获奖论文

PLFA法和DGGE法分析制曲过程微生物群落变化

赵金松",刘茗铭2,周荣清$

(1.四川轻化工大学，四川自贡

643000;2.

四川省酒业集团有限责任公司，四川泸州646000;

3.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065)

摘要:同时采用PLFA(Phospholipidfattyacid)谱图分析法和DGGE(Denaturinggradientgelelectrophoresis)法

分析大：制：过程中微生物群落的变化

。结果表明：真菌类微生物生物量呈现先下降后上升趋势，发酵第7天各

种微生物含量达到极限值,随后呈下降的趋势

。通过贮存期间的不断筛选和驯化，逐渐形成了大：

制作过程中稳

定的微生物群落结构。通过DGGE对大：制：过程的微生物群落结构分析,细菌共检测到20条带，包括魏斯氏

菌属、芽抱杆菌属、乳酸菌属、杆菌属、球菌属，其中芽抱杆菌所占的比例最高，其次为乳酸菌属。在制：过程中的

真菌优势谱带在各个培养阶段是基本相同的，仅初始阶段强度相对较弱的谱带在后期消失了。

虽然显示的信息

两种方法并不完全吻合，但也说明了不同方法表征的信息并不是绝对的，采用两种方法组合研究大

：微生物的

信息变化是很有必要的。

关键词：DGGE法;PLFA法；大：；微生物群落

中图分类号:TS262.3;TS261.1文献标识码:A

ChangesofMicrobialCommunitiesinDaquBrewingbyPLFAandDGGE

Methods

ZHAO

Jinsong1,2

,LIUMingming2,ZHOURongqing3

(e

of

Bioengineering,SichuanUniversity

ofScienceandEngineering,Zigong643000,Sichuan,China;

nLiquorgroupCo.,Ltd.,Luzhou646000,Sichuan,China;

eofLightIndustry,Textile&FoodEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,Sichuan,China)

Abstract：

Microbialcommunitystructureislittleknownatdifferentstagesduringthe

compostingprocess

duetodifficulttoculture

microbes

e-independentmethodsincludingphospholipidfattyacid(PLFA)anddenaturinggradientgelelectrophoresis

(DGGE)had

beenemployedtocharacterizethechanges

resultsshowed出at：出efungal

7thday

of

fermentation,thecontentofvariousmicroorganisms

reachedthelimitvalue,hcontinuousscreening

and

acclimationduringstorage,astablemicrobial

community

hDGGEanalysisofthemicrobialcommunitystructure

duringtheprocessof,bacteriadetectedatotalof

20bands,

includingWeislla,Bacillus,Lactobacillus,Bacillus,andCoccus,withBacillus

galdominantbandsintheprocessofDaquproductionarebasically

thesamein

eachstageofcultivation,andonlythebandswithweakerintensityin

theinitialstage

disappeared

differencesrevealedbyPLFAprofileandDGGEmethodsindicatedthatthetwomethodsis

notcompletelyconsistent,italsoshowsthatthe

cessarytou

two

methods

tostudytheinformationchangesofDaqu

igai

Keywords:DGGEmethod;PLFAmethod;Daqu;community

在大曲生产过程中，通过控制环境湿度、温度和反应，赋予了大曲特殊的功能。通常大曲生产过程分

溶氧等参数，微生物繁衍及致使发生的一系列生化为低温培菌、高温转化、后火排潮生香等主要阶段叫

收稿日期：2020—03—0E

作者简介:赵金松(1FE0-)，男，安徽寿县人，博士，教授级高级工程师，硕士生导师，主要从事酿酒生物技术及风味研究。

37

2021第一期

有学者已经报道了PLFA（Phospholipidfattyacid）技

术在研究糟1讯、窖泥盟、大曲问等酿酒微生物群落

结构及其多样性方面具有强大的功能。但是,plfa

技术不能确认具体微生物种群上的变化祸，且在有

些情况下，所得到的plfa谱图的变化可能不是微

生物种类的变化阴。DNA技术则弥补了其局限性，

目前在分子生态学上，揭示大曲微生物群落结构变

化最常用的免培养技术为DGGE技术叫呵，该技术通

过提取大曲的DNA,物的PCR

,能得到微生物群落结构的指

纹图谱。但是,DGGE-PDR技术易受环境微生物生

状态“呵。

在本文中，我们采用PLFA与DGGE组合技术,

旨在的曲过程微生物群落结构

分究，提为全面的微生物群落组

及变化的，有揭示大曲酿过

大曲用的。

1材料与方法

1.1!品来源

大曲培取样，分取=

天（）、2天（前）、3天（）、7天（高

）、9天（

降温期）10天（）的大曲，为曲

过的。取曲、靠

曲房中间的，得到的

大曲,过20目筛,-201用。

1.2PLFA分析

采用修正的Bligh-Dyer法㈣。按0.8：1：2的体

积比向一定量样品中依次加入磷酸盐缓冲液、氯仿

和甲醇,250r/min条件下振荡2ho先后加入缓冲液

和氯仿，静置过夜。氯仿相转移至试管，氮气吹

干。提取出的脂肪酸用氯仿溶解，转移至硅酸

键合固相抽提小柱，分用氯仿、丙酮、无水甲醇

洗脱，收甲醇洗脱液，氮气吹干。干燥所得

中依次加入甲苯：甲醇混合液1mL,1mL0.2mol/L

氢氧化钾-甲醇,37V水浴15mino冷却后，加

入2mL超纯水和0.3mL乙酸溶液（1mol/L）,用4mL

己烷分两萃取脂肪甲酯，取有相，氮

气吹干，加入内标物正十九酸甲酯，供GC-MS检测。

1.3DGGE分析

采用改的蛋白酶K-CTAB法提取细菌总

DNA并纯化217-186,PCR反应体系为50^L：5.0'L

10xBuffer,3.0cL25mmol/LMgCl2,4.0dL25mmol/L

dNTP混合物,1.0eL5U/gLTaq酶，引物

（10imol/L）各2.0jL,10ngDNA模板,31.0kL灭菌

双蒸水。选取引物对为27f和1492r、357f-GC和

517roPCR扩增程序，采用降落PCR：95P预变性

8min,93°C变性1min,55~45°C退火lmin,每一个循

环降低0.5°C,72°C延伸3mino共计29循环，

在最

后的循环中变性为45Z,lmin。最后

72°C延伸10mino用1%的脂检测。

总基因组DNA电泳条件：95V,电泳时间

30~35min,PCR产物DNA电泳条件：90V,电泳时间

30~35min。电泳结束后，将DGGE胶用SYBRGreenl

染色30min，总共染3次，每次染色10min，将染色后

的置系下并，图用

Quantityone软件分。对条带切胶回收，

置于1.5mL的灭菌离心管中，加入30~50|jiL的无菌

去离子水稀释溶解4。

（2过夜,然后对回收的DNA片

PCR物并PCR物DGGE，

之后用DNA纯化试回收的DNA片

物纯化,纯化的DNA用于测序。

1.4数据分析

PLFA的定性以PLFA19：0做内标物进行定量

计算。DGGE图谱采用Quantity0ne2.0软件进行分

,类分析应用SPSS16.0软件进行分。

2结果与讨论

2.1制曲过程微生物PLFA信息分析

曲曲至10天，取测PLFA

及各类微生物PLFA，结图1所示。在

所有大曲样品中，共计检出18种PLFA，包含14~20

的脂肪、脂肪、

脂肪酸、多脂肪酸及环丙烷脂肪。

其中8

种PLFA13：0、14：0、17：0、18：0、16：1

18：2

大曲（1'）,其18：26,9189

PLFA的含量较高，分别为400.53nmol/g和

66.24nmol/g。发酵的下降，4

，到7最，为

485.49nmol/g和80.39nmol/g。发酵第3天后，PLFA

的种类及有的，PLFA的增

加了1.77倍,18:236,9和18：139分别增加了

1.60及1.67倍。此外，3种PLFA（cl5：0、il5：0和

第一期

赵金松，等:PLFA法和DGGE法分析制曲过程微生物群落变化

2021

il6：

0）在发酵过程中没有被检出。在发酵过程大曲

中,16

：0、16：1+9、18：2+6,9及总PLFA含量,从制曲

初始阶段到成熟曲阶段均呈现先增加后减少的趋势。

按照Frostegard等㈣人所的方法估算样品中G@、

GB、真菌生物量及它们的比例关系，结果如图2所示。

整个过程中,表征总生物量、真核（18：2d9;18：1f9）、

G-菌（16：1i9;cyl7：0；18：1o7；cyl9：0）和G@

（al4：0、

il4：0、il5:0、il6:0和a16:0）特征的PLFA含量的变

化趋势相同。入曲房至第3天总PLFA和各类微生

物特征的PLFA减少，培至第3天开始增加，第7

天到,后减少

各类微生物比例的变迁趋势表明，真核生物量

（F）菌生物量（B）的比减少,G@细菌和

G-菌的比比较稳定,G+和G-菌后期增

幅均较大。在曲坯中测的真菌PLFA含量非常，

F/B比值较大，等的细胞中也含有较高

18：2a9和18：lc9PLFA,微生物繁衍，部分真核生

物的特征PLFA被转化，所在初期含量减少，

培增,真菌量增加,相

的

PLFA含量增加。在培养后期、

的高

温在后的培中、菌和酵的，有

菌/菌，所PLFA又减少。曲坯

中检出的G@和G-菌的总量均在最初阶段是减少。

cl5：0和i16：0PLFA也用于表征G+,但在所有的样

品中均未检出，且在第5天检出G@菌的i15：0

PLFA。试验的结果表明，培养过程中不仅是微生物

的，在同阶段，同类的微生物、

大曲的水分等变化,也导致了群落结构的变迁。

图1不同制曲阶段大曲样品磷酯脂肪酸组成及含量

g1000

-

J900-

媲800­

700­

600-

fngi^5-”G@/G-

PLFA►Fungi/Bacteria

时间/d

500

400

图2制曲过程中微生物群落结构的变化

2.2制曲过程微生物DGGE

信息分析

样品提取DNA分别以细菌引物（27f和1492r）

和真菌引物（NS3-GC和YM95r）扩增，结果如图3

进行第二轮PCR扩增，DGGE图谱如图4所示。

所示。扩增的产物以引物357F-GC/517r和NS1/FR1

2000bp

lOOObp

细菌16srDNA和真菌18srDNAPCR扩增产物电泳图谱

图3

在整个过程中，主要各样品间的细菌DGGE图

曲坯中总检出的20条，在其

过程中减后增培1天后从6

增至9，检出5，8和13，

3、谱带11和14的增加。相对第2天样品，

从培3天的样品中的增，谱带3、

39

第一期

2021

带4、谱带11和谱带14等4条谱带的强度减弱，而

谱带8和谱带9两条谱带的强度增强。培养7天样

品则是谱带3、

谱带4、谱带8、谱带10、谱带13和

谱带14等6条谱带的强度降低,仅有谱带9和谱带

11两条谱带的强度增强。培养9

天和10天样品的

DGGE图谱及代表性谱带的强度未观察到显著的区

别，但相对第7天的样品，可视化谱带数量显著增

多，部分谱带的强度变化较大(谱带4、谱带6、谱带

7、谱带15、谱带16、谱带18和20)。

切割代表性的

20条谱带测序后(表1),通过

Blast程序进行比对检索，相似性＞97%的细菌类含

有13个种，分别属于壁厚菌门(可如1屍463)的杆菌

(bacilli)纲和变形菌(Proteobacteria)门的y-变形菌

(C

-Proteobacteria)纲。壁厚菌门包括乳杆菌(Lac-

tobaciUIes)和芽胞杆菌(Bacillales)目，

其中Lacto-

baeillles则是由肠球菌科(Lecuconostocaceae)和乳酸

杆菌科(Lactobacillaceae)，前者是魏斯氏菌属(Weis-

lla)，后者则包括片球菌属(Pedioccus)和乳酸杆菌

属(Lactobacillus)，芽抱杆菌目则是杆菌属(Bacil­

lus)和葡萄球菌科(Staphyloccaceae)中的葡萄球菌

属。h-变形菌纲则是胞菌目(Pcudomon-

adales)的莫拉菌科(Moraxellaceae)中的不动杆菌属

(Acinetobact^)和肠杆菌目(Enterobacteriales)的肠杆

菌科(Enterobacteriaceae)中肠杆菌属(Enterobacter)

和沙雷氏菌属(Serratia)。这些种属的菌株中，除

和Serraiasp，

性。

Iday2day3d・y7day9dayIOday咽I十I

图4细菌16SrRNA的

PCR-DGGE图谱

曲坯的样品中的优势菌主要是Weislla和

Lactobacillus,均是乳酸的生产者。培养1天后，群落

结构稍有变化，Acinetobacter、StaphyIococcus和Pe-

等属，的多样性增加。培养

3天的样品，菌数目未增，的

40

Bacillus成为优势菌之一-o培养7天的样品中检出的

优势菌Bacillus中的主要是Blicheniformis，而第9天

和10天的样品则包括Blicheni

ormis和Bamyloli-

，样品中检eo

ae和Seaia是

菌，但样品中菌Pedioos则

°

图5真菌18SrRNA的DGGE-PCR图谱

表1细菌

DGGE条带序列分析结果

BandIdentification

Simiariy%

Aessi

1Weisllacibaria100KC110687.1

2Weieaca100HF562956.1

3

Unculturedbacterium1001232391

4Staphylococcussp.100114811

1

5eWeiea

97

A4217951

6,12BacilluslicheniBrmis

99

JX994184.1

7Sahyxy1000207401

8Pediococcuspentosaceus1001421511

9Aiebaebe

ii

99

86775461

10Lactobacillusplantarum100JN671595.1

11Lactobacillusfermentum

97

1458291

13Lacobaciscrsorm1002457071

14Lacobacisponis100

M2184201

15Bacispichino

yi100KC019189.1

16Bacissp100

E6105031

17Klebsiellasp.100

D9892152

18Bacillusamyloliquefaciens

99

A0552231

19

Baissbiis100JQ916087.1

20

Serraiamares100448402

1

对大过程中细菌分的，

对大中的菌进行DGG分，其

DGGE图谱如图5所示。

比较细菌的DGGE图谱，我

菌的DE图谱较，仅10条

带。，后(1d和2d)大曲条带中的

菌数量较多，可这，，养

，大部分，菌度

第一期

赵金松，等:PLFA法和DGGE法分析制曲过程微生物群落变化2021

速增加，这与王世宽等㈣通过传统分离培养方法的

研究结果一致。发酵第3&7内真菌条带数和丰度迅

速降低，由于此时大曲处于高温转化期，大多数微生

物不能生长,霉菌和酵母菌均大幅下降，

导致这一时

期的丰度值略微下降。在培养第9天达到高峰，其条

带数和亮度最高。发酵10d后，大曲进入贮存过程

中，曲房温度、湿度下降，微生物活降低，条

带数大的化，真菌的化其

丰度的化DGGE的条带量进行聚类分

析，从表1的结果我们发现，大曲曲过程中的真菌

化分3类，其中发酵期(1d和2d)、发酵

第9

天和第10天聚一类,发酵第7天单独聚一

类。在培养过程中，带在培养

的，度的带在后

期

3结论

3.1本章借助DGGE和PLFA技术对制曲过程中

不同发酵时间的细菌和真菌群落结构进行了分析。

结果发真菌类微生物生物量下降后

，发酵第7天微生物量达到值，后

下降的通过贮存期的不和化，

大曲过程中微生物结

3.2通过DGGE对大曲制曲过程的微生物群落结

构分析，细菌共检测到20条带，包括魏斯氏菌属、

菌、菌菌菌，

其中

菌最高，其菌在曲过程中

真菌带在培养，

度带在后期

3.3虽然两种方法显示的信息并不完全吻合，但也

此不方法的不的

用多方法研究大曲微生物化

必要的。

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