菌种鉴定

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文件名：分枝杆菌菌种鉴定

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分枝杆菌菌种鉴定

1检测范围

用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌

(Non-tuberculousMycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆

菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或

群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分

枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝

杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产

色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌情侣网名古风诗意 、苏尔加分

枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、回味近义词 蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。可用于结

核病和非结核分枝杆菌(Non-tuberculousMycobacteria,NTM)病的辅

助诊断,也可用于流行病学调查等领域。

2方法原理

基因芯片(genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈

列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表

面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂

交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。基因芯片对分枝

杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记

有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交

反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳

定的二级结构。根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应

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被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类

采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种

对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行

10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以

检测一份样品。

3检测样本

检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌

(Non-tuberculousMycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝

杆菌分离株。存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，

因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株

样本在-70℃储存不超过5年。

用于培养的样本为取自患者的痰、脓液或分泌物、肺泡灌洗液、

穿刺液（包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等）、尿液。

储存：待测分离株样本在2-8℃储存不超过2个月。

4仪器设备

PCR扩增仪、普通台式离心机、LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪、

微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微型高速离心机、涡旋振荡器、水

浴锅。

5试剂耗材

5.1试剂

5.1.1芯片洗涤液：

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芯片洗涤液Ⅰ：SSC终浓度为2，SDS终浓度为0.2%。依次将

20SSC、蒸馏水（或纯化水）、10%SDS按照10:88:2的比

例混合，即为芯片洗涤液Ⅰ。以配制总量600ml为例：量取60

ml的20SSC及528ml的蒸馏水（或纯化水）置于1L的烧杯

中，混匀。再加入12ml的10%SDS，混匀。

芯片洗涤液Ⅱ：SSC终浓度为0.2。将20SSC、蒸馏水（或纯

化水）按照1:99的比例混合，即为芯片洗涤液Ⅱ。以配制总量

600ml为例：量取6ml的20SSC及594ml的蒸馏水（或纯

化水）置于1L的烧杯中，混匀。

提示：若10%SDS产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀后配制芯片

洗涤液。若芯片洗涤液Ⅰ产生白色絮状沉淀，请于50℃融化混匀，然

后平衡至室温再使用。

5.1.2纯化水或者蒸馏水

5.1.3冰水混合物（取冰盒加水，冰冻2.5小时，因为扩增需要2.5

个小时，所以在扩增开始时准备冰盒）

5.1.4核酸提取液

5.1.5PCR扩增试剂

5.1.6杂交缓冲液

5.2耗材

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5.2.1HybSet基因微阵列芯片杂交盒

5.2.2微量移液器（规格：0.1-10l，2-20l，20-200l1958年今年多大 ）

5.2.3移液器吸头（要求洁净无菌，规格：0.1-10l，2-20l，

20-200l）

5.2.4离心管（要求洁净无菌，规格：200l，1.5ml）

5.2.5八连排管（可选，要求洁净无菌，规格：200l）

5.2.6各种规格的离心管架

6操作步骤

6.1核酸提取

6.1.1准备工作

取与标本数相同的1.5ml离心管，编号，取80L核酸提取液于

1.5ml离心管

6.1.2分离菌株样本的采集

从合适的固体培养基上用无菌的接种环挑取一个肉眼可见的菌落

（若菌生长布满整个培养基，则挑取相应大小的菌苔）于含核酸提取

液的核酸提取管中，即可进行后续的核酸提取。尽量避免挑取固体培

养基。液体培养基（先混匀）内样本直接吸取等于或大于1个麦氏浊

度的菌悬液10-20L。

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6.1.3核酸提取

加入上述采集的分离株样本后，使用Extractor36核酸快速提

取仪振荡5分钟，95℃水浴30分钟，12000rpm离心5分钟，此时得

到的上清液就是核酸提取液，

6.1.4取30L于0.5ml离心管，瞬间离心10秒，此步骤使核酸提取

液离到离心管底部，得到的核酸放置-20℃暂存（不超过2个月）。

6.2PCR扩增

6.2.1配制PCR反应体系

在PCR配液区内，根据被测样品数目准备200l八连排管，并

预先标记样品编号。从试剂盒中取出PCR扩增试剂使其充分融化

（自然解冻），轻摇混匀后瞬时离心（离心机瞬离5秒）至管底。

6.2.2根据样品数目，将PCR扩增试剂按18l/管分装于200

l八连排管中，盖好管盖，然后将其转移至PCR扩增区。

在PCR扩增区内加入2l模板DNA。模板DNA包括被测

样品DNA（核酸提取管中的上清液）、阳性对照品或者阴性

对照品。此时得到的每份PCR反应体系总体积为20l。

建议：每次扩增时均使用阳性对照品和阴性对照品，其中阳性对照品

可用于PCR扩增和杂交过程的质控。阴性对照品可用于监测环境及操

作过程中的污染情况

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6.2.3扩增

将离心管或八连排管置于PCR扩增仪中，按（扩增程序选择：TB

→MTB→DNA）加热循环程序进行PCR扩增反应。同时准备冰盒（见

4.1.3）

6.2.4芯片的准备：

在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200l蒸馏水（或纯化

水，见图1），将托架放入盒体内的两个定位柱之间，将芯片正面

向上，小心放在托架上，盖片四个凸台向下盖在芯片上（见图2）。

注意盖片的放置方向，其末端应与芯片末端的标签对齐。

图1：加200l水湿润底部图2：放置芯片及盖片

提示：1.操作应在较清洁的环境中进行，以避免灰尘落在芯片或盖片

上，干扰结果判读。

2.不要用任何记号笔在芯片上做标记，否则可能造成芯片背景

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变脏，影响结果判读。

6.2.5杂交反应混合物的配制、变性及冰浴：

1.根据样品数目准备200l八连排管并编号。

2.从试剂盒中取出杂交缓冲液，融化后充分混匀，在微量离心机

中瞬时离心，按9l/管分装。

扩增产物95℃加热变性5分钟（置于PCR仪中加热程序），

放冰盒冰浴三分钟后，每管加入6l相应的PCR扩增产物此时

杂交反应混合物为15l

6.2.6杂交反应：

将杂交反应混合物从冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混匀，

待白色絮状沉淀（如有）消失后，经盖片的加样孔加入13.5l

杂交反应混合物（见图4），迅速盖上杂交盒并密封（见图5）。

每个微阵列限加一份样品，记录芯片编号、微阵列位置及对应的

样品编号。立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴

锅中。待杂交盒全部放入后计时120分钟。

图3：加入杂交反映物图4：杂交盒密封

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提示：加样过程中应避免加入气泡。

从加样开始至干燥芯片之前的任何一个环节中，均应避免芯片

微阵列上的液体长时间直接暴露在空气中，以防干燥造成芯片背景高，

干扰结果的判读。

6.2.7芯片洗涤液的准备：根据芯片数量配制芯片洗涤液Ⅰ和芯片洗

涤液Ⅱ，体积以洗涤时能够完全浸没芯片为准。混合均匀并平衡

至室温（10-30℃）。洗涤一次的量为：（洗液一：528ml蒸馏水

+66ml20ssc+12SDS=600ml）(洗液二：990ml水+10ml20

ssc=1000ml)

6.2.8芯片的洗涤与干燥:杂交反应结束后，用洗涤机器进行洗涤后，

然后于离心机中800rpm离心5分钟，甩干后扫描

6.2.9芯片扫描和结果判读：

使用LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号的读

取及结果判读。操作简介如下（详见扫描仪及软件用户手册）：

①打开扫描仪和相应软件，点击“激光控制”按钮，预热10分钟。

②输入“样品编号”等样品相关信息。

③扫描仪预热完毕后，点击“出仓”按钮，将芯片平稳放置在托架

小片上，

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④水平轻缓地推入扫描仪仓口，点击“入仓”按钮。

⑤输入芯片编号，点击选择检测区域（即微阵列1-4），点击“选

择样品”为各微阵列选择相应样品。点击“开始检测”按钮进行

芯片扫描。结果将在屏幕上显示并自动保存。

⑥一张芯片扫描完毕后重复进行下一张芯片的扫描直至全部扫描

完。

⑦可通过“数据查询”页面进行数据查询及打印。

⑧宴请邀请函 完成全部操作后，关闭激光，退出软件，关闭扫描仪。

7参辅料采购 考值（参考范围）：

对于IC（分枝杆菌属）探针和结核分枝杆菌探针通过ROC方法确

定其参考值。对于其他16种非结核分枝杆菌检测探针均通过百分

位数法确定其参考值。当探针信号值大于或等于该探针的参考值，

则该探针判读为阳性，当探针信号值小于该探针的参考值，则该

探针判读为阴性。试剂盒中各探针的参考值已经整合到相应判读

软件中，由软件自动对样品检测结果进行判别。

8检验结果的解释：

8.1实验质量控制：本试剂盒阳性对照品的检测结果应为“结核

分枝杆菌复合群”；阴性对照品的检测结果应为“无分枝杆菌”。

如果其中任何一个对照品结果错误，则同一次实验全部样品结果

定为无效，需要进行复检。

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8.2结果判读方法说明：将探针信号值与参考值进行比较，如果

探针信号值大于或等于该探针的参考值，则判读为阳性，否则判

读为阴性。然后对所有检测探针按信号值大小进行排序，获取信

号值最大的探针

8.3异常结果处理：1）如果只有IC探针阳性，报告为“无法判

读”，则需对样品进行复检。2）如果复检仍为只有IC探针阳性，

报告为“无法判读”，则表示该样品不在本试剂盒检测范围内

9注意事项

9.1操作注意安全防护。操作致病菌DNA应在规定的实验场所进行，

穿戴防护衣物、一次性手套、口罩；所有直接接触过细菌的物品

应严格消毒后销毁或再次使用。

9.2本试剂盒对照品为质粒，可质控核酸扩增及杂交环节，不能质控

细菌样品制备环节，建议用户自行准备结核菌进行样品制备环节

的质控。

9.3有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有

关基因扩增检测实验室的管理规范执行。PCR扩增应严格按照国

家有关规定进行分区，以防止交叉污染。配制PCR反应混合物应

在PCR配液区内进行，PCR配防溺水安全 液区应为干净环境；DNA模板加样应

在模板加样区内进行。不同区域的移液器等物品不得混用。

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9.4操作人员必须经过培训，合格后方可上岗。

9.5使用前，液体试剂应混合均匀。尽量避免反复冻融。

9.6所使用的接触核酸提取试剂及PCR扩增试剂的材料均要求洁净

无菌。

9.7芯片及盖片为一次性使用，如果开封前发现铝箔袋包装破损，

请勿使用。

9.8开封后的芯片、PCR扩增试剂和杂交缓冲液一定要避光保存。

9.9不同批号试剂盒中各组份不可以互换使用。

9.10根据《中华人民共和国药典》2010年版三部，室温系指10-30℃。

9.11使用密封性能好的螺旋口菌种管或封口膜密封管口，防止水分

的蒸发。

10参考文献

10.1姜广路，刘宇红，王筵民，付育红，李云絮，赵立平，毕志强。

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序列分析方法鉴定第四次全国结核病流调的非结核分支杆菌。结

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10.5郭永，祝令香，程京，高华方，张琼，杨华卫，赵雁林，吴雪琼，

王国青，王璨，张俊仙。中国专利申请2.X。一种从

痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用。

10.6《分枝杆菌病实验诊断规范》（王金良主编，2006年上海科学技术

出版社）