防御素

基于人防御素5(HD5)高效抗菌肽的设计、筛选及构效关系研究

人体受辐照后免疫力低下,容易被外源病原菌感染。随着耐药现象日趋严重

[1],受照者被耐药细菌感染的风险正逐渐提升。

由于肠道对辐照非常敏感,且肠腔内定殖着大量细菌,辐照常诱发机体肠源

性感染[2]。肠道防御素是存在于哺乳动物体内的两亲性天然免疫蛋白,具有抗菌

作用强、不易被细菌耐受等特点[3,4]。

人防御素5(HD5,小鼠体内对应的是隐窝素4)由小肠隐窝Paneth细胞分泌

[5],可调节肠道菌群[6-8],保护机体免受病原菌侵袭[9,10],在放射性肠源性感

染防治方面具有很好的应用前景。我们前期围绕HD5开展了系列研究,探讨了放

射性飞蛾简笔画 肠源性感染时HD5的表达变化及生理意义[2,11],并通过基因重组表达技术

成功制备出高纯度HD5[12]。

然而,受盐离子和负电荷蛋白的屏蔽干扰,HD5在体内的抗菌作用受到限制

[13]。为此,本研究旨在从构效角度优化HD5的氨基酸序列,使其能够在复杂环境

中依然保持高效抗菌性,提高HD5的生物利用价值。

HD5由32个天然氨基酸组成(ATCYCRTGRCARESLSGVCEISG虾皮怎么吃补钙 RLYRLCCR);半胱氨

酸以Cys1-6/Cys2-4/Cys3-5方式配对形成三对二硫键,使HD5呈现?片层样结构

[14]。HD5具有多齿结合能力,可呈浓度依赖地形成多聚体[15],放大单体的抗菌

效应[16]。

新近研究发现,人?防御素1(HBD1)在肠道内可被硫氧化还原蛋白(Trx)催化

还原成线性多肽,且二硫键还原后HBD1的抗菌活性显著增强[17]。通过体内外分

子生物学实验,我们首先确定了线性HD5在肠腔中的存在,继而发现与HBD1不同,

二硫键还原减弱了HD5的抗菌活性。

HD5的C末端有一个由Arg25-Leu26-Tyr27-Arg28组成的抗菌活性区域:碱

性氨基酸(正电荷)Arg驱动多肽静电吸附细菌,疏水性氨基酸Leu和芳香族氨基

酸Tyr破坏细菌菌膜[16,18-20]。Glu21是人?防御素中除保守盐键Glu外唯一

的酸性氨基酸(负电荷),邻近HD5的活性区域[21]。

我们将游泳圈简笔画 Glu21白羊座图片 反电荷替换为Arg,发现E21R突变可增强HD5的抗菌性,但破

坏了多肽的聚合作用。在此基础上,我们将E21R-HD5的Thr7替换为Arg。

T7R突变不仅可以进一步强化E21R-HD5的抗菌活性,还能恢复单体肽的聚合

作用,致使T7E21R-HD5突变肽在高浓度盐溶液和血清中依然保持高效抗菌性。二

硫键的正确配对能够保护HD5免受胰蛋白酶降解,利于多肽在体内的稳定性[22]。

由于线性肽容易合成,且在局部组织,如角膜、皮肤、呼吸道等,胰蛋白酶含

量极低,应用线性抗菌肽治疗局部耐药细菌感染成为新近研究热点[23-25]。综合

氧化还原和arg突变对hd5抗菌性的影响,我们设计出仅含一对二硫键、具有高

效抗多重耐药鲍曼不动杆菌(nii)活性的突变肽。

除了抗菌肽的设计、筛选,本研究还采用一系列生物化学方法分析了多抗战歌曲 肽的

结构-效应关系,探讨了多肽的抗菌机制。所取得的主要研究结果与结论如下:1.

联合应用醋酸尿素-聚丙烯酰氨凝胶电泳(au-page)westernblot和基质辅助激

光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof)首次在人小肠液中检测到以氧化型和还原

型两种形式存在的hd5;体外实验证实,肠道硫氧化还原蛋白trx可催化还原氧化

型hd5。

2.氧化型hd5二硫键还原后抗菌活性减弱;细菌表面电位检测、生物膜干涉

(bli)、npn摄取、35内膜渗透及流式细胞检测等实验发现还原型hd5

静电吸附细菌、与细菌外膜脂质a相互作用、破坏细菌内外膜及诱导菌膜去极化

的能力均明显减弱,揭示了氧化型hd5还原后抗菌作用减弱的机制。3.氧化型hd5

二硫键还原后lps中和活性增强;圆二色谱(cd)、等温滴定量热(itc)、lbp阻断、

免疫荧光及荧光定量pcr等实验发现还原型hd5结构弹性增强,可调整构象结合

lps,阻断lps与下游lps结合蛋白(lbp)相互作用,抑制tlr4-nf-?b信号通路的

活化,减少炎症因子的释放。

4.虚拟克隆计数抗菌实验发现将glu21突变为arg(e21r)能够增强hd5的抗

菌作用;生物膜干涉(bli)、npn摄取及35内膜渗透实验检测到e21r-hd5

结合细菌外膜脂质a和脂磷壁酸(lta)及破坏细菌内外膜的能力均明显增强,阐

明了e21r突变增强hd5抗菌性的机制。观察到e21r突变后hd5的自缔合

能力减弱;利用x-射线单晶衍射,我们解析了e21r-hd5的晶体结构并将其提交至

蛋白数据库(pdb),编号为4rbx;e21r-hd5呈现为典型的单体肽。

自缔合能力减弱可致使防御素抗菌性下降;e21r突变虽然破坏hd5的自缔合,

却增强了多肽的抗菌作用,提示适宜的arg突变可补偿hd5因构象缺陷引起的功

能不足。6.晶体可视化分析发现glu21、thr7、r23及gly24残基均邻近hd5

的c末端抗菌活性区域;将这些位点分别突变为arg(e21r、t7r、s23r、g24r),

虚拟克隆计数抗菌实验结果显示各突变肽的活性强弱依次

是:e21r-hd5>t7r-hd5>s23r-hd5≈g24r-hd5。

7.虚拟克隆计数抗菌实验和itc发现t7r突变不仅可以增强e21r-hd5的抗

菌作用,还能提高单体肽的自缔合能力。利用X-射线单晶衍射,我们解析了

T7E21R-HD5的单晶结构并将其提交至PDB,编号为4RBX;T7E21R-HD5呈现为非典

型二聚体。

该结果思想品德评语 首次证实Arg突变可促进单体肽自缔合。、NPN摄取及

ML35内膜渗透实验发现T7E21R-HD5结合细菌外膜脂质A和LTA及破坏细菌内外

膜的能力均强于E21R-HD5,揭示了T7R突变增强E21R-HD5抗菌活性的机制。

9.T7E21R-HD5能够耐受盐离子的屏蔽干扰,五一劳动手抄报 在高浓度血清中依然保持高效

抗菌性。此外,该突变肽溶血性低、可耐受胰蛋白酶降解。

突变证实去除二硫键或仅保留一对二硫键均可减弱HD5的抗MDR

nii活性;其中,含Cys2-4二硫键的突变肽HM3抗菌作用相对较强。将

HM3的非碱性和非疏水性氨基酸突变为Arg后,突变肽HM八年级下册英语第一单元单词 5的抗菌性显著增强。

11.细菌涂布计数抗菌实验发现突变肽HM5呈浓度、时间依赖地杀伤MDR

nii,并在生理浓度盐溶液中依然保持高效抗菌性;BLI、NPN摄过年菜谱 取及细胞

流式检测到突变肽结合细菌外膜脂质A、破坏细菌外膜及诱导菌膜去极化的能力

均显著增强,阐明了HM5的抗菌机制。12.利用基因重组表达技术,我们制备了高

纯度的nii外膜蛋白A(OMPA)。

niiOMPA具有细胞毒性;突变肽HM5中和OMPA的活性强于HD5。BLI

检测到HM5与OMPA的相互作用强于HD5,提示结合能力增强与其OMPA中和相关。