邓雯雯

人参皂苷对波动性高糖所致内皮细胞损伤的作用及机制研究

陈颉;冯晓红;黄琦

【摘要】目的观察人参皂苷对波动性高糖所致内皮细胞损伤的保护作用并探讨其

作用机制.方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为对照组、波动性高糖模

型组及人参皂苷低中高浓度组(12.5g/mL、25g/mL、50g/mL).Westernblot

检测NF-E2相关因子2(Nrf2)的核转位及下游抗氧化蛋白血红素加氧酶-1(HO-1)、

-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)和醌氧化还原酶(NQO1)的表达;RT-PCR检测下

游抗氧化蛋白HO-1、-GCS和NQO1的mRNA表达;Westernblot检测瞬时转

染Nrf2siRNA质粒后Nrf2总蛋白和核蛋白及下游HO-1、-GCS和NQO1蛋

白的表达.结果人参皂苷治疗后,HUVECs中的Nrf2核蛋白及下游抗氧化蛋白HO-

1、-GCS和NQO1表达均明显增强(P＜0.05).瞬时转染Nrf2siRNA质粒后,人参

皂苷的治疗作用消失.结论人参皂苷通过促进Nrf2核转位,调控Nrf2/ARE信号通

路发挥其抗波动性高糖所致内皮细胞损伤的氧化应激损伤作用.

【期刊名称】《浙江中西医结合杂志》

【年(卷),期】2017(027)007

【总页数】6页(P550-553,后插1-后插2)

【关键词】波动性高糖;人脐静脉内皮细胞;Nrf2/ARE;氧化应激;人参皂苷

【作者】陈颉;冯晓红;黄琦

【作者单位】浙江省中医院内分泌科杭州310006;浙江省中医院内分泌科杭州

310006;浙江省中医院内分泌科杭州310006

【正文语种】中文

波动性高糖较易出现于糖尿病患者的病程中，其较持续性高糖对血管内皮功能的损

害可能更严重[1-3]。波动性高糖导致内皮细胞凋亡的机制尚未清楚阐明，其中氧

化应激被认为发挥了主要作用。Nrf2/ARE通路是主要的内源性抗氧化应激通路

[4]，通过启动转录因子，进而激活下游抗氧化蛋白而发挥抗氧化应激和细胞保护

作用[5]。最近研究[6-7]发现，在糖尿病的大血管及微血管并发症中，激活

Nrf2/ARE通路，可以发挥其抗氧化应激作用。我们认为Nrf2/ARE通路同样参与

了抗波动性高糖致内皮细胞凋亡的氧化应激过程。我们前期研究证实了人参皂苷对

波动性高糖所致的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用[8]。那么人参皂苷的这

种细胞保护作用是否与Nrf2/ARE通路有关？本实验拟通过人参皂苷干预体外培养

的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），观察NF-E2相关因子2（Nrf2）的核转位及

下游抗氧化蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）、-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-GCS）

和醌氧化还原酶（NQO1）的表达，探讨人参皂落款 苷对波动性高糖致内皮细胞损伤

的保护作用机制。

1.1药物与试剂人参皂苷由浙江省中医院提供（批号：20130819）；DMEM低糖、

高糖培养液、胎牛血清（Gibco公司）；HO-1、-GCS和NQO1引物（Takara

公司）；风筝的种类 兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗HO-1多克隆抗体、兔抗-GCS多克隆抗

体、兔抗NQO1多克隆抗体（CST公司）；胞浆胞核蛋白抽提试剂盒（碧云天公

司）。

1.2细胞培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购于上海生儿童寓言故事 科院细胞库。将细胞培养

液含10%胎牛血清，100/mL青霉素和100/mL链霉素液的DMEM培养基，

置于37℃、5%CO2孵箱中培养，至细胞铺满培养瓶底90%左右，用1mL含

EDTA的胰酶消化传代。

1.3实验分组及干预实验分为五组：对照组（恒定加入5.5mmol/L葡萄糖）、波

动性高糖组（每24h轮换25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、波动性高糖＋三

种不同浓度的人参皂苷（12.5g/mL，25g/mL，50g/mL）干预组。各组每

24h换液1次，共培养6天后终止培养。

1.4Westernblot检测Nrf2的核转位及HO-1、-GCS和NQO1的蛋白表达用

PBS轻轻漂洗培养瓶中细胞，然后加入RIPA裂解液，冰浴30min，4℃、12

000r、20min离心，取上清为细胞总蛋白；严格按照核蛋白提取试剂盒说明书提

取细胞核蛋白。Bradford法测定蛋白浓度，总蛋白上量样为100g，核蛋白上样

量60g，10%SDS-PAGE电泳转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗

（1:200）4℃孵育过夜，加入相应的二抗（1:1000），漂洗，加ECL试剂发光显

影。

1.5RT-PCR检测细蒙恬简介 胞内HO-1、-GCS和NQO1的mRNA表达用Trizol试剂

提取总RNA，按说明书操作。每份样品中取1gRNA进行反转录合成cDNA，

然后取1LcDNA进行PCR扩增。HO-1上游引物：

GGAACTTTCAGAAGGGCCAGGT，下游引物：

TGCAGCTCTTCTGGGAAGTAGACA，产物片段148bp；-GCS上游引物：

TGTAGTGCGAGGAAGAGGTATGA，下游引物：

GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG，产物片段162bp；NQO1上游引物：

AGGACCCTTCCGGAGTAAGAA，下游引物：GTCAGGGAGCCTGGAAAGA，

产物片段488bp。GAPDH上游引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物：

TGGTGAAGACGCCAGTGGA，产物片段138bp。反应在60L体系中进行。扩

增条件：37℃变性15min，85℃退火5s，4℃延伸10min。，进行40个循环的

扩增，于每个循环的延伸阶段收集荧光信号。扩增结束后进入分析界面，以

GAPDH作为内参照，根据每个样本扩增曲线的Ct值计算各目的基因表达水平的

相对定量值，对照组设置为1，最终结果计为与对照组进行比较后的相对定量值

RQ用于统计分析。

1.6瞬时转染pcDNA3.1-Nrf2质粒实验siRNA瞬时转染步骤按

Lipofectamine2000说明书进行，优化转染条件后，将细胞分成四组：模型

+siRNA对照组（转染ControlsiRNA+每24h轮换25mmol/L或5.5mmol/L葡

萄糖）、模型+siRNA+人参皂苷组（转染ControlsiRNA+人参皂苷25g/mL+

每24h轮换25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2siRNA组（转染

Nrf2siRNA+每24h轮换25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2

siRNA+人参皂苷组（转染Nrf2siRNA+人参皂苷25g/mL+每24h轮换

25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖），分别刺激48h，收取细胞。Westernblot

检测HO-1、-GCS和NQO1蛋白、Nrf2总蛋白和核蛋白表达。

1.7统计学方法应用SPSS19.0统计软件分析，所有数据以（）表示，组间比较采

用单因素方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。

2.1人参皂苷对Nrf2核转位及HO-1、-GCS和NQO1蛋白表达的影响

Westernblot结果显示，各组Nrf2总蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），

波动性高糖下Nrf2核蛋白表达明显增高，人参皂苷治疗后进一步增强了Nrf2的

核蛋白表达。模型组HO-1、-GCS和NQO1蛋白表达高于对照组，人参皂苷治

疗后其蛋白表达进一步增加（图1，插页）。

2.2人参皂苷对HO-1、-GCS和NQO1mRNA表达的影响RT-PCR结果显示，

模型组HO-1、-GCS和NQO1mRNA表达明显高于对照组（P＜0.05），人参

皂苷治疗后mRNA表达进一步增加，高浓度组明显优于模型组（P＜0.05）（图

2～3，插页）。

2.3人参皂苷及瞬时转染Nrf2siRNA对各蛋白表达的影响Westernblot结果显

示，在空siRNA组经过人参皂苷干预后Nrf2、HO-1、NQO1、-GCS的表达提

升，而在Nrf2siRNA组及经过人参皂苷干预组，Nrf2、HO-1、NQO1、-GCS

的表达均明显较前降低（见图4，插页）。

糖尿病患者由于自身调节机制的紊乱，易出现血糖的波动，研究也已证实波动性高

糖较持续性高糖对血管内皮功能的损害可能更严重[1-3]。波动性高糖导致内皮细

胞损伤的机制尚未清楚阐明，其中氧化应激被认为发挥了主要作用。我们前期研究

亦表明[8]，波动性高糖产生的氧化应激使得内皮细胞凋亡，人参皂苷通过增加细

胞超氧化物歧化酶（superoxidedismuta，SOD）活性，降低脂质过氧化产物

丙二醛（MDA）含量，明显抑制波动性高糖所致的人脐静脉内皮细胞凋亡，从而

对波动性高糖所致的内皮细胞损伤表现出一定的保护作用。

生理状态下，机体的氧化与抗氧化系统相互拮抗平衡。当机体受到有害刺激时，可

以通过多种途径介导活性氧（ROS）产生增加，使得抗氧化能力降低，氧化应激

损伤随之发生[9]。Nrf2/ARE通路是主要的内源性抗氧化应激通路[4]。在生理状

态下，Nrf2与伴侣分子Keap1（kelch-likeECH-associatedprotein1）在胞浆

中相互结合后，通过蛋白酶体泛素化途径降解使得其活性受到抑制；当受到来源于

ROS信号攻击后，Nrf2与Keap1解离并进入胞核，与其它bZIP蛋白结合成异二

聚体，转位进入细胞核内，结合抗氧化反应元件ARE，使ARE相关抗氧化酶如血

红素加氧酶-1（hemeoxygena-1，HO-1）、-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-

GCS）、和醌氧化还原酶（NQO1）表达增加[5]，进而发挥抗氧化应激和细胞保

护作用。最近在糖尿病的大血管及微血管并发症中的研究发现，激活Nrf2/ARE通

路，可以发挥其抗氧化应激作用[6-7]。

人参为五加科人参属植物，其作为补虚第一要药，治疗“消渴”早有记载。传统中

医认为，人参具有大补元气、生津止渴、扶正固本等功效，现代医学研究证实人参

皂苷在防治糖尿病及其并发症方面具有确切的临床疗效[10-13]，人参皂苷还具有

较强的抗氧化和自由基清除能力[14-15]。本实验进一步发现，给予人参皂苷干预

治疗后，促进了Nrf2的核转位，进而增加了HO-1、-GCS和NQO1表达，而

瞬时转染Nrf2siRNA后，人参皂苷的治疗作用消失，提示人参皂苷对波动性高糖

致内皮细胞损伤的抗氧化应激损伤与其促进Nrf2核转位有关。

综上，本研究结果表明，波动性高糖产生的氧化应激损伤使得内皮细胞损伤，人参

皂苷保护波动性高糖致内皮细胞损伤的机制可能是通过激活Nrf2/ARE信号通路，

促进Nrf2的核转位，启动下游抗氧化蛋白HO-1、-GCS和NQO1的表达。

【相关文献】

［1］RissoA，MercuriF，QuagliaroL，ittenthighglucoenhances

apoptosisinhumanumbilicalveinendothelialcellsinculture［J］.AmJPhysiol

EndocrinolMetab，2001，281（5）：924-930.

［2］AzunlaK，KawamoriR，ToyofukuY，tivefluctuationsinbloodgluco

enhancemonocyteadhesiontotheendotheliumofratthoracicaorta［J］.Arterioler

ThrombVaBiol，2006，26（10）：2275-2280.

［3］WatadaH，AzumaK，efluctuationontheprogressionof

diabeticmacroangiopathy-Newfindingsfrommonocyteadhesiontoendothelialcells

［J］.DiabetesResClinPract，2007，77（3）：58-61.

［4］YuX，2asatargetforcancerchemoprevention［J］.MutatRes，2005，

591（1-2）：93-102.

［5］KasparJW，NitureSK，2：INrf2（Keapl）signalinginoxidativestress

［J］.FreeRadicBiolMed，2009，47（9）：1304-1309.

［6］刘洪彬，于世勇.Nrf2活化下调AGEs诱导的内皮细胞活性氧水平［J］.重庆医学，2011，

40（33）：3329-3330.

［7］ZhengH，WhitmanSA，WuW，euticpotentialofNrf2activatorsin

streptozotocin-induceddiabeticnephropathy［J］.Diabetes，2011，60（11）：3055-3066.

［8］黄琦，邓雯雯，许家鸾，等.人参总皂苷对波动性高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

［J］.中药新药与临床药理，2012，23（5）：500-504.

［9］XuGW，YaoQH，WengQF，etalStudyofurinary8-hydroxydeoxyguanosineasa

biomarkerofoxidativeDNAdamageindiabeticnephropathypatients［J］.JPharm

BiomedAnal，2004，36（1）：101-104.

［10］王雨秾，孙佳犄，刘毓敏.人参皂苷对胰岛素抵抗大鼠模型中GLUT4和PI3K表达的影响

［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11（6）：234-237.

［11］李世辉，魏影飞.人参皂苷Rg1对2型糖尿病赞美秋天 患者细胞免疫功能的影响［J］.中华实用中西

医杂志，2004，4（17）：2321-23蹊跷是什么意思 22.

［12］罗贤令，彭辉灿，刘翀.人参皂苷Rg3对高糖下视网膜血管内皮细胞增殖父亲的英文单词 及ICAM-1表达

的影响［J］.国际眼科杂志，2009，9（10）：1865-1867.

［13］倪海祥，杨雪辉，朱峰，等.人参皂苷对糖尿病大鼠肾组织基质金属蛋白酶2表达的影响

［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10（3）：211-213.

［14］王红丽，吴铁，吴志华，等.人参皂苷抗皮肤衰老作用实验研究［J］.广东药学院学报，

2003，19（1）：25-27.

［15］张大雷，杨摇蓓，吴摇磊，等.人参皂苷保护小鼠精原细胞氧化损伤的研究［J］.中情死 国药理学

通报，2010，26（8）：1014-1016.