SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

氮蓝四唑法

一、原理

超氧化物歧化酶(superoxide dismuta，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超

氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：

＋

o

.-

H

2

+

HO

反应产物HO可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝

22

四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还

原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑

还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了

甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。

据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL、20μL、100μL)、移液管、精密电子天

平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照

度为4000Lux或Lx)

(三)试剂

(1) 0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定溶至100mL。

(3)750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定溶至100mL，避光

保存。

(4)100μmol/LEDTA-Na

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溶液：称取0.03721g EDTA-Na，用磷酸缓冲液定溶1000mL。

(5)20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定溶到1000mL，避光保存。

三、试验步骤

(一)酶液的提取

(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲

2

2

+

O

2

液使体积为5mL。取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

(二)显色反应

取5mL的试管(要求透明度好)若干，有对照、处理。按下表加样：

试剂(酶) 用量/mL 终浓度/比色时

0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5

130mmol/Lmet溶液 0.3 13mmol/L

750μmol/LNBT溶液 0.3 75μmol/L

100μmol/L EDTA-Na液 0.3 10μmol/L

2

20μmol/L核黄素 0.3 2.0μmol/L

酶液 0.05 对照液用缓冲液

蒸馏水 0.25

总体积 3.0

混合后将一支对照管置暗处，其他各管于4000Lx日光下反应20min。

(三)SOD活性测定与计算

至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他管的吸光度。

四、计算酶活力

已知SOD活力单位以抑制氮蓝四唑光还原的50%为一个酶活力单位表示，按下式计算

SOD活性。

SOD总活力=[(A-A)×V]/(0.5×A×W×V)

CKECKt

SOD比活力= SOD总活力/蛋白质含量

公式中：SOD总活力以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；

A为照光对照管的吸光值；A为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；V为测定时

CKEt

样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。