裂解液作用

1、核酸抽提道理之杨若古兰创作

简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步调.

裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则

是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它

杂质完好分离的过程.

经典的裂解液几乎都含有去污剂 （如 SDS、Triton X-1

00、NP-40、Tween 20 等） 和盐 （如 Tris、EDTA、NaCl

等）.盐的感化，除了提供一个合适的裂解环境 （如 Tri

s），还包含按捺样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的

破坏 （如 EDTA）、保持核酸结构的波动 （如 NaCl） 等.

去污剂则是通过使蛋白量变性，破坏膜结构及解开与核酸

相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中.裂解体

系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的

片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯

化操纵和获得更纯的核酸.也有直接使用高浓度的蛋白量变

性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 裂解的，该方法曾经成为了

RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流.

最经常使用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二

是介质纯化.第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽

提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核

酸沉淀上去，实现核酸与盐的分离.第二种方法则是利用某

些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，

而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分

离.高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省

略了 PC 操纵的麻烦.当然，也有不纯化的抽提方法，但是

用处多局限于简单的 PCR.其它杂质 – 如多糖、多酚等 -

的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过添加一

些特此外试剂，或者添加一些额外的步调来实现的.

2、了解你的实验样品

如果你研讨某个实验样品，而且要抽提它的核酸，以

下的信息必定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、

特殊杂质含量.如果你对样品的特点全无所闻，当样品稍微

有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到很多成绩.以血液

为例，如果你不晓得鸟的血液中有核细胞的含量是人血的

千倍摆布，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组

DNA，怎样可能成功？失败了又怎样晓得缘由所在？同

时，只要对实验样品有所了解，才干精确选择裂解方法.

绝大部分情况下，使用新颖样品可以获得最好的结果.

对一些杂质含量高的样品，如果使用新颖样品抽提基因组

DNA 是碰到杂质残留过大的成绩，可以试一下 -20C 保管

一天后再抽提的对策，可能会成心想不到的后果.样品如果

因为某些缘由必须先行保管，也要先简化一下样品：血液

最好只保管有核细胞；将样品分割后保管，防止反复冻融.

如果实验室不具备合适的保管条件，将样品先裂解后再保

管，是一个不错的选择.

3、裂解方法的评价

含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的

首选.裂解包含膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋

白质的游离.蛋白酶的感化是使蛋白量变小，故而对蛋白质

的游离有巨大的促进感化；同时，巨大的基因组 DNA 是

很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变

小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有益于蛋白质

在纯化操纵中的去除，使终极获得的基因组 DNA 的纯度

更高.另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”

在一路，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA

的特性占上风，则纯化时以 DNA 的方式被保存上去，导

致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占上风，则纯化时以

蛋白质的方式被去除，导致 DNA 的损失.有些样品，如肌

肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解

液 （或者在操纵中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质）

，缘由在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的.该

方法是获得最大得率和最高纯度的基础.

不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组

DNA 抽提方面有上风，特别是当得率和纯度请求不是最

高，而经济性及操纵简单很次要时.控制好裂解液/样品的

比例是该方法成功的关键.该方法结合高盐沉淀，可以实现

最简单的操纵，但纯度及得率的波动性可能会比用 PC 抽

提的差一些.

高浓度蛋白量变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 的裂解方

法，是抽提 RNA 的首选.总 RNA 的抽提，最次要的是快

速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂

解和基因组与蛋白质 “缠”住的成绩，因为都不会对当前

的纯化发生大的影响，可以不考虑.高浓度蛋白量变性剂能

快速破坏细胞膜，进而敏捷按捺住细胞内的 RNA 酶，从

而确保了 RNA 的完好性.除了极少量不适用该方法的样品

– 主如果植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可

以以高浓度的蛋白量变性剂为基础的.该方法也可用于基因

组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高.

含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细

菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法.该方法成功

与否与两个身分有关：一是 CTAB 的质量，二是洗濯的完

好程度.CTAB 的质量对裂解效力有很大的影响，而且，似

乎还说不清楚缘由，因为即使是同一公司生产的纯度一样

的 CTAB，批号分歧，后果就可能不同很大.洗濯去除 CTA

B 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对

酶活性有巨大影响，所以洗濯是否完好也是该方法成功与

否的关键.裂解时的温度，多使用 65C；但如果发现降解严

重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个绝对低温的

区域.

SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快

速、得率高、几乎无基因组 DNA 净化的特点.控制好裂解

液/菌体的比例和操纵的暖和是该方法成功的关键.蛋白质

的沉淀效力在 4℃会更好一些，所以，加入溶液 III 后在

4℃静置一段时间和采取 4C 离心去蛋白质，都可以提高质

量.该方法纷歧定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以

获得纯度很高的质粒.RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 R

Na A （100ug/ml） 或者在最初的溶解液中加入 RNa A

（25 ug/ml） 来实现.总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNa

A，RNA 的残留少一些.不过，经典沉淀几乎没有法子完好

去除 RNA 残留.另外，对大质粒 （50 kb 以上），该方法

可能会有成绩.

PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方

法.该方法的特点是不必纯化，样品被裂解后即可直接取裂

解液用于 PCR，非常快速.也正因为不纯化，所以，假阴性

（即没有扩增出来的阳性） 比例也比较高.该方法最简单

的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会按捺后续

的 PCR 反应，而且能提高裂解效力，甚至还可能部分清除

样品内按捺 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰

胺等.再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附

部分杂质的介质.操纵也非常简单，多使用温度的变更来实

现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次轮回等.该

方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用

于判断某一个样品是阳性还是阴性.降低样品使用量可以提

高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的按捺物

量的降低.

选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂

解液的比例.这个成绩非常次要，但却没有获得足够的看重.

严厉的参考材料，都应当会提供一个简单的比例，如 1ml

裂解液可以用于 T mg 组织或者 C 个细胞；我的建议是，

你的样品量绝对要小于材料所提供的.起始样品用多大，并

没有具体的说法.如果不是样品量无限，则以能抽提出满够

数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基

础，会比较合理的.不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样

品，就必定使用 100mg 样品.裂解液的用量，概况上与抽

提的结果 （纯度及得率） 没有关系，然而，在实际操纵

中，对结果是有比较大的影响的.裂解液的用量准绳是：确

保能完好裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中.浓

度过低，将导致沉淀效力低，影响得率；浓度过高，去除

杂质的过程复杂且不完好，导致纯度降低.另外，裂解液的

用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含

量为基准，这一点务必牢记.

4、纯化方法评价

PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法.波动、

可靠、经济、方便.PC 抽提可以完好去除蛋白质，醇沉淀

可以去除盐，对于普通的干净的样品 （杂质为蛋白质），

该方法完好可以获得高质量的核酸.虽然每次 PC 抽提都会

损失一部分核酸 （因为不成能将水相全部移取），和低浓

度核酸的醇沉淀效力低，但这些成绩都可以靠操纵的调整

而得以解决或者减少影响.该方法的最大的成绩是不适合大

规模抽提.

PC 抽提是去除蛋白质的一个非常无效的手段.苯酚能使

蛋白量变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚

中或者苯酚/水相之间.PC 抽提的关键是，一要混匀完好，

二要用量足够.完好混匀，才干确保苯酚与蛋白质的充分接

触，使蛋白质完好变性.很多人老是担心混匀的剧烈程度是

否会对核酸，特别是基因组 DNA 形成破坏，实际上大可

不必如此当心.剧烈的混匀操纵，是会部分打断大分子的基

因组 DNA，但该破坏感化不会强烈到 DNA 酿成 10kb 之

内的小片段.手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大

部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特此外请求外，对

PCR 和酶切，都是完好适用的.如果请求的片段非常大，

如构建文库用，则不克不及使用剧烈的混匀方法，而只能

来回暖和颠倒混匀 – 此时的关键是：裂解液的比例要足

够大，使体系不要太黏稠.用量要足够，是因为苯酚去除蛋

白质是有必定的饱和度的.超出了该饱和度，裂解体系中的

蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可完好去除.

另外，体系太黏稠的坏处是，蛋白质难以完好去除，和基

因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要留意裂解液与样品的

比例.4C 离心操纵有益于更完好去除蛋白质.PC 抽提的另外

一个用处是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在

RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA.不过有一点要提

醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不克不

及使用 PC 抽提的，否则核酸肯定降解.

高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错

的方法.与 PC 抽提方法比拟，除了纯度的波动性可能要低

一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所出缺点.更快、更

轻松去除蛋白质所陪伴的好处是，可以用于大规模抽提，

缺乏是纯度 （蛋白质残留） 不敷波动.蛋白质的沉淀效力

在 4C 会更好一些.

介质纯化方法，是一个愈来愈受到看重的方法.其最大

特点是非常适合大规模核酸抽提，而且因为受人为操纵身

分影响小，纯度的波动性很高 （虽然纯度纷歧定比PC 纯

化方法更高）.其致命弱点是样品过量.介质可以分为两大

类，一类是柱式的，即介质被事后装填在上面是通的柱子

里；另外一类则是颗粒状 （如Glassmilk、磁性小珠等）.

颗粒状的介质的纯化操纵与经典的醇沉淀不同不大，都是

通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好

的核酸.柱式纯化的操纵虽然也是有加液-倒液过程，但因

为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含

有核酸的柱子完好是分开的，所以洗濯更完好，操纵更省

力 （不必费心将核酸倒掉了，或者液体的残留）.不过，

介质纯化方法的成本是最高的.

5、醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀上去，从

而实现核酸与其它杂质 – 主如果盐 – 的分离.实际操纵

中，很多杂质也会与核酸一路被醇沉淀上去，特别是当其

它杂质的浓度也比较高的时候.醇的沉淀其实不是非常特异

性的，任何无机大分子及一些盐，当浓度达到必定水平

后，都可能同步被沉淀上去.

就核酸而言，尺度的醇沉淀请求有必定的盐及某一比

例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不成少的或者醇的

比例是不成更改的.实际操纵中不难发现，当裂解体系中核

酸的浓度达到必定水平后，即使体系中不含教科书中建议

的盐，单独使用醇也能够使核酸沉淀上去；或者含有盐，

使用低比例的醇也能够使核酸沉淀上去 （当然，得率可能

会降低）.晓得这一点的意义在于：不要迷信尺度方法的独

一性；相反，当使用尺度方法碰到成绩 – 主如果纯度成

绩 – 时，完好可以通过调整沉淀条件来改善.最有参考价

值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高

盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留.另外一

个成绩就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质

的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得

率，但因为可以大大提高纯度.

如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，准绳上不

要使用低温沉淀.低温沉淀能提高沉淀效力：当核酸浓度很

低时，后果明显；当核酸浓度比较高时，后果不明显，但

却会导致杂质的大大添加.

醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质

量有大的影响，虽然很多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度

更高.异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，色彩不是很

白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上挪动，色彩比

较白.这是景象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢

掉，但比较难洗濯.结合丢失和洗濯两个方面综合考虑，则

建议：少量核酸用异丙醇沉淀 （量少，洗濯不是成绩，不

丢失为先），大量核酸用乙醇沉淀 （量大，丢失不是成

绩，洗濯方便为先）.至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说

法，我没有碰到过 （我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉

淀比较容易出现盐沉淀？）；我更觉得出现该景象的缘由

就在洗濯的不完好.

当然，也不要健忘异丙醇沉淀的最大长处是体积小，

可以使绝大部分的小量抽提操纵在 1.5ml 离心管内完成.但

因为其沉淀物很紧凑，洗濯时其中间部分不容易被洗濯

到，所以，洗濯异丙醇沉淀的核酸的关键是：必定要使沉

淀悬浮起来，必定要放置一段时间使沉淀终极酿成蓬松的

白色.如果再洗濯一次，质量决不会有成绩的.

PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀.虽然它们远没

有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点.LiCl 可以沉淀 RN

A 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸

沉淀上去.PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段.

6、洗濯

洗濯首先必定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有必定

的时间，特别是当核酸沉淀比较大时 （使核酸沉淀终极蓬

松）；第三是少量多次；第四则是去上清要完好.教科书中

的操纵基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，

这一描述本人没有成绩，且十分方便，但因为他来自国

外，天然就有了“水土不服”的成绩.如果离心管是经过硅

化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常完

好；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也

没有什么成绩；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留

量多到会影响后续的实验.独一不受管子质量影响的操纵，

就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出.必定要

牢记的是，残液中都含有上一步操纵中的杂质，其残留量

与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关.挥发时去掉的是乙

醇，杂质是不会被挥发去除的.

另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了

洗濯的强度.沉淀越大，裂解液的裂解能力越强，洗濯越要

完好：放置时间绝对要长一点，洗濯次数也要考虑添加.最

关键的，洗濯必定要用室温的 75% 乙醇.

7、核酸的溶解和保管

纯化后的核酸，最初多使用水或者低浓度缓冲液溶

解；其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者

TE 溶解.经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认

为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留上去的 DNa 降解的

风险；如果操纵过程控制得当，DNa 的残留几乎是可以

忽略的，完好可以直接使用 Tris 或者水 （pH 接近 7） 溶

解 DNA.

基本上，核酸在保管中的波动性，与温度成反比，与

浓度成反比.虽然也有部分实验人员发现，-20C 保管的 DN

A 比 -70C 保管的波动，我却宁可认为这是个例.

如果温度合适，保管中核酸发生降解或者消逝，首要

缘由是酶残留导致的酶解，第二个缘由则是保管核酸溶液

的 pH 值分歧适导致的水解 （RNA 在弱酸性更波动，而

DNA 在弱碱性更合适）.还有一个不为人看重的，就是 EP

管对核酸的影响.首先必定要坚信一点，那就是核酸必定

会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡.EP 管

的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以核酸的结构

发生某些变更，如变性.在核酸的浓度比较高时，这个景象

可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了.在低浓

度的核酸中加入 Geletin，Glycogen，BSA 可以波动核酸，

虽然曾经为实验所证明，但很多实验人员并没有将该建议

当回事.

此刻制作 EP 管的材料远多于过去.这些新出现的材

料，在强度、透明度等物理特征方面可能比本来的纯 PP

材质要好很多，但其化学特征，特别是对核酸波动性的可

能影响，远没有研讨透彻.正如此刻的质粒可以改造得愈来

愈适用某些请求一样，其负面产品可能是，抽提的质粒电

泳的构型愈来愈多：除了本来的三种带型外，还可能出现

denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型.

8、核酸质量的检测成绩

将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是独一可靠的

检测方法；除此以外的检测方法，都是绝对的，而且其实

不十分可信.目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一

是电泳，二是紫外分光光度仪.电泳检测的主如果核酸的完

好性和大小，只需核酸不是太小或者太大 （超出电泳分离

范围），该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核

酸的浓度，但其精确度与经验有关；另外，电泳也可能提

供某些杂质净化的信息，但是同样与经验有关.紫外分光光

度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，因为紫外分光光度

仪不克不及确保非常精确，而该仪器的灵敏度又非常高，

所以，提供的结果其实不十分可信.普通讲，同时进行紫外

和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判

断.但因为这两个方法都出缺陷，所以，即使出现坏的结果

能用于后续实验而好的结果却不克不及用于后续实验，也

不必大惊小怪.

关于紫外分光光度仪的检测.首先，不要使用不克不及

选择波长的仪器；使用那些曾经固定了波长的仪器，大概

可以算是你梦魇的开始.（没有信息是可怕的，更可怕的是

将错误的信息当真.） 其次，必定要经常调较仪器；调较

可以使用非常纯的自备核酸，也能够使用苯酚 （后者是我

目前每次都使用的方法，非常简单；具体道理可以见我之

前的帖.） 最初，要记住读数 A230 ： A260 ： A280 = 1 ：

2 （DNA 为 1.8） ： 1 为理论上的数据，实际测定时会有

一些不同；但如果不同太大，就有成绩了.有两个值得商榷

的观点：如果 A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280

> 2.3 就是核酸降解.A260/A230 如果比 2.0 大很多，必定

是有杂质残留的 （具体是什么杂质我不晓得）.如果核酸

抽提好后立即就测定，A260/A280 > 2.3 决不提示核酸降

解，缘由是：那些能导致 A260/A280 > 2.3 的核酸片段非

常小，惯例的沉淀是不成能将它们沉淀上去的；更可能的

缘由是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚

至 A264/A284 的值.纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，

在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡.根据曲线在底

和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特点，不难得出

如下结论：A230 和 A260 的读数受仪器精确性的影响比较

小，而 A280 受仪器精确性的影响比较大.

建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测.电泳后，

可以看到哪些样品根本就不克不及用 （如降解太厉害），

和核酸的大致浓度，如许就为紫外分光光度仪的检测提供

了一个参考 （降解的不须要测了，要测的该取多少量等）.

9、成绩解答

非常基础的成绩就不再罗嗦，目的是想对一些选项浩

繁的成绩解答进行简化：如果某一身分占了 70% 以上的可

能性，我就只提该身分了.还有一些解答与部分人的常识可

能相冲突，也请不要放在心上，因为它们也与我当年从书

本上进修的常识相冲突.我记性差，什么都是看完就忘；但

这也有好处，做实验从来没有框框.看一看，想想，做一做

– 管用就好.

A 抽提过程中的景象及可能的缘由

I：核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 （虽然目前

更多的材料强调的是过分干燥所致.）.75% 乙醇洗濯后，

如果是空气干燥，几乎不成能过分干燥的，特别是在南方

湿润的地方.左证明验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA

到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后完好去除乙

醇；待乙醇完好挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常

均匀而黏稠了.

II：使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 – 多糖残留.

III：核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留.

IV：75% 乙醇洗濯异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了

– 见 10-III.

B 紫外检测

I：A260/A280 比值低 – 蛋白质残留.但如果操纵过程

中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留.

II：A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可

见的误差 – 苯酚残留.

C 电泳中的景象及可能的缘由

I：加样孔有荧光 – 首先必定有 DNA 的滞留；其次多

含蛋白质残留；如果是比较特殊的样品，其杂质也可能导

致荧光.蛋白质几乎不会被 EB 染色，能出现荧光，则必定

含有核酸.非常巨大的基因组DNA （> 50kb），如果使用

普通的琼脂糖电泳，常常不克不及电泳出孔，单独就可能

滞留在加样孔中发生荧光.更多的时候，是比较大的 DNA

与残留的蛋白质结合后，电泳不克不及出孔而在孔中发生

荧光.酶反应产品，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易

在孔中出现荧光，其缘由是酶与核酸几乎都有比较强的结

合能力 （基因组 DNA 的PCR 产品电泳常常在孔中都有荧

光，而且荧光强度与体系的特异性成反比.）.如果是植物

样品，还可能由其它杂质残留惹起.我的经验是：蛋白残留

的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺眼，且薄得锐利.

II：总 RNA 非变性电泳显示过多的条带 – 根本就不是

成绩.

III：总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮，但条带

清晰无弥散 – 多提示 28S 没有被 EB 饱和.RNA 残留多

时，基因组 DNA 的电泳也会有类似景象.简单的补染可以

解决此成绩.再次电泳时，或者降低上样量，或者添加胶中

EB 的量.

D 降解的景象、缘由及对策

降解的景象，如果抛开成绩电泳所致，可以简单总结

如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较

均衡地衰减.如果同时还陪伴以下的一个或者多个景象，则

须要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条

带地位的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散.

以此刻的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主如果

在完好匀浆之前，只要极少量由不干净的溶解液导致.以总

RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总 RNA 的质量由高

到低顺次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 （此处的质量不但

指纯度，也指完好性才对）.完好裂解悬浮细胞的时间最

短，完好裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在完好

匀浆之前的一个左证.再看一看新颖样品和冷冻保管样品，

非常严酷的冷冻保管和匀浆操纵的确可以确保冷冻样品的

核酸的质量；但是，有很多实验室其实不具备严酷的保管

手段，实验人员的操纵也并不是完满，其结果就是核酸的

降解.RNA 抽提受的影响身分太多，就以基因组 DNA 的抽

提为例看一看吧.假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，

不管你使用的是新颖样品还是冷冻保管样品，如果混匀完

好，可以预期的降解为：细胞 – 不该该降解，碾碎的组

织 – 不该该降解，大块组织 （包含鼠尾） – 部分降解.

如果电泳发现新颖的细胞和碾碎的新颖组织发生了降解景

象，该景象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷

冻组织发生了降解景象，该景象不是假象，就是样品在保

管中曾经降解了.说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活

了，消化试剂的裂解能力也足以包管细胞的基因组 DNA

在抽提过程两头不被降解.

减少或者杜绝核酸降解，必定要将重点放在样品被完

好匀浆之前.样品的保管在前面曾经说过了，不反复.其次

就是要缩短样品从离开本来的生存环境或者低温到被完好

匀浆之间的时间.