热休克蛋白70

本科生毕业论文（设计）册

学 院 生命科学院

专 业 生物科学

班 级（届） 2015届

学 生 张 川

指导教师 李东明

任务书编号 2015届103

河北师范大学本科毕业论文（设计）任务书

编 号： 2015届103

论文（设计）题目： 急性低氧刺激下树麻雀HSP70基因的适应性变化

学 院： 生命科学院 专业： 生物科学 班级（届）： 2015届

学生姓名： 张川 学号： 2011012028 指导教师： 李东明 职称： 副教授

1、论文（设计）研究目标及主要任务

研究目标：在急性低氧刺激下，树麻雀肝脏组织中HSP70基因水平的变化。

主要任务：分析低氧刺激对树麻雀HSP70基因水平的影响。

2、论文（设计）的主要内容

热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白，在受到外界刺激时，机体的HSP70会有一定变化，

以保护组织器官等。本研究以树麻雀为研究对象，研究其在低氧刺激下肝脏组织中HSP70

基因的变化。

3、论文（设计）的基础条件及研究路线

基础条件：本实验室主要研究动物对环境的适应性，具备研究树麻雀HSP70的基础条件，

实验室仪器设备齐全，并具有野外取材的条件和能力。

研究路线：将树麻雀放入模拟各种海拔高度低氧的环境生活一定时间，然后提取其肝脏组

织，对肝脏组织中HSP70基因的mRNA表达量进行分析对比。

4、主要参考文献

[ 1 ] Welch WJ. Mammalian stress respon: cell physiology, struc2 ture / function of

stress p roteins, and imp lications for medicine and dia[ J ]. Physiol Rev, 1992, 72 (4) : 1063

- 1081.

[ 2 ] Suzuki k, Sawa Y, Kagisaki k, et a l. Reduction in myocardial apop tosis associated

with overexp ression of heat shock p rotein 70 [ J ]. Basic Res Cardiol, 2000, 95 (5) : 397 - 403.

[ 3 ] 任宝波,王玉艳,王纯净,等. HSP70 家族的分类及基因结构与功能[J ]. 动物医学进

展,2005 , (26) :98 - 101.

[ 4 ] Ishii T ,VdonoH ,Yamano T ,et al. Isolation of MHC class I - restricted tumor antien

peptide and its precursors asso2 ciated with heat shock proteins HSP70 , HSP90 and gp96 [J ].

Immunol ,1999 ,162 :1303 - 1309.

[ 5 ] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24

(3) 128 - 132.

5、计划进度

阶段 起止日期

1 捕捉树麻雀 3.12-3.15

2 低氧处理树麻雀 3.16-3.17

3 HSP70基因的克隆及分析 3.19-3.21

4 RNA提取及反转录成cDNA 3.27-3.31

5 数据的分析和处理 4.1-4.3

指 导 教师： 年 月 日

教研室主任： 年 月 日

河北师范大学本科生毕业论文（设计）开题报告书

生命科学学院 生物科学 专业 2015 届

学生 论文

张川 急性低氧刺激下树麻雀HSP70等基因的适应性变化

姓名 题目

指导 专业所属 研究

李东明 副教授 动物生态学 资源与功能学

教师 职称 教研室 方向

课题论证：目前对HSP70的研究主要集中于哺乳动物，我们所采取的实验材料是树麻雀，

以增强对HSP70的了解。本实验是将野外捕捉的树麻雀通过不同程度的急性低氧刺激后，

提取其肝脏组织中的HSP70 mRNA来进行定量分析。本实验室仪器设备齐全，具备完成实

验的条件。通过实验，我们将对HSP70在鸟类中的表达有更深的认识。

方案设计：对越冬晚期的树麻雀分组进行低氧处理（对照组、3000米8小时、3000米24

小时、6000米8小时、6000米24小时），然后对树麻雀肝脏组织进行取材，克隆HSP70

基因并进行分析。提取肝脏组织RNA并反转录成cDNA。对其数据进行分析。

进度计划：1、3月中旬捕捉越冬晚期的树麻雀

2、3月16日-3月17日，低氧处理树麻雀

3、3月19日-3月21日，对树麻雀HSP70基因进行克隆和分析

4、3月底，提取肝脏组织RNA并反转录成cDNA。

5、4月1日-4月3日，分析处理数据。

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

教研室意见：

教研室主任签名： 年 月 日

河北师范大学本科生毕业论文（设计）文献综述

1962年，Ritossa在果蝇唾液腺中意外的发现了热休克蛋白（HSPs）。它具有分子伴侣

功能，并不参与细胞中蛋白质的折叠合成，而是减小蛋白质折叠过程中出现的错误，维持

蛋白质的稳定性。热休克蛋白几乎存在于所有生物体内的各种细胞中。在正常情况下，热

休克蛋白表达的并不多。而当细胞受到刺激或损坏时，热休克蛋白会迅速的大量表达，以

保证细胞内蛋白质的稳定性，维持机体的正常生理功能（Wei J . Gong等，2005)。在外

界刺激下，热休克蛋白协助细胞内的蛋白质正确的折叠，保持其稳定性，以防止细胞内蛋

白质损坏。研究发现，在对动物的多种刺激（如：高温、缺氧、炎症、感染、紧张等）下，

这种新发现的蛋白，都能对细胞内的蛋白质有一定的保护作用。在热休克蛋白家族中，热

休克蛋白70（HSP70）是诱导产生最多的一种应激蛋白。HSP70 家族基因结构高度保守，

大鼠与人的HSP70 氨基酸序列同源性为95% ,与小鼠的同源性为98 %。

氧在动物的生命活动中具有至关重要的作用。在低氧或无氧环境下，绝大多数动物的

新陈代谢受到抑制、细胞出现损伤，出现程序性死亡（曾涛等，2012）。

急性低氧刺激下，有机体细胞的生理机能会受到损害。为了减小损伤，动物会依靠自

身生理与代谢的调节，如增强心脏泵血、增加肺通气、增多血细胞、减小红细胞体积并增

加数量、升高血红蛋白的浓度等(Marcus et al., 2009)。研究发现，在缺氧时，热休克

蛋白对动物心肌具有一定的保护作用。HSP70可以保护心肌收缩，减少心肌缺血坏死范围，

抗心律失常等作用（何巍等，2007）。对细胞的程序性死亡有一定的抵抗作用，同时还具

有协同免疫作用（李逢昌等，2007）。以减少低氧刺激下，有机体的损伤。

对在低氧条件下动物的适应性变化的研究中，已经发现HIF-1、促红细胞生成素

（ErythroPoietin，EPO）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，

VEGF） 、血红蛋白(Hemoglobin，Hb) 等低氧相关基因及能量代谢过程中的限速酶，如琥

珀酸脱氢酶（Succino Dehydrogena，SDH）、乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogena，LDH）

等(Ramirez et al., 1999)。HSP70对肿瘤细胞的作用很复杂，它可以通过增强机体的免

疫作用使肿瘤细胞产生细胞凋亡，同时又能像保护其他细胞一样，增强肿瘤细胞的免疫性

（李建斌等，2008）。由此，可以看出，HSP70对动物正常或非正常的细胞的作用是非常复

杂的。

树麻雀()隶属于雀形目、文鸟科，典型的伴人物种，广泛分布于不

Pasr montanus

同环境。树麻雀同哺乳动物一样，作为一种高等动物，它对各种环境都具有一定的适应性。

在对树麻雀进行不同程度和不同时间的低氧处理后（对照组、3000m-4h、3000m-8h、

3000m-24h、6000m-4h、6000m-8h、6000m-24h），研究发现，树麻雀肝脏中的HIF-1α和

VEGF mRNA表达量随低氧程度加剧与时间延长而显著升高（姚瑶等，2012）。

河北师范大学本科生毕业论文（设计）翻译文章

在低氧条件下关节处软骨细胞HIF-1ɑ诱导HSP70合成代谢反应

摘要：我们评估在缺氧条件下关节处软骨细胞的合成代谢途径中，热休克蛋白70（HSP70）

的参与是否依赖于缺氧诱导因子1ɑ（HIF-1ɑ）。主要是把家兔软骨细胞分别在常氧（20%

氧气条件）和低氧（1%氧气）条件下培养。或者，家兔软骨细胞在常氧下培养时，用CoCl

2进行处理诱导HIF-1ɑ的生成，以模拟缺氧条件。或者在缺氧条件下通过转染siRNAs诱

导HIF-1ɑ(si-HIF-1ɑ)和HSP70（si-HSP70）。在缺氧或模拟缺氧条件下，HIF-1ɑ的表达增

强使HSP70表达也增强了，但并没有si-HIF-1ɑ的存在。低氧诱导ECM基因的超表达显著

抑制si-HIF-1ɑ和si-HSP70的表达。细胞活力与缺氧直接相关，但转染si-HIF-1α或

si-HSP70废除了缺氧的软骨保护作用。在缺氧条件下，虽然用硝普钠处理的细胞和TUNEL

阳性细胞LDE的释放均降低，但转染si-HIF-1a或si-HSP70几乎完全阻断了这些效果。

这些发现表明HIF-1α诱导HSP70表达，增加了ECM基因的表达水平和细胞生存能力，并

防止软骨细胞凋亡。在缺氧条件下，HIF-1α可通过诱导HSP70的的表达进而影响软骨细

胞的合成代谢。

关键词：缺氧诱导因子；热休克蛋白70；低氧：细胞外基质；细胞凋亡。

讨论：

氧传感器之间存在一个监管环节与热休克通路。该环节涉及上调热休克因子（HSF）

的缺氧依赖性。缺氧时HIF-1α引起HSF转录增加，以增加HSF的细胞丰度和增加的热休

克途径的灵敏度的一种方法。缺氧条件下，比起在果蝇KC167细胞或胫骨软骨发育不良的

生长板上的热休克蛋白，用一个HSF的HIF-1α依赖性的方法，可让HSP70 转录水平增加

更多。然而，在缺氧条件下仍不清楚关节处软骨细胞HSP70是否是由HIF-1α调节。要确

定HIF-1α是否影响HSP70的表达，我们对家兔关节软骨细胞在常氧，缺氧或低氧刺激下

培养后HIF-1α、HSP70 mRNA和蛋白水平的情况进行了分析。我们观察到，在缺氧或模拟

低氧条件下HSP70 mRNA和蛋白质的水平比在常氧中更高，但是这都是由于HIF-1α灭活才

产生的。这些发现表明，软骨细胞缺氧时产生HIF-1α以调控HSP70的表达。以前的研究

已表明，在低氧诱导的靶基因缺氧反应元件处，HIF-1α与其结合位点结合，并与该处的

HSP70启动子结合，以激活HSP70的转录表达。软骨细胞在缺氧条件下，可能通过这种途

径使HIF-1α诱导HSP70的表达。HSP90对HIF-1α有稳定性的作用，并介导氧气独立泛素

化和蛋白酶体降解。缺氧导致HIF-1α转录因子增加，从而使HSP70和HSP90的表达水平

增加。进一步的研究需要弄清楚HSP的高表达是在软骨细胞死亡之前还是死亡之后。

在软骨细胞中HIF-1α对ECM代谢的影响的研究表明，在人体关节软骨细胞处，HIF-1

α参与了诱导主要的ECM基因PG和Col II。但是，这些ECM基因不是HIF-1α的直接目

标，这表明，缺氧诱导产生的HIF-1α可间接增加软骨细胞ECM的合成。虽然我们以前报

道，HSP70参与PG的热诱导表达，低氧条件下HSP70对ECM表达的作用却仍不清楚。为了

确定在低氧条件下的软骨细胞HSP70表达是否影响细胞外基质代谢，我们还分析ECM基因，

例如PG和Col II的mRNA水平。我们发现PG和Col II mRNA的水平在缺氧条件下被显著

增加，但不是通过si-HIF-1a或si-HSP70在细胞中转染的。常氧条件下，这些基因也可

被CoCl2刺激使表达增加。这些结果表明，软骨细胞的细胞外基质代谢可通过HIF-1α诱

导的HSP70来调节。

另一方面，在低氧条件下HIF-1a的调节对软骨具有保护作用。我们已经报道了HSP70

的表达，增强了软骨细胞的代谢活性，并对它们有热应激的保护作用。我们观察到，

si-HIF-1α或si-HSP70几乎完全取消了缺氧诱导的软骨保护作用，意味着HIF-1α诱导

HSP70可能增加缺氧条件下软骨细胞的生存能力。我们还报告说，软骨细胞中的HSP70过

度表达抑制了NO导致的细胞凋亡。在这项研究中，我们发现，缺氧条件下培养的软骨细

胞可防止NO诱导的细胞凋亡，但转染si-HIF-1α或si-HSP70的这些细胞加速了NO诱导

的细胞凋亡。这些发现表明，在低氧条件下，HIF-1a和HSP70涉及的途径，可能参与应激

诱导的细胞毒性的抑制。

主控调节基因SOX9也对软骨细胞的生存至关重要，直接调节主要软骨基质基因如Col

II和聚集蛋白聚糖。软骨细胞在缺氧条件下HIF-1α对SOX9的调节起着重要作用。在软

骨细胞中SOX9也与HSP70相互作用。在这里，我们发现，HIF-1α诱导HSP70的表达增强

了ECMmRNA和软骨细胞活力，并抑制了NO诱导的细胞凋亡。这些发现表明，HIF-1α可调

节HSP70和SOX9的相互作用。

患有关节炎的关节滑液（OA）比健康关节处的关节滑液氧含量要低。软骨细胞中HIF-1a

的含量升高与OA患者的关节慢性缺氧有关。此外，软骨细胞中HSP70的表达水平也可能

与OA的组织学严重程度相关。然而,在OA患者软骨细胞处HIF-1a和HSP70的表达水平可

能不够高,致使应激损伤软骨消除,导致这种疾病恶化。控制HIF-1α诱导的HSP70表达可

为OA患者提供一种新的治疗策略，但这个想法需要进一步检验。

总之，这项研究显示，HIF-1α肯定诱导了HSP70表达，至少部分地表明与HIF-1α依

赖性合成代谢途径相关。

HIF-1a-Induced HSP70 Regulates Anabolic Respons in

Articular Chondrocytes under Hypoxic Conditions

ABSTRACT:

We assd whether heat shock protein 70 (HSP70) is involved in hypoxia

inducible factor 1 alpha (HIF-1a)-dependent anabolic pathways in articular chondrocytes under

hypoxic conditions. Primary rabbit chondrocytes were cultured under normoxia (20% oxygen

condition) or hypoxia (1% oxygen condition). Alternatively, cells cultured under normoxia were

treated with CoCl2, which induces HIF-1a, to simulate hypoxia, or transfected with siRNAs

targeting HIF-1a (si-HIF-1a) and HSP70 (si-HSP70) under hypoxia. HSP70 expression was

enhanced by the incread expression of HIF-1a under hypoxia or simulated hypoxia, but not in

the prence of si-HIF-1a. Hypoxia-induced overexpression of ECM genes was significantly

suppresd by si-HIF-1a or si-HSP70. Cell viability positively correlated with hypoxia, but

transfection with si-HIF-1a or si-HSP70 abrogated the chondroprotective effects of

gh LDH relea from sodium nitroprusside-treated cells and the proportion of

TUNEL positive cells were decread under hypoxia, transfection with si-HIF-1a or si-HSP70

almost completely blocked the effects. The findings indicated that HIF-1a-induced HSP70

overexpression incread the expression levels of ECM genes and cell viability, and protected

chondrocytes from apoptosis. HIF-1a may regulate the anabolic effects of chondrocytes under

hypoxic conditions by regulating HSP70 expression. _ 2014 Orthopaedic Rearch Society.

Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 32:975–980, 2014.

Keywords:

hypoxia-inducible factor-1a; heat shock protein 70; hypoxia; extracellular matrix;

apoptosis

DISCUSSION

A regulatory link exists between the oxygen nsing and the heat-shock pathways. This link

involves the hypoxia-dependent up-regulation of the heat-shock factor (HSF). HIF-1a caus

incread HSF transcription

during hypoxia as a means to increa the cellular abundance of HSF and increa the nsitivity

of the heat shock pathway.8 Under hypoxic conditions,HSP70 transcript levels are more

incread in an HSF- or HIF-1a-dependent manner than other HSPs in Drosophila Kc167 cells or

in growth plate of the tibial dyschondroplasia.8,9 However, it remained unclear whether HSP70

is regulated by HIF-1a in articular chondrocyte under hypoxia. To determine whether HIF-1a

affects the expression of HSP70, weanalyzed HIF-1a and HSP70 mRNA and protein levelsin

rabbit articular chondrocytes cultured under normoxia, hypoxia, or stimulated hypoxia. We

obrved that the levels of HSP70 mRNA and protein were higher under hypoxia and simulated

hypoxia than under normoxia, but that the effects were abrogated by inactivation of HIF-1a.

The finding suggested that HIF-1a regulates the expression of hypoxiainduced HSP70 in

chondrocytes. Previous studies have shown that HIF-1a binds to the HIF-1 binding site in the

hypoxia respon element (HRE) of hypoxia-inducible target genes, as well as to a HRE of the

HSP70 promoter, transcriptionally activating HSP70 expression. 17,18 The pathway may

cau overexpression of HIF-1a-induced HSP70 in chondrocyte under hypoxia. HSP90 also

plays a role in stabilizing HIF-1a, and mediates O2-independent ubiquitination and proteasomal

degradation. Hypoxia leads to an increa in the transcription factor HIF-1a, causing increas in

the levels of HSP70 and HSP90.9 Further examination is required for investigation into whether

the high HSP expression in this preceded or followed abnormal chondrocyte cell death.

Studies on the effects of HIF-1a on ECM metabolism in chondrocytes have shown that HIF-1a

was involved in the hypoxia-induced increa of PG and Col II, the main ECM genes, in human

articular chondrocytes.19,20 The ECM genes, however, are not direct targets of HIF-1a,21

suggesting that HIF-1a may indirectly increa hypoxia-induced ECM synthesis in chondrocytes.

Although we previously reported that HSP70 is involved in the heat-induced expression of

PG,12 the role of HSP70 in ECM expression under hypoxic conditions remains unclear. To

determine whether HSP70 expression affects ECM metabolism in chondrocytes under hypoxic

conditions, we also analyzed the mRNA levels of ECM genes, such as PG and Col II. We found

that the levels of PG and Col II mRNAs were significantly incread under hypoxia, but not in

cells transfected with si-HIF-1a or si-HSP70. The genes were also stimulated by CoCl2 under

normoxia. The findings suggest that the ECM metabolism in chondrocytes may be regulated

via HIF-1a-induced HSP70.

On the other hand, HIF-1a regulated the chondroprotective effects under hypoxic condition.6

We have reported that overexpression of HSP70 enhanced the metabolic activity of chondrocytes

and protected them from heat stress.22,23 We obrved that si-HIF-1a or si-HSP70 almost

completely abolished the chondroprotective effects induced by hypoxia, suggesting that

HIF-1a-induced HSP70 may increa chondrocyte viability under hypoxic conditions. We also

reported that the overexpression of HSP70 in chondrocytes inhibited NO-induced apoptosis.10

In this study, we found that chondrocytes cultured under hypoxia were protected from

NO-induced apoptosis, but that transfection into the cells of si-HIF-1a or si-HSP70 accelerated

Noinduced apoptosis. The findings suggest that, under hypoxic conditions, the pathway

involving HIF-1a and HSP70 may participate in the inhibition of stressinduced cytotoxicity.

The master regulator gene x-determining region Y box 9 (SOX9) is also esntial for

chondrocyte survival, and directly regulates the main cartilage matrix genes such as Col II and

aggrecan.24 SOX9 regulated by HIF-1a plays important roles in chondrogenesis in hypoxic

condition.25 SOX9 also interacts with HSP70 in chondrocyte.26 Here we showed that

HIF-1a-Induced HSP70 incread the expression of ECM mRNAs and chondrocyte viability,

and suppresd NO-induced apoptosis. The finding suggest that HIF-1a may regulates

interaction with HSP70 and SOX9.

Synovial fluid from the joints of patients with osteoarthritis (OA) contains less oxygen than

synovial fluid from healthy joints.27 Chronic hypoxia in the joints of OA patients has been

associated with incread levels of HIF-1a in chondrocytes.28 In addition,the levels of

expression of HSP70 in chondrocytes could also be correlated with the histological verity of

OA.29 In chondrocytes of OA patients, however, the levels of expression of HIF-1a and HSP70

may not be high enough to eliminate stress-induced damage to cartilage, resulting in the

progression of this disorder. Control of HIF-1a-induced HSP70 expression could provide a novel

therapeutic strategy for OA, but this hypothesis requires further examination.

In summary, this study showed, for the first time,that HIF-1a-induced HSP70 expression, at

least partially, was positively correlated with HIF-1a-dependent anabolic pathways.

题目：急性低氧刺激下树麻雀HSP70等基因的适

本科生毕业论文设计

应性变化

作者姓名 张 川

指导教师 李东明

所在学院 生命科学院

专业（系） 生物科学

班级（届） 2015届

完成日期 2015 年 4 月 13 日

目录

摘要 ........................................................................................................................... 2

关键词 ....................................................................................................................... 2

1 前言 ....................................................................................................................... 2

2 材料与方法 ........................................................................................................... 2

2.1 样品采集用具 ................................................................................................... 2

2.2 样品的采集及处理 ..................................................................................... 2

2.3 HSP70基因的克隆 ...................................................................................... 2

2.3.1实验药品及仪器 ................................................................................ 2

2.3.2 缓冲液及试剂的配制 ....................................................................... 3

2.3.3 提取RNA ............................................................................................ 3

2.3.4 RNA反转录成cDNA ........................................................................... 3

2.4 HSP70的定量分析 ...................................................................................... 4

2.4.1 实验仪器及药品 ............................................................................... 4

2.4.2 实验原理 ........................................................................................... 4

2.4.3 实时荧光定量PCR ............................................................................ 4

2.4.4 数据处理与分析 ............................................................................... 5

3 结果 ....................................................................................................................... 5

3.1 肝脏总RNA的抽提 ..................................................................................... 5

3.2 mRNA的比较 ................................................................................................ 6

4 讨论 ....................................................................................................................... 6

5 结论 ....................................................................................................................... 7

参考文献 ................................................................................................................... 7

英文摘要 ................................................................................................................... 9

英文关键词 ............................................................................................................... 9

1

急性低氧刺激下

树麻雀HSP70基因的适应性变化

作者：张川 指导教师：李东明

摘要：氧是动物生命活动中不可或缺的元素。在低氧或缺氧刺激下，动物组织细胞会受到损害或死亡。

热休克蛋白70（HSP70），是一种高度保守的应激蛋白。在各种理化因素的刺激下，HSP70对细胞内的蛋

白质具有稳定性，以保护有机体组织和结构少受损害。目前，针对HSP70的研究主要集中于哺乳动物，

对鸟类的研究尚少。本研究以树麻雀()为研究对象，研究其在急性低氧条件下(不同低

Pasr montanus

氧程度和不同处理时间)肝脏中HSP70 mRNA的表达量的高低。实验数据显示，树麻雀肝脏组织处的HSP70

mRNA的表达量在3km-8h组和3km-24h组中呈上升趋势，但并无显著性。在3km-8h组和6km-24h组中，

树麻雀肝脏组织处的HSP70 mRNA的表达量有不同程度的降低。但通过LSD多重比较只有6km-24h低氧

处理组显著低于其他组。

关键词：热休克蛋白70（HSP70）；急性低氧刺激

1 前言

热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白。正常情况下，热休克蛋白表达并不多，而在

机体受到外界刺激时，热休克蛋白迅速大量表达，维持细胞内蛋白质的稳定，减少有机体

组织结构的损害。在热休克蛋白中，又以热休克蛋白70（HSP70）诱导表达最多。目前，

研究发现HSP70对动物的心肌保护具有很重要的作用。在低氧刺激下，它能维持心肌的正

常心律，减少心肌受损面积，减小心肌因缺血而坏死的范围。同时，还能增加有机体组织

结构的耐受性。不过，就目前而言，这些研究大多集中于哺乳动物，而对同样是高等动物

的鸟类的研究却很少。本研究是以树麻雀为研究对象，研究其在不同低氧程度及不同处理

时间后，肝脏中HSP70 mRNA的表达量，以增加对HSP70的了解。

2 材料与方法

2.1 样品采集用具

解剖刀、圆头剪、解剖镊、尖头剪、止血钳、冰盒、液氮罐（10升）、苯巴比妥、模

拟低压低氧舱。

2.2 样品的采集及处理

采用雾网法捕捉野生树麻雀，测量体重等各项指标后，放入低压氧舱适应15分钟，

根据不同处理时间和不同低氧程度进行低氧处理，分为五组：对照组（N=9）、3km-8h组

（N=6）、3km-24h组(N=8)、6km-8h组(N=5)、6km-24h组(N=7)。

低氧处理后，注射麻醉剂（苯巴比妥，7.5μl/g体重），断头处死，迅速获取麻

雀肝组织置于液氮中速冻保存后，移至-80℃超低温冰箱备用，用于提取总RNA。

2.3 HSP70基因的克隆

2.3.1实验药品及仪器

实验仪器：匀浆器（sigma）、吸头(Axygen)、振荡器（生工）、1.5ml EP管（Axygen）、

2

移液器（艾本德）、0.2ml PCR管（Axygen）、高速冷冻离心机（艾本德）、超净工作台、

恒温水浴锅（DK-8D，一恒）、电子分析天平（AE240）、高压灭菌锅（LDZX-50KBS，申

安）、电泳仪（DYY-6D，六一）、凝胶成像分析系统（TU-190，AlPha）、超微量分光光

度计（ND-1000，Thermo Fisher）、梯度PCR仪（ABI）。

实验药品：Trizol、琼脂糖、无水乙醇、焦碳酸二乙酯、LB培养基、PEASY-Blunt

SimPle Cloning Kit（CB111-01，北京全式金）PEASY-T1 Cloning Kit（CT101，北京

全式金）、TransScriPt First-Strand cDNA Synthesis SuPPer Mix（AT301，北京全

式金）、TransStart FastPfu DNA Polymera（AP221，北京全式金）、高纯质粒小提

试剂盒、E.Z.N.A. Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01,OMEGA)。Axygen PreP DNA 凝胶回收

试剂盒（AP-GX-50）Extaq DNA Ploymera（Takara）、Trans 5a感受态细胞（JC-PD002,

北京全式金）。

2.3.2 缓冲液及试剂的配制

50×TAE：将242gTris溶于900ml ddH2O中，加入57.1ml冰醋酸和100ml 0.5mol/L EDTA

二钠盐，定容至1L，高温高压灭菌；

0.1% DEPC水溶液的制备：将0.1%的DEPC加入ddH2O中，密封并搅拌15h后，高温高压

灭菌，4℃冷藏备用；

液体LB培养基（1L）：5g酵母粉，10g蛋白胨，ddHO定容1L，10g氯化钠，高温高压灭

2

菌，常温保存备用；

AmP抗性液体LB培养基：将100mg/ml的AmPicillin以1:1000加入液体LB培养基中，4℃

保存备用；

AmP固体LB培养基： 5g酵母粉，10g蛋白胨，ddHO定容1L，10g氯化钠，加入10g Agar，

+

2

高温高压灭菌，降温后将100mg/ml的AmPicillin按照1:1000的比例加入，倒板，4℃保存

备用。

2.3.3 提取RNA

（1）准备好无菌匀浆器、枪头、移液器、1.5ml EP管等，用酒精把超净台擦拭

干净，打开紫外灯，灭菌15分钟以上；

（2）分次从-80℃超低温冰箱中取出5个实验组的肝脏样品，放入液氮中备用；

（3）利用Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01,OMEGA)，按操作步骤提取RNA；

（4）用超微量分光光度计检测提出的RNA浓度及纯度，分装出反转录样品，其余RNA

分装后放入-80℃超低温冰箱保存以备用。

2.3.4 RNA反转录成cDNA

（1）使用TransScriPt First-Strand cDNA Synthesis SuPPer Mix，按要求加样，

混匀后按照说明书要求进行实验；

（2）反应产物即为树麻雀肝组织cDNA，放入4℃冰箱备用；

+

3

2.4 HSP70的定量分析

2.4.1 实验仪器及药品

实验仪器：进口吸头、移液器（EPPendorf）、96孔板（Axygen）、进口1.5ml EP管、

封板膜（ABI）、恒温水浴锅、灭菌锅、超净工作台、实时定量PCR仪（MX3005P）、超微量

分光光度计。

实验药品： TransStrat ToP Green qPCR SuPerMix（AQ131，北京全式金），焦碳酸

二乙酯（DEPC；E174，Amresco）。

2.4.2 实验原理

Real-time PCR是将带有荧光的基团加入到整个PCR的反应体系中，当反应体系中的荧

光基团与双链DNA结合时，发出荧光。通过反应体系中荧光强度变化，可以全程监测PCR产

物的扩增，完成对模板定量分析的目的。Ct值表示每个反应中的荧光信号到达所设定阈值

所经历的循环数。以β-actin作为内参，每次实验单个样本重复3次，PCR结束后得到扩增

曲线和Ct值。溶解曲线是实时荧光定量PCR的主要参数，当它只存在一个较为集中的主峰

时，实验的结果是真实可信的。

2.4.3 实时荧光定量PCR

(1) 将2.3.4中所得cDNA稀释10倍备用。

(2) 设计实时荧光定量PCR引物：

Sen 5′GCCGCAAGTATGATGACCCC 3′;

Antin 5′TGGGCTTGCCTCCCTCATT 3′ ;

β-actin Sen： 5' -CTACGAAGGCTATGCCCTCCCC-3';

β-actin Anti-n：5'-CCTCTCGGCTGTGGTGGTGAAG-3'。

(3) 在冰上按(表1 )配制实时荧光定量PCR所用混合液，并加入96孔板中。

(4) 使用MX3005P实时定量PCR仪进行PCR反应，反应程序如(表2 )。

表1 实时荧光定量PCR反应体系的组成和加样量

反应组分 加样量

2×TransStarTM ToP Green qPCR

SuPerMix

Passive Reference Dye II（50×） 0.4μl

Forwars Primer（10μM） 0.4μl

Rever Primer（10μM） 0.4μl

cDNA模板 1μl

ddH2O 7.8μl

10μl

4

2.4.4 数据处理与分析

用2方法计算出HSP70 mRNA的表达量。首先计算实验组与对照组3个平行样品的

-△△Ct

平均Ct值，其中△Ct是每个实验组Ct值减去内参基因β-actin Ct值。△△Ct为实验

组每组△Ct值减去对照组△Ct值。用SPSS软件分别对不同海波不同低氧时间的肝脏组织

HSP70 mRNA表达量进行单因素方差分析，并分析其统计学意义，针对有较显著差异的，再

利用LSD法进行多重比较。图示由GraPhPad Prism5.0软件生成。

表2 Real-time PCR反应条件

步骤 温度 时间

预变性 94℃ 30s

PCR反应 94℃ 5s

收集荧光 60℃ 30s

3 结果

3.1 肝脏总RNA的抽提

提取的肝脏总RNA浓度和纯度用超微量分光光度计、电泳进行检测。本次提取的肝脏

总RNA浓度为2000 ng/μl左右，质量较好，可进行后续的实时定量PCR实验。

3.2 mRNA的比较

目的基因HSP70和内参基因β-actin的溶解曲线均达要求（图1、2）。通过扩增曲线

图可知，内参基因β-actin在34个循环后达到荧光阈值，目的基因HSP70在38个循环

后达到荧光阈值（图3、4）。

40

个

循

环

图1 HSP70内参基因的溶解曲线 图2 HSP70目的基因的溶解曲线

图3 HSP70内参基因的扩增曲线 图4 HSP70目的基因的扩增曲线

5

单因素方差分析，树麻雀在不同低氧处理组无显著差异，（,=2.122，=0.103）。

FP

430

LSD多重比较中，树麻雀肝脏组织中HSP70的mRNA表达量在6km-24h低氧处理后显著

低于对照组（p=0.013）、3km-8h组（p=0.046）和3km-24h组（p=0.025）。

3km-8h组树麻雀肝脏组织的HSP70 mRNA表达量比起对照组有微量增加，3km-24h组

又比3km-8h组要多。且都比6km-8h，6km-24h组的HSP70 mRNA表达量要多。不过，结果

并不显著。而在6km-8h组与6km-24h组中，树麻雀肝脏组织中HSP70 mRNA的表达量呈下

降趋势，均都低于对照组，并且6km-24h组具有显著性（图5）。

图5 树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量

4 讨论

通过单因素方差分析实验数据可知，在低氧刺激下，树麻雀无显著性差异。在3km-8h

组中，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量与对照组相比，有微量增加。而3km-24h组HSP70

mRNA表达量多于3km-8h组。说明在3km低氧处理下，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量会

随着时间增加，而缓慢的增加。根据LSD多重比较可知，在6km-24h组中，树麻雀肝脏处HSP70

mRNA表达量与对照组、3km-8h组和3km-24h组相比，有显著减少，可能是长时间的深度低

氧处理，树麻雀肝脏组织细胞，有一部分损伤，故肝脏组织总的HSP70 mRNA表达量有大量

减少。在6km-8h组中，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量相对于对照组也有小幅减少。

树麻雀在进行急性低氧处理时，刚开始有一定程度的增加，随着低氧程度和处理时间增加

肝脏组织受损，造成树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量减少。

HSP70作为一种应激蛋白，动物在低氧刺激下，其表达量应有显著增加。而研究显示

树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量却并非如此，甚至在6km-8h组和6km-24h组中有不同程

度的降低。可能是物种不同，对低氧的刺激的感受也有所不同。我们猜测，在6km海拔高

度急性低氧刺激时，树麻雀肝脏组织可能有一部分损伤，故损伤部分不能表达HSP70 mRNA，

而在存活的肝脏组织细胞中，HSP70 mRNA的表达量可能有所增加。这还需要进一步的实验

验证。

6

5 结论

在急性低氧刺激下，树麻雀随着刺激强度和时间的增长无显著差异。在急性低氧应答

过程中，树麻雀肝脏组织中的HSP70 mRNA表达量在3km海拔高度的低氧刺激下随时间增

长而增加；在6km海拔高度的低氧刺激下HSP70 mRNA表达量随时间增长而减少。

参考文献：

[1] Welch WJ. Mammalian stress respon: cell physiology, struc2 ture / function of stress

p roteins, and imp lications for medicine and dia[ J ]. Physiol Rev, 1992, 72 (4) : 1063

- 1081.

[2] Suzuki k, Sawa Y, Kagisaki k, et a l. Reduction in myocardial apop tosis associated with

overexp ression of heat shock p rotein 70 [ J ]. Basic Res Cardiol, 2000, 95 (5) : 397 - 403.

[3] Weber, R.E., Fago, A., 2004. Functional adaptation and its molecular basis in vertebrate

hemoglobins, neuroglobins and cytoglobins. Respiratory physiology & neurobiology 144,

141-159.

[4] Ishii T ,VdonoH ,Yamano T ,et al. Isolation of MHC class I - restricted tumor antien

peptide and its precursors asso2 ciated with heat shock proteins HSP70 , HSP90 and gp96 [J ].

Immunol ,1999 ,162 :1303 - 1309.

[5] Shinji Tsuchida,Yuji Arai, Kenji A. Takahashi, Tsunao Kishida, Ryu Terauchi, Kuniaki

Honjo, Shuji Nakagawa, Hiroaki Inoue, Kazuya Ikoma, Keiichiro Ueshima, Tomohiro Matsuki, Osam

Mazda, Toshikazu Kubo。HIF-1a-Induced HSP70 Regulates Anabolic Respons in Articular

Chondrocytes under Hypoxic Conditions[ J ]。Department of Orthopaedics，2014，（23）：975-980.

[6] Rupik W, Jasik K, Bembenek J, Widłak W (2011) The expression patterns of heat shock genes

and proteins and their role during vertebrate’’s development. Comp Biochem Physiol Part

A159:349–366

[7] Silver IA. 1975. Measurement of pH and ionic composition of pericellular sites. Philos

Trans R Soc Lond B Biol Sci 271:261–272.

[8] Zhang, H., Wu, C.X., Chamba, Y., Ling, Y., 2007. Blood characteristics for high altitude

adaptation in Tibetan chickens. Poultry Science 86, 1384-1389.

[9] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 -

132.

[10] 陈兰英,朱泮民,李冰冰,等. HSP70 的结构、特性和功能研究进展[J ] . 平顶山工学院学

报,2004 , 13 (2) :56 - 58.

[11] 姜先荣,杨杰. 分子伴侣与蛋白质折叠[J ] . 安徽教育学院学报,2001 , 19 (3) 55 - 56.

[12] 任宝波,王玉艳,王纯净,等. HSP70 家族的分类及基因结构与功能[J ]. 动物医学进展,2005 ,

(26) :98 - 101.

[13] 姚瑶，李东明，吴越峰等。急性低氧条件下树麻雀HIF-1α和VEGF mRNA及代谢、抗氧化指标的

变化特征研究[J ]。河北师范大学，2014，（Q95）: 60-64。

[14] 曾涛，李国勤，卢立志，陶争荣等。热休克蛋白70及27的研究进展[J ]。浙江省农科院畜牧兽

医研究所，2012，（34）：40-43.

[15] 程维杰 ,李秋玲 ,孙延鸣,王洪梅，等。热休克蛋白70 ( HSP70) 研究进展[J ]。山东省农业科

7

学院奶牛研究中心，2008，（24）：55-58.

[16] 冯起国。热休克蛋白[J ]。辽宁中医学院，1998，（4）：468-469.

8

Adaptive changes during acute hypoxia stimulate HSP70 gene

pasr montanus

Abstract: Oxygen is the animal life activities indispensable element. Under hypoxic or anoxic stimulation of

animal tissue cells damage or death. Heat shock protein 70 (HSP70), is a highly conrved stress proteins. In

the stimulation of a variety of physical and chemical factors, HSP70 protein in cells are stable to protect the

organization and structure of organisms do less damage. Currently, rearch on HSP70 focud on mammals,

yet little rearch on birds. In this study, the pasr montanus as the rearch object, which (to varying degrees

of hypoxia and different processing time) liver expression of HSP70 mRNA level in acute hypoxic conditions.

Experimental data show that the expression of HSP70 mRNA in liver tissue of the pasr montanus in the

3km-8h group and the 3km-24h group is rising, but not significantly. In the 3km-8h group and 6km-24h group,

the expression of HSP70 mRNA in liver tissue of the pasr montanus has a different degree of reduction. But

by LSD multiple comparisons only 6km-24h hypoxia treatment group was significantly lower than other

groups.

Keywords: heat shock protein 70; hypoxia

9

河北师范大学本科生毕业论文（设计）评议书

任务书编号：2015届103

姓 名 张 川 学 院 生命科学院 专 业 生物科学 班级（届） 2015届

论文题目 急性低氧刺激下树麻雀HSP70等基因的适应性变化 完成时间 2015年4月13日

热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白。正常情况下，热休克蛋白表达并不多，

而在机体受到外界刺激时，热休克蛋白迅速大量表达，维持细胞内蛋白质的稳定，

减少有机体组织结构的损害。在热休克蛋白中，又以热休克蛋白70（HSP70）诱导

表达最多。本研究以树麻雀为研究对象，探究其在急性低氧刺激下，肝脏组织的

HSP70 mRNA表达量的变化。

论

文

内

容

摘

要

捕捉野生的树麻雀，选取体型相当的个体分成五组。对它们分别进行常氧对照

组、3km-8h组、3km-24h组、6km-8h组、6km-24h组处理。然后提取树麻雀肝脏组

织中的mRNA，并反转录成cDNA。再通过对HSP70 mRNA的定量分析，可得出数据。

经过对数据的处理和分析可知，树麻雀肝脏组织处的HSP70 mRNA的表达量在3km-8h

组和3km-24h组中呈上升趋势，但并无显著性。在3km-8h组和6km-24h组中，树麻

雀肝脏组织处的HSP70 mRNA的表达量有不同程度的降低。但通过LSD多重比较，只

有6km-24h低氧处理组显著低于其他组。故在急性低氧应答过程中，树麻雀肝脏组

织中的HSP70 mRNA表达量在3km海拔高度的低氧刺激下随时间增长而增加；在6km

海拔高度的低氧刺激下HSP70 mRNA表达量随时间增长而减少。

指

导

教

师

评

语

年 月 日

指 导 教 师 职称 初评成绩

姓名 职称 教研室

组长

成员

答

辩

小

组

答辩记录：

记录人签字： 年 月 日

答辩小组意见：

组长签字： 年 月 日

学院意见：

评定成绩： 签章

年 月 日