免疫固定电泳操作规程

免疫固定电泳操作规程

时间：创作：欧阳数

2021.03.02

二. 项目名称

免疫固定电泳

(HYDRAGEL IMMUNOFIXATION)

三. 检验方法名称

琼脂糖凝胶免疫固定电泳

四. 方法学原理

血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于-球蛋白和丫 -球

B

蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血 症。为

鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电 泳是一种简

单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复 合物和被固定在

相应的位置上，通过下列四个步骤：

1.

蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。

2.

电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固 定剂

和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗 血清在凝

胶内渗透扩散。

3.

使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的 蛋白

质贮留在凝胶内。

4.

将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质 经电

泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。

为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测 试。

经电泳后，作为参考泳道以显示电泳后的蛋白 质。其余五条

ELP

泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与 抗血清,

Y (IgG) > a

(IgA) > U (IgM)

重链和、入轻链

K

(游离和非游离)反应与否进行鉴别。该技术简单、快 速、图象

清晰，易于解释结果。

五. 方法学溯源

自 年由 发现了移界电泳

1930 Tilius (moving boundary

eectrophoresis),

而后，这种技术的各种局限性已逐渐 被区带

电泳所克服，区带电泳 的条件和支

(zone elecrrophoresis )

持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化 学手段观察其电泳

特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最 好的方法，免疫固定电泳

技术是目前应用最广泛的方法之

O

六. 仪器

(-)型号：

SEBIA HYDRASYS (PN1210)

(二)分析和计算参数：

1.

2.

3.

4.

处理量：约个样本/小时

18

所需样本量：

10ul

检验时间：约分钟

55

重复性：有良好的批内和批间重复性

5.

电泳参数：电压(可选至

0-300V 3000V)

电流

0 —500mA

功率

0 — 100W

七. 试剂及配套品

(一)试剂

1.

HYDRAGEL 1 IF

试剂盒

HYDRAGEL2IF

试剂盒

HYDRAGEL4IF

试剂盒

HYDRAGEL9IF

试剂盒

(1)

(2)

(3)

商标：

SEBIA

包装规格：测试测试测试测试

10/20/40/90

货号：

PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309

2

.脱色液

(1) SEBIA

(2) Pack for 10 X 100ml

(3) PN4540

(4)

商标:

包装规格：

货号：

成分：柠檬酸

3

•洗涤液

(1)

(2)

(3)

(4)

商标：

SEBIA

包装规格：

Pack for 10 X 80ml

货号:

PN4541

成分：叠氮钠

4.

稀释剂

(1)

商标:

SEBIA

包装规格：

Pack for 1 X 5ml

(2)

(3)

货号:

PN4587

(二)配套品：试剂抗体

IF

(1)SEBIA

商标：

(2 ) Pack for 5Xlml

包装规格：

(3) PN4315

A.

操作步骤

㈠开机，启动电泳仪。

㈡将只(用于只(用于或只(用 于点

11, 2IF) , 24IF)39IF)

样梳置于整表面，有数字的一端向上，在分钟 内完成每块加

2

样梳的加样，每孔加样品，然后齿梳

10ul

向上把加样梳放于湿盒内分钟。

5

电泳/免疫固定泳道

孔号

ELP G A M K L

1 2 6

2 6

9 13 14

1 2 6

7 9

13 14 15 17

3 4 5 7

10 11 12

8 10 11 12

Hydrasys 1 IF 3 4 5

Hydrasys2/4 IF

13

或号样本

24

或号样本

Hydrasys 9 IF

1,47

或号样本

2, 58

或号样本

3, 69

或号样本

3 4 5

16 18

㈢ 选择相应的电泳程序,

“IF”

㈣ 从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的 钉上，

再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多 余的液体，

在温控板表面下处加蒸馆水或去离 子水，将凝胶片

1/3200ul

底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯 曲凝胶片慢慢放平，

注意凝胶片下面勿出现气泡。

㈤自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的 保护支

架，、的点样梳置于支架号位，的只 点样梳则分

12IF64IF2

别置于号和号，的只点样梳则分别 置于号和

399IF32, 610

号，注意点样梳上的数字必须面对操作 者，关上电泳舱盖，按

下键盘左侧的绿色箭头键，电泳开始，确保仪器右侧

“START”

的空气通道不被堵塞。

（为电泳仪自动发岀蜂鸣声，提示电泳结束，进行免疫固定操

作。打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，移走两支架， 用湿

纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上， 按如下要

求将动物血清抗体加入抗体加样条：

• • Hydrasys 1 IF68 P 1

用孔抗体加样条海孔加抗体

• • Hydrasys 2/4IF15:28 U 1

用孔抗体加样条人份每孔加

抗体，人份每孔加抗体

412 u 1

-•Hydrasys 9 IF1881

用孔抗体加样条：每孔加卩抗 体

固定好抗体加样架，将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳 舱

盖，按“键开始免疫固定。

Start"

（七）分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，提示

10“PAPER

BLOTTING"

,移走抗体加样架，弃去抗体加样条，放一厚 滤纸光

面向下盖于于凝胶表面，左手固定好滤纸，右手手 指用力的摩

擦滤纸表面，注意勿将滤纸移动，关闭电泳舱 盖，按

“Start”

键开始凝胶表面多余抗体的吸收。

（A） 3

分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，移

去滤纸，关闭舱盖，按“键开始凝胶片的干燥。

Start"

仇）分钟启，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开由泳舷盖，取 出凝

6

胶片，用湿纸巾擦拭温控板，将胶片固定于凝胶支架 上放入染

色空间中，在检查洗液瓶屮是否有洗液， 染色液瓶内是

400ml

否有染色液，脱色液瓶内是否有 脱色液以及是否

300ml1000ml

排空了废液瓶后，菜单上选择染色 指令，按“键开始染

Start"

色。

（十）在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂

鸣声，取出凝胶支架，将烘干的胶片取下。

九临床意义

对多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、分泌型骨 髓

Waldenstrom

瘤、轻链病、重链病等研究有重大意义。

1.

正常人体内有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定 电泳

图谱可见均匀分布的

IgG/A/M

2. IgG/A/MKappars lammda

在及的泳道上发现浓集的 条

带即为病理性的。

十.标本要求

㈠取新鲜血清进行分析，根据临床实验室对各种试验所使 用的

操作程序进行血清样本的采集，样本置于冰箱内 可

（28°C）

〜

保存一周，若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰

冻的血清样本加入的叠氮钠可以增加其存放稳定

0. 02g/dl

性。

㈡为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如 下稀

释，并混匀。

泳道

蛋白电泳和其他免疫球蛋白固定泳道 30

（ELP）

血清稀释剂

（ul） （U1）

20 免疫固定泳道

60

100

IgG

----------------------------- --------- --------- 殊 情

况

•当总免疫球蛋白的水平〉稀释剂量加倍（除了 泳道）

20g/L,ELP

•当总免疫球蛋白水平＜稀释剂量减半（除了 泳道）

5g/L,ELP

•冷藏或冰冻后，某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝 胶）

可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍 而存在点

样问题。在这样情况下，加液化剂于沁 血清中，混

25ul75

匀秒。然后按规定程序继续进行。

15

•某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定 泳道

上均出现单克隆片段。在这样情况下准备—疏基乙醇

（i）1%B

（这种还原剂可在室温于未封闭微管内保存周）加

1 （ii）25ul

还原剂于血清中混匀并令 其反应至少分钟（至

75ul（iii）15

多小时）后按规定程序继续进 行。

3

㈣避免使用血浆标本。

十.操作注意事项

㈠为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一 并使

用。

㈡用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太 长，应

快速移去，以免凝胶脱水。

㈢ 注意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应均匀挤捏 使缓

冲液能分布均匀。

时间：创作：欧阳数

2021.03.02