免疫组化经常使用试剂

免疫细胞化学经常使用试剂介绍

佚名

一、固定剂

大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽

类和蛋白质的物理、化学性质不同，因此对不同的固定方式或固定剂的反映也不尽相同。某

些固定剂乃至可同时破坏和/或爱惜同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化

学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并依照需要来选

择适宜的固定剂（或固定方式）和改良固定条件。

目前，免疫细胞化学研究中经常使用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛

最为经常使用。在此，简要介绍几种目前较为经常使用和推荐的固定剂，以供读者选用。

1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）

试剂：多聚甲醛 40g

0.1mol/L磷酸缓冲液 至1000ml

配制方式：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲

液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完

全溶解，通常需滴加少量1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，

充分混匀。

该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定

2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保留。

2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠

试剂：A液：多聚甲醛 40g

蒸馏水 400ml

B液：Na2HPO4·

蒸馏水 300ml

蒸馏水 200m

配制方式：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方式同前），最多聚甲醛完全溶解后

冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽可能幸免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配

制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～

7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保留备用。

该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制

的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保留。组织标本于

该固定液中，4℃冰箱保留数月仍可取得中意的染色成效。

3．Bouin’s液及改良Bouin’s液

试剂：饱和苦味酸

40%甲醛 250ml

冰醋酸 50ml

配制方式：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后

存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。

该固定液为组织学、病理学经常使用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结

构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有必然损害，且组织收缩较明显，故不适于组织

标本的长期保留。另外，操作时，应幸免吸入或与皮肤接触。

4．Zamboni’s(Stefanini’s)液

试剂：多聚甲醛 20g

饱和苦味酸 150ml

Karasson-Schwlt’s PB 至1000ml

配制方式：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使

充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’

s磷酸缓冲液的配制配制方式见后）。

该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保留较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细

胞化学研究，为实验室经常使用固定剂之一。咱们在应用中，常采纳2.5%的多聚甲醛和30%

的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定成效，保留更多的组织抗原。固按时刻为6～

18h。

5．PLP液 PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液

（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）

试剂：过碘酸钠

赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：

多聚甲醛

蒸馏水

配制方式：

（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g

溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，

将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保留，

最好两周内利用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。

（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多

聚甲醛液（方式见前）。过滤后4℃冰箱保留。

（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4

终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固按时不需再调pH值。固按时

刻为6～18h。

该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保留较好。其机制是

借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形

成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部份组成，抗原决定簇位于蛋白部份，

故该固定剂有选择性地使糖类固定，如此既稳固了抗原，又不阻碍其在组织中的位置关系。

Mclean和Nakane等以为，最正确的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨

酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。

6．Karnovsky’s液（pH7.3）

试剂：多聚甲醛 30g

25%戊二醛 80ml

0.1mol/L PB 至1000ml

配制方式：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB

至1000ml，混匀。

该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛

中长时刻固定能更好地保留组织的抗原性和细微结构。固按时最好先灌注固定，接着浸泡固

定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。

7．0.4% 对苯醌 （Parabenzoquinone）

0．01mol/L PBS 1 000ml

配制方式：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。

对苯醌对抗原具有较好的爱惜作用，但对超微结构的保留有必然阻碍，故常与醛类固定

剂混合利用。一样要求临用前配制，且幸免加热助溶，因加热或放置时刻太长，固定液变成

棕色至褐色，会使组织标本背景增加，阻碍观看。另外，对苯醌有剧毒，利历时幸免吸入或

与皮肤接触。

8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）

试剂：对苯醌 20g

多聚甲醛 15g

25%戊二醛 40ml

0.1mol/L二甲酸钠缓冲液 至1000ml

配制方式：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二

醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。

对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不阻碍超微结构的保

留，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。

9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液

试剂：0.05mol/L PB 500ml

0.01mol/L PBS 500ml

Tris 约14g

浓HCl 少量

ECD 10g

配制方式：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）

溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事前称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，

用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，现

在，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以

PBS洗去固定液，即可进一步处置。

ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－

imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，经常使用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定

也有良好成效。ECD单独应历时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，成

效明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保留较好。目前以为是一

种用于培育细胞电镜水平免疫细胞化学研究的专门好的固定剂。

10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）

配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷

自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，使劲撞击安瓿，待其破

后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用头几天配制。

（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储蓄液，于冰箱中密封

保留。

（2）1% OsO4-PB：

试剂：A、2.26% NaH2PO4·

C、5.4% 葡萄糖 5ml

配制方式：先别离配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH

调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。

（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：

试剂：2% OsO4水溶液 10ml

0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4） 10ml

配制方式：取2%OsO4储蓄液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液

充分混合即可。

OsO4是电镜研究所必需的试剂，经常使用于后固定。尽管OsO4要紧为脂类固定剂，

但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反映产物经OsO4

处置后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于OsO4的反映产物对光及电子有较明显的吸

收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平经常使用1%的高锰酸钾，

在电镜水平那么经常使用H2O2来处置。

以上介绍了目前免疫细胞化学中经常使用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如

70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液

都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它

方式不成功时，也可试用。总之，把握一个原那么，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁

用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。目前多数以为，对生物标本较好的固定方法是：

用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓

冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处置，有助于超微结构和许多肽类抗原的保留。对其它较

难保留的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。

二、缓冲液

免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即便是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度

等也常常不同。在此介绍几种最经常使用的缓冲液的配制。

1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）

试剂： NaH2PO4·2H2O

Na2HPO4·12H2O

配制方式：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，二者按

必然比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），依照需要可配制不同浓度的PB和PBS。

（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)

加重蒸水至1000ml溶解。

（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g

或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。假设pH偏高或偏低，可通过

改变二者的比例来加以调整，室温保留即可。

2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）

试剂：0.2mol/L PB 50ml

NaCl 8.5～9g(约0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制方式：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后

加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。假设拟配制0.02mol/L的PBS，那么PB量加倍即可，

依此类推。

PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为经常使用的缓冲液，0.01mol/L的PBS要紧用于

漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，不然需要调整。0.1mol/L的PB

经常使用于配制固定液、蔗糖等。一样情形下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L

的PBS时，常可达到要求的pH值，假设需调整pH，通常也是调PB的pH。

3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液

试剂： NaH2PO4·

Na2HPO4·

重蒸水 至1000ml

配制方式：同前

该缓冲液要紧用于配制Zamboni’s固定液。

4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。

1N HCl 约420ml

重蒸水 至1000ml

配制方式：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N

的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储蓄液，于4℃冰箱中保留。免

疫细胞化学中经常使用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，历时取储蓄液稀释10倍即可。

该液要紧用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。

5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）

试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液 100ml

NaCl 3.5～9g(0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制：先以重蒸水少量溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分

摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。

TBS要紧用于漂洗标本，经常使用于免疫酶技术中。

6．Tris-TBS(PBS)

试剂：Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)

0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6） 1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

NaCl 8.5～9g

重蒸水 至1000ml

配制方式：先以重蒸水少量溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），

最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。

该液经常使用浓度为1%及0.3%，前者要紧用于漂洗标本，后者要紧用于稀释血清。

7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液

试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠 500ml

0.1N HCl 28ml

蒸馏水 至1000ml

配制方式：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的

二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂

酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓

冲液。

8．几种经常使用的不同pH值缓冲液的配制表

（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）

pH

0.2mol/L NaH2PO4(ml)

0.2mol/L Na2HPO4(ml)

(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）

(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）

pH

0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）

0.2N HCl(ml)

25

25

三、显色液

免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反映所形成的复合物本身无色，无法直接观看，因此

需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观看。经常使用的显

色液有：

1．DAB（Diaminobenzidine）显色液

DAB即3，3-二氨基苯联胺

试剂：DAB（经常使用四盐酸盐） 50mg

0.05mol/L TB 100ml

30% H2O2 30～40μl

配制方式：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，

使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。

DAB显色液要紧用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光

镜下观看，也可经OsO4处置后，增加反映产物的电子密度，用于电镜观看。但有几点需注

意：DAB溶解要完全，不然未溶解的颗粒沉积于标本上阻碍观看；DAB浓度不易太高，不

然显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽可能幸免

与皮肤接触，用后及时完全冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后利用。

2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液

配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg

纯乙醇 10ml

0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml

30% H2O2 10μl(0.003%)

配制方式：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使

其终浓度为0.005%，切片显色时刻一样为5～20min。

配方2：4-Cl-1-萘酚

N-二甲基甲酰胺（DMF）

0.05mol/L TB(pH7.6)

30% H2O2

℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织

标本（注意：温度太高易损伤标本，太低那么易从头显现沉淀）。显色时刻一样为5min左

右。

4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。

多数以为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等以为，白色沉淀可作为背景，使

阳性部位更易观看。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。

3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液

试剂：AEC 20mg

0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5） 50ml

30%H2O2 25ml

配制方式：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入

30%H2O2。切片显色时刻为5～20min。

该显色液作用后，阳性部份呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，那么成效更

佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

4．TMB显色液

试剂：TMB

HCl

亚硝基铁氰化钾

无水酒精

配制方式：

（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，

再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。

（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。

（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完

全溶解。

（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体

在20min内应维持清亮的黄绿色，不然可能已有污染）。酶反映时，加入终浓度为0.005%的

H2O2。

（5）要紧显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）

后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每

100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出

标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封

片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染

5min后贴片、脱水、封片。

TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞

与细胞器中的HRP反映，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位

产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种专门好的发色团。同时反

映产物的沉淀，使得HRP的活性部位加倍暴露，利于酶氧化反映进行。TMB的反映产物为

深蓝色，利于光镜观看，且反映产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB那么被

限制在其内），故TMB反映的检测阈较低。由于上述优势，目前TMB经常使用于光镜及超

微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液

和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，

故利历时应带手套及在通风条件下操作。

5．NBT显色液

试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分

混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保留，用前复温。

B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，

用前恢复至室温。

C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、

5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。

NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP

即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性

磷酸酶（Alkaline phosphata, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉

淀。

四、粘附剂

在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常阻碍工作的质量的速度，故粘附

剂的选择和利用就显得较为重要。

1．铬矾明胶液

明胶（Gelatine） 5g

H2O ~1000ml

方式：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解

后，再加入铬矾。注意温度太高易使明胶烧糊，包被玻片时最好操纵水温在70℃。如有明

显残渣，过滤后利用。

2．甲醛-明胶液

蒸馏水 至100ml

配制方式：用少量蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后

补充蒸馏水至100ml混匀即可。

3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）

试剂：多聚赖氧酸 5g

蒸馏水 ~1000ml

配制方式：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成

0.01～0.5%浓度。4℃保留，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，成效无明显阻碍，工作液常

再稀释10～50倍。

4．Vectabond试剂 该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂

与一样的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，

使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时刻较久。一个试剂盒（7ml）可

配成350ml工作液（用丙酮配）。处置载玻片前（事前酸处置），用染色缸装好各类液体，

按以下程序进行：

干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：将载玻

片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃留宿）→用铝箔

包好，室温寄存备用。

注意：幸免污染（尘埃等）。

综上述方式处置的载片一样可寄存半年以上。

五、封固剂

1．甘油-TBS及甘油-PBS

配制方式：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排

除后方可利用。

2．甘油-明胶（冻）

试剂：明胶 10g

甘油 12ml

蒸馏水 100ml

香草酚 少量

配制方式：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml

甘油混合均匀。少量香草酚是为了防腐。

3．液体石蜡 液体石蜡因含杂质少，很少引发非特异性荧光，故经常使用于荧光组

化及免疫荧光法时标本的封固。

4．DPX

试剂：Distrene 10g

酸二丁 5ml

二甲苯 35ml

DPX为中性封固剂，用于多种染色方式匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽可能

使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。假设感过于粘稠，也可加少量二

甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上显现许多干燥的空泡，

阻碍观看，遇有这种情形，可用二甲苯浸泡掉盖玻后从头封固。

六、酶消化液

1．0.1%胰蛋白酶

0.1%氯化钙（pH7.8） 100ml

配制方式：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白

酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热

至一样样温度）。该消化液时刻约为5～30min。

2．0.4%胃蛋白酶

试剂：胃蛋白酶 400mg

0.1N HCl 100ml

配制方式：同胰蛋白酶。消化时刻在37℃约为30min。

3．0.06% Prona

0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml

配制方式：同前。

在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮

盖抗原，阻碍一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部份的作用。消化时

刻应依照不同组织而异，总之，在维持组织形态不被破坏的前提下，宜尽可能延长消化时刻。

以上三种酶消化液中，以第一种最为经常使用。

七、其它

1．蔗糖溶液 免疫细胞化学中应用的蔗精，经常使用浓度为5%～30%。一样光镜研

究，仅用20%蔗糖处置已足矣，假设制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、

15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处置，以确保其良好的细微结构。

（1）20%蔗糖液：

试剂：蔗糖 20g

0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml

配制方式：先以少量0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，

置4℃冰箱保留。

该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到

底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中留宿。都能达到要求。

（2）20%蔗糖-5%甘油：

试剂：蔗糖 20g

甘油 5ml

0.1mol/L PB 至100ml(约95ml)

配制方式：先用少量PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，

于4℃保留备用。

该液要紧用于电镜标本的处置，常浸泡留宿（其它浓度的蔗糖中常别离为2h左右）。

蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数

量和大小，应用较