基于单颗粒气溶胶质谱的人体呼出颗粒物粒径分布与化学成分的分析方法

基于单颗粒气溶胶质谱的人体呼出颗粒物粒径分布与化学成分

的分析方法研究

金丹丹;Anthony ;陈文年;刘荔;周振;李雪

【摘 要】人体呼出气中内源性颗粒物和外源性颗粒物的粒径和化学成分信息可为

肺部疾病诊断、环境暴露评价等研究提供参考.该文初步考察了单颗粒气溶胶质谱

(Single particle aerosol mass spectrometry,SPAMS)同时获取人体呼出气中颗

粒物(Exhaled breath particles,EBPs)粒径分布和化学成分的可行性.结果表明,健

康成人的EBPs数浓度为227～1 043个/L,获取具有统计意义的粒径分布所需的

EBPs检出限为2 500个颗粒物,粒径范围为200～1 000 nm,峰值出现在460 nm.

与环境空气颗粒物的粒径分布相比,EBPs更多分布在200～300nm和440～660

nm,从化学成分来看,这两段粒径范围内的EBPs含有更多的碳元素,不易在体内发

生吸湿增长,提高了被呼出的概率.EBPs的化学成分可能反映内源性颗粒物和外源性

颗粒物组成,如HSO4-、PO3-、CN-、CNO-和CxHyOz+(x=1 ～3,y=1～

7,z=1～3)可能与内源性颗粒物中的蛋白含量、磷酸酯酰甘油等成分有关,碳簇峰

C3-、C4-、C+、C3+、C3H+和C4+推测与外源性颗粒物中的碳元素有关.

【期刊名称】《分析测试学报》

【年(卷),期】2018(037)008

【总页数】7页(P906-912)

【关键词】人体呼出气;气溶胶颗粒物;单颗粒气溶胶质谱;粒径分布;化学成分

【作 者】金丹丹;Anthony ;陈文年;刘荔;周振;李雪

【作者单位】暨南大学大气环境安全与污染控制研究所,广东广州510632;暨南大

学广东省大气污染在线源解析系统工程技术研究中心,广东广州510632;美国加州

大学戴维斯分校空气质量研究中心,美国加州95616;香港中文大学,香港999077;丹

麦奥尔堡大学土木工程系,丹麦奥尔堡9210;暨南大学大气环境安全与污染控制研

究所,广东广州510632;暨南大学广东省大气污染在线源解析系统工程技术研究中

心,广东广州510632;暨南大学大气环境安全与污染控制研究所,广东广州510632;

暨南大学广东省大气污染在线源解析系统工程技术研究中心,广东广州510632

【正文语种】中 文

【中图分类】O657.63;R714.253

人体呼出气中除含有已被广泛研究的挥发性有机物外，还含有一定数目的气溶胶颗

粒物(0.001～4.644 个/mL)，其来源主要是呼吸过程产生的内源性颗粒物和人体

吸入的外源性颗粒物[1-3]。人体呼出气中的内源性气溶胶颗粒物可能由呼吸道气

道壁的内衬液(Respiratory tract lining fluids，RTLFs)在气道闭合、张开的过程

中产生，其粒径范围主要为亚微米级[3]。内源性颗粒物的化学成分包括含氮的活

性物质(硝酸盐、亚硝酸盐、3-硝基酪氨酸、亚硝基硫醇)、花生四烯酸、蛋白质、

代谢物等[4]。人体呼出气中的外源性颗粒物与人体所处的暴露环境有关，如铅加

工行业工人的呼出颗粒物中检出了钾、铅、锰、铜、锑、镉元素[5-8]。人体呼出

气颗粒物(Exhaled breath particles，EBPs)的粒径和化学成分信息可用于疾病诊

断[4，9]、环境暴露评价[5]等研究。

目前，检测EBPs粒径的方法主要采用差分电迁移率分析仪(Differential mobility

analyzer，DMA)和扫描电迁移率粒径谱仪(Scanning mobility particle sizer，

SMPS)[10-11]。EBPs的化学成分则主要通过检测呼出气冷凝液(Exhaled breath

condensate，EBC)的化学成分间接获得。呼出气EBC化学成分的分析方法包括

电感耦合等离子体光谱、液相色谱、液相色谱-质谱、全反射X射线荧光分析等[4，

10，12-13]。但EBPs的化学成分在冷凝过程中可能发生变化；冷凝时会富集呼

气中的水，导致样品稀释(EBC含水量约99.9%)，降低了待测物浓度，提高了对方

法灵敏度的要求。

尽管单个颗粒物的质量仅为几十fg,远低于现有仪器的检测限，但单个颗粒物中包

含了数百万个分子，因此，可以实现单个颗粒物的化学成分分析[14]。单颗粒气溶

胶质谱是一种基于质谱技术、可同时检测单个颗粒物的粒径和化学成分的实时质谱

分析技术，一般由进样系统、测径系统、电离系统和质量分析系统4部分组成。

目前基于SPMS技术的商品仪器有气溶胶飞行时间质谱仪(Aerosol time of flight

mass spectrometer，ATOFMS)(测径范围100～3 000 nm)[13，15- 16]和单颗

粒气溶胶质谱仪(Single particle aerosol mass spectrometer，SPAMS)(测径范

围200～2 000 nm)[17-20]，主要用于大气PM2.5来源解析、大气化学过程(如

二次有机气溶胶形成过程和机制、大气气溶胶混合状态)等研究，而在人体EBPs

粒径和化学成分研究中的应用尚未见报道。

综上所述，本文初步考察了SPAMS检测人体EBPs粒径分布和化学成分的可行性，

尝试解析呼出颗粒物的粒径分布和化学成分中的信息。

1 实验部分

1.1 人体呼气样品采集

采样点在暨南大学大气环境安全超级站(简称“大气超级站”)楼顶的露天平台。大

气超级站位于广州市天河区暨南大学图书馆顶层，北纬23.13°，东经113.35°，

距地面约40 m。东距华南快速路约350 m，南距黄埔大道(城市主干道)约400 m，

西向500 m左右是高约60～80 m的居民住宅楼群，北向750 m为中山大道(城

市主干道)。点位周边无工业污染源。

如图1所示，1位29岁的健康女性站立在露天平台上，采用鼻吸、嘴呼的方式，

呼吸数次后，将呼出气收集在3-L Tedlar气袋内。吸入气未经颗粒物过滤处理，

所以含有大气颗粒物。采样过程中，用铝箔包裹气袋并加热，加热温度为

40 ℃(图1)，以避免呼出气中的水汽凝结在气袋内壁。共采集6袋呼出气样品，

集满1袋气约需40 s。在使用前，Tedlar气袋用氮气(纯度≥99.999%)反复清洗。

Tedlar气袋上装有双阀，在清洗气袋过程中，一个阀接氮气，氮气以一定流速充

入气袋，另一个阀排出清洗气，气袋内的气体体积保持在2 L左右，一般清洗5

min。将清洗后的气袋内充满N2，用SPAMS分析，若10 min内检测到的累计

颗粒个数<3个，则认为气袋清洗干净，否则重复上述清洗过程。

图1 基于SPAMS的人体EBPs分析装置Fig.1 Schematic of detection of EBPs

by using SPAMS

1.2 样品分析

样品采集后立即进行分析。采用Nafion管(MD-700-06F-1，美国博纯有限责任

公司)连接气袋出气口和SPAMS进样口，进样流速100 mL/min(图1)。Nafion

管的作用是降低呼气湿度，减小样品中水汽对SPAMS电离效率的影响。Nafion

管的反吹气是由气瓶提供的干燥空气，流速200 mL/min。样品分析过程中，保

持气袋处于40 ℃恒温状态。样品进入仪器前的相对湿度和温度分别为38%～60%

和27 ℃。环境空气样品直接进样分析。一般先测环境空气样品，然后采集人体呼

出气样品进行SPAMS分析。呼气样品用气袋采集而未直接分析是由于SPAMS的

进样流速为100 mL/min，低于人体呼出气流速(健康成人1 min内呼出气体体积

为1 000～1 500 mL)，若直接采集，样品利用效率低，志愿者需在仪器前连续呼

气15～20 min才能获得足够的颗粒数进行数据分析。

SPAMS(型号0515，广州禾信仪器股份有限公司)检测EBPs的过程为[21-22]：

EBPs通过进样小孔(0.1 mm)从大气压环境进入仪器内的真空环境，在空气动力学

透镜的作用下聚焦成颗粒束，经过两束相距一定距离的测径激光(532 nm)，EBPs

在这两束激光之间的渡越时间，一方面用于计算颗粒的空气动力学直径，另一方面

用于触发下一阶段的电离激光(266 nm)；EBPs在电离区中心时，被电离激光电离

为带正电荷和负电荷的碎片离子，这些碎片离子由双极飞行时间质量分析器分别检

测(图1)。SPAMS的最大检测速度为20 个/s，测径范围为200～2 000 nm，电

离效率(电离颗粒数/测径颗粒数)为20%～30%，质量数扫描范围为m/z 1～250，

质量分辨率为500 FWHM(Full width at half maximum，半峰宽)。

采用与仪器配套的数据分析软件SPAMS_ANALYZE_V1.8.4.1对数据进行分析。

根据测径激光测定的飞行时间，通过软件计算获得颗粒的空气动力学直径[21-22]；

根据质谱检测到的碎片离子的质荷比，通过软件计算得到各离子的元素组成，并与

文献报道的碎片离子进行比对，确认碎片离子的元素组成[10，23-24]。

1.3 SPAMS校准

SPAMS的校准分为粒径校准和质量数校准两部分，分别用以保证检测颗粒物粒径

和质量数的准确性，具体操作流程参照仪器使用手册。

粒径校准：通过气溶胶发生器产生标准粒径(200、300、500、720、1 000、1

300、2 000 nm)的聚苯乙烯小球(PSLs)校正粒径检测系统，校准系数R2>0.99。

质量数校准：使用10 mg/mL的NaI标准物质气溶胶校准飞行时间质量分析器。

2 结果与讨论

2.1 EBPs粒径分布初步研究

6袋样品测得的测径颗粒数、电离颗粒数、电离效率、实测体积和颗粒浓度如表1

所示。平均电离效率为19.3%，属仪器正常水平。实测体积为2.03～2.39 L，小

于采样体积(约3 L)，目的在于避免当气袋中气体含量较少，从气袋抽气时混入室

内空气颗粒物，造成干扰。6袋呼出气样品中EBPs数浓度为227～1 043个/L。

Almstand 等[10]用颗粒计数装置检测到的人体呼出内源性颗粒数浓度为200～2

000个/L(0.3～0.5 μm)。考虑到本研究检测到的EBPs数浓度包含内源和外源两

类颗粒物，因此需进一步分析EBPs中内源性和外源性颗粒物的分布情况，以评估

方法的检测效率。

表1 EBPs的测径颗粒数、电离颗粒数、电离效率、实测体积和颗粒浓度 Table 1

Number of particles with diameter measured，number of particles ionized，

ionization efficiency and particle concentration of exhaled particlesSample

ng /NoIonizationIonization efficiency(%)Sample volume(L)CN-

EBPs(Particles/L)CE-EBPs(Particles/L)S-11 212/199162.175582 240S-21

036/204202.035101 648S-3477/129272.102271 583S-41

440/295202.396021 598S-51 633/245152.297133 847S-62 307/424182.211

0432 314

*NoSizing：number of particles with measured size；NoIonization：

number of ionized the particles，mass spectra were

obtained under both positive and negative ion detection modes；

ionization efficiency：ratio between NoIonization and NoSizing；sampling

volume is calculated by timing sample flow rate(100 mL/min) with

sampling time；CN-EBPs：number concentration of EBPs；CE-EBPs：

number concentration of particles in ambient air

逐袋累加颗粒数(表1)，分析粒径分布随总颗粒数的变化，判断获得稳定粒径分布

的最少颗粒数，即检出限(Limit of detection，LOD)。在总颗粒数分别为1 212、

2 248(通过累加S-1和S-2中测得的颗粒数获得)、2 725(累加S-1、S-2和S-3

测得的颗粒数)、4 165(累加S-1、S-2、S-3和S-4测得的颗粒数)、5 798(累加

S-1、S-2、S-3、S-4和S-5测得的颗粒数)和8 105(累加S-1、S-2、S-3、S-4、

S-5和S-6测得的颗粒数)的情况下，粒径分布特征几乎一致(如图2A)，即EBPs

主要分布在200～1 000 nm、峰值出现在460 nm；各粒径段相对颗粒数

(Relative particle number，RPN)相关性分析的判定系数R2表明，当总颗粒数

为2 725～8 105时，4个R2值为0.993 7～0.998 3,且无显著差异(如图2B)，表

明当总颗粒数为2 725时，EBPs的粒径分布特征趋于稳定，因此确定获得具统计

意义的粒径分布所需的LOD为2 500个颗粒物，应采集至少10 L呼气样品。

RPN是通过比较SPAMS各粒径分析通道测得的颗粒数与整个粒径范围(200～2

000 nm)获得的总颗粒数计算获得。

图2 不同总颗粒数情况下，各粒径段相对颗粒数(RPN)的粒径分布特征(A)及RPN

相关性分析(B)Fig.2 Size distributions(A) and relationships between RPNs(B)

on the conditions of different numbers of particles(P)

当呼出气和环境空气样品中总颗粒数分别为8 105(数浓度227～1 043 个/L)和7

516(数浓度1 583～3 847 个/L)(表1)时，EBPs和环境空气颗粒物RPN相关性分

析的R2为0.980 5(图3A)，小于EBPs稳定粒径分布间相关性分析的R2(图2，

0.993 7～0.998 3)，表明EBPs和环境空气中颗粒物的粒径分布存在差异。通过

观察呼出气和环境空气样品中颗粒物的粒径分布，发现在200～300 nm和440～

660 nm范围内EBPs的RPN略高于环境空气颗粒物；而在320～420 nm和

680～2 000 nm范围内，EBPs的RPN略低于或等于环境空气颗粒物。环境空气

颗粒物主要分布在200～1 000 nm(图3B)，而内源性颗粒物的粒径范围主要涵盖

50～ 3 000 nm[3]。因此本实验在200～2 000 nm范围内测得的EBPs粒径分布，

应该是内源性和外源性颗粒物粒径分布的混合结果，而呼出气与环境空气粒径分布

的差异，既有内源性颗粒物的贡献，也有外源性颗粒物在吸入人体后经过体内沉积、

吸湿增长等过程，影响了颗粒物再次被呼出时粒径分布的原因。

图3 呼出气与环境空气样品中颗粒物RPN的相关性分析(A)与颗粒物的粒径分布

(B)Fig.3 Relationship between RPNs(A) and size distribution profiles(B) of

exhaled breath and ambient air particlesthe particle numbers were 8 105

and 7 516，respectively

2.2 EBPs化学成分初步研究

基于呼出气和环境空气粒径分布存在的差异，对200～300、320～420、440～

660、680～2 000 nm 4段粒径分布对应的化学成分进行分析。对于4段粒径范

围的颗粒物，EBPs中含有的和的丰度均低于环境空气颗粒物(图4)。在200～300

nm和440～660 nm范围内，即EBPs的RPN略高于环境空气颗粒物时，EBPs

中含有更高丰度的图4A和C)，推测与内源性颗粒物有关；本课题组近期采用二

次电喷雾电离质谱实时分析人体呼出气时也检出并根据信号的时间曲线图，判断来

自内源性颗粒物[25]，与本研究结果一致。

在低粒径段200～300 nm，EBPs中检出多个碳簇离子，如图4A)，均显现出更高

的丰度。这些碳簇离子与颗粒物中碳元素含量相关，而含碳元素的颗粒物应来源于

外源颗粒物。这些碳簇离子在200～300 nm范围内的EBPs中有较高丰度，可能

是由于含碳元素的颗粒物相对于含水溶性离子的颗粒物，不易发生吸湿增长，提高

了被呼出的概率。在320～420 nm和440～660 nm范围，EBPs的化学成分与

环境空气颗粒物的化学成分相近，表明这两段粒径范围的EBPs主要来自吸入的环

境空气颗粒物(图4B和图4C)。在高粒径段680～2 000 nm，尽管EBPs的RPN

与环境颗粒物几乎一致，但二者质谱图中存在差异的m/z最多，如在正、负离子

质谱图中可分别观察到和图4D)，其中CxHyOz+(x=1～3，y=1～7，z=1～3)和

可能来自RTLFs中的磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)。此外，

Almstrand等[10]通过TOF-SIMS检测到内源性颗粒物中的和CNO-，并将其用

于识别哮喘和肺结核患者，其中被认为反映了EBPs中总磷酸酯的含量，而CN-和

CNO-的总和与蛋白总量有关。因此，本实验中检测到的和CNO-可能用于上述肺

部疾病诊断。

图4 正(Pos.)、负离子(Neg.)检测模式下呼出与吸入空气颗粒物的平均质谱图

Fig.4 Average mass spectra of particles under positive(Pos.) and

negative(Neg.) ion detection modes

3 结 论

本研究结果表明，人体呼出气样品经除湿处理后，可采用SPAMS分析，并能同时

获取EBPs的粒径分布和化学成分。通过比较不同颗粒数下粒径分布的稳定性，可

确定获取具统计意义粒径分布的LOD为2 500个EBPs。通过比较200～300 、

320～420 、440～660 、680～2 000 nm 4个粒径段的质谱图，发现EBPs的粒

径分布和化学成分是内源性颗粒物和外源性颗粒物的混合结果。在EBPs低粒径段

200～300 nm观察到的多个较高丰度的碳簇离子，或可为环境暴露研究，如外源

性颗粒物体内吸湿增长研究提供思路；而在680～2 000 nm范围内检测到的和

CNO-，则可能为肺部疾病诊断提供信息。后续工作将进一步提高方法性能，同时

增加样本种类(如PM2.5污染天气的人群样品、呼吸道疾病患者样品)和样品数量，

以更好地理解人体EBPs中内源性颗粒物和外源性颗粒物的存在特征，同时建立人

体EBPs数据库，推进基于SPAMS方法的EBPs粒径分布和化学成分在疾病诊断

和环境暴露中的转化应用。

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