慢性阻塞性肺疾病患者IL

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

997

慢性阻塞性肺疾病患者

IL-6

%IL-8

、

TNF

乙水平

与支气管黏膜自噬的相关性分析

王萌萌心

於海洋

1

2

孙雨晴

1

程朋朋

13

汪倩

1

管雯斌

韩锋锋

1

【

摘要

】

目的

研究慢阻肺患者炎症因子与支气管黏膜组织自噬作用之间的相关性

。

方法

选取上海

交

通大学医学院附属新华医院呼吸科

20

例慢阻肺患者(轻度

和

10

例健康者

，

分为中度

3

组组组

:

A

组

+

)

、

B

(极重度)采集血

重度支气管黏

+

组

和对照组

。

、膜组织

肺泡灌洗液

(

BALF

)

、

°

检测血清

、

BALF

中炎症因子

水平组组

及支气管血清

黏膜作用

织自TNF-

噬比

。

结果

(

1A

)

与对照及在

相

，

ILF统计学意义

、

IL-8

f

组无

，

B B

组明显增高

"

IL-6P <

II-8

<0.05

,

、

TNF-

f

P

<0.01

)

oBALF

中

高(),

A

组和

组

ILF0.

水平均明显升

P 05B

组

IF

及比,

TNF-

f

水平明

显增高,

()与

TNF-

f

P

<05

0.

<0.001

九-(中的

戸

)

；

2

对照组

相

A

组组

、

B

Atg5

mR-

NA 01

及

Beclin1

的蛋白表达在均显著低于对照组

"),

P

L

<0.C3B

的蛋白表达均显著降低

(

A

组

P B

<

0. 05

,

组的(膜

K0.01

),及蛋白表达均显著增加()

而、中

P62

mRNABALF

P<0.

3

01

)

；血清

儿-

水平与支气管黏

自噬作用呈负,

相关

"自噬作用在

r<0

P<0.01

)

。

结论

九-

、、。

！

-

］

"

!-

在慢阻肺的进展过程中明显

升高

慢阻肺的进展过程中明显降低

。

IF

水平的升高可能与慢阻肺患者自

噬

受损有关

。

【

关键词

】

慢性阻塞性肺疾病

;ILF

；

ILF

；

TNFF

；

自噬

Correlation

analysis

ofILandchronic

TNF

IL-6

,

乙

乙

withautophagywith

of

bronchial

mucosa

*

paheeSe

obstnichvepulmonary

dia

WANGWANG

11GUAN

Meng-fegVHai-yangQian

,,,,,,

YUCHENGPeng-yeng

SUNWee-fn

Yu-ying

11

HAN

Fengfeeng

1

1. 3.Shanghai

DepaCmeni

o

Respiratory

MedicineDepaiment

；

o

PatOoloo?Hospital Jiaotong

Xinhua

m

AffiOame

Unuersito

School

DepaCment

o

MedicineChina

,

ShanghaiRespiratory

200092XuhutHospital

,

；

2.

o

MePicin£,

Zhoogshan

Hospital200031

mChina

Affiliated

Fudan,Shanghai

University

,

(

Abstract)

Objective

Toexplorethe

factors and of

correlationautophagy

between

inflammatorybronchial

mucosain

of

patients

with

chronicCOPD)

obstructivehealthy

pulmonary Itlectedcas

dia"10

.

Methods

subjectsandCOPD

20

patientswith

aeom

theDepaetmentoaRespieatoeyMedicineoaXinhuaHospitaeAaieiated

to

ShanghaiJiaotongUnieeesitySchooeoaMedicineGOLD1

thegeoup

and

theyweeedieided

intotheconteoegeoup

$

A

(

+GOLD2+GOLD4beonchoaeeeoeae

)(

$

$

)

andthegeoup

B

GOLD3

eeum

eaeageaeuid

and

eesoainaeammatoeyaactoesweeedetected

in

eum

and

BALF.

expressions of genes (

Theand

autophagyproteins

related

were

detectedinbronchial

mucosa.

ResuUs

1

)

Comparedin

significance

with in

groupof showe statistical

thethe

control,not

the

levels

ILF,ILFrum

and

TNF-

f

grouphigher05ILF/TNFBALF

-

A01

,

butin<

the-

were

0.<0.

significantly

B

thegroup

()

ILF

P P In

:

；

(

：

.

,

the

levelinin

of

ILFand of

<0.IL-8

thethe

groupssignificantg

A

B

increadandand

()

P05the

,

levels

TNF-

f

groupP< Compared

IL-80.001with

B

increadP<0.

significangy.

()(

,

TNF-

f

：

05

2

；

:

the

)

controlthe

group

etpeesion

oaAtg5

mRNAandpeotein

Becein1

in

thegeoupsAand

Bwassigniaicanteyeoweethantheconteoe

thatin

geoupand

()(

PP

<0.05 A

<0.01 thepeotein

$

etpeesionoaLC3

Bwassigniaicanteyeeduced<0.01

P

inthegeoup

$

doi3969/j.

:

10.issn.

-

1009

6663.2021.07.007

基金项目

：

上海市自然科学基金资助项目

(14ZR1426800

No.

)

作者单位

：

1.

200092

上海,上海

交

通大学医学院附属新华医院呼吸科

2.

200031

上海

，

复旦大学附属中山医院徐汇医院呼吸科

3.

200092

上海,上海交通大学医学院附属新华医院病理科

通信作者

:

韩锋锋

,

E-mail

:

hanfengfeng@

xinhuamed.

com.

cn

998

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

in

theB)

yrouplevei

,P62

while1<0.

the

mRNAandprotein

expressionincread

of 01)

sivnificantla(3)

(

.

The

of

correlatedautophayy

IT-8 with <

inand

rum 10.

wereneaativela (r<0,

BALF

bronchiaimucosai

01)

.

Conclu

­

sion

IL-6,duriny

IT-8COPD.

,sivnificantlasivnificantla

andof­

TNF-

v

increathere

provressionis

Autophagy

duced COPD.ILV maybe

durinyprovressiontoin

theincrea

ofofautophayy

The

relatedthe

levei

COPD

irnpaired

patients.

(

Key

words

]

COPD

；；；

TVTV

TNF-c

；

autophayy

慢性阻塞性肺疾病

（

Chronic

ObstructivePulmv-

narg

DiesasCOPD

,

，

简称慢阻肺

）

是一种常见的慢

间质性肺疾病

，

肺栓塞

,

慢性血栓栓塞性肺动脉高

压,严重肝

、

肾功能不全

，

严重心血管疾病

，

神经肌肉

性呼吸系统疾病

，

全球

40

岁以上发病率髙达

9%

+

疾病

，

脑梗死或脑出血后遗症,有支气管镜检查禁忌

10%

［

1

］

o

慢阻肺因其高发病率

、

高致死率和高经济

负担的特点

，

现已成为严重的世界性公共卫生问

题探究慢阻肺的发病机制

，

对研发其药物靶向

治疗具有重要意义

。

研究表明慢阻肺是一种全身炎

症反应综合征

,

特别是急性加重期

,

包括

CRP

、

ILV

、（

ILV

、

IL-10

、

TNF-

v

在内的炎性介质均会升高⑶

o

同

时也有研究表明自噬与慢阻肺的发生发展有着密切

关系

，

我们的前期研究已发现慢阻肺患者肺组织自

噬水平在轻

、

中度组增强

，

重度组减弱⑷

。

本文通

过检测慢阻肺患者血清和

BALF

中炎症因子及支气

管黏膜组织中自噬相关基因及蛋白的表达水平

，

分

析其二者在慢阻肺疾病进展中的作用

。

资料与方法

一

、

实验对象及分组

研究对象选自

2016

年

6

月

1

日至

2019

年

10

月

1

日期间收治于上海交通大学医学院附属新华医

院呼吸科的慢阻肺稳定期患者以及同期健康体检

者

。

本研究经过上海交通大学附属新华医院伦理委

员会批准,并通过受试对象的知情同意

。

实验对象

分为和

3

组:慢阻肺患者分为

A

B

组

,（

A

组

轻度

+

中度组

）

5

=12

）

、

B

组

（（

重度

+

极重度组

）

（

=8

）

,

以及对照组

（

（

=10

）

,

组间患者的性别比例和病情

严重程度等一般资料比较差异均无统计学意义

（

1

>0.05

）

。

其中

，

慢阻肺组诊断标准按照

2017

年慢

性阻塞性肺疾病国际诊治指南

［

5

］

，

依照肺功能检查

评估气流受限严重程度

，

慢阻肺患者肺功能

FEV/

FVC

均

<70%80%

，

轻度

FEV

1

"

预计值

，

中度

50%

!!

FEVFEV

1

<80%

预计值

,

重度

30%

1

<50%

预

计值,极重度预计值

FEV

1

<30%

，

将慢阻肺患者分

为轻度

、（

中度

、

重度

、

极重度

（

其中轻度

=6

、

中度

（

=6

、

重度

（（

=7

，

极重度

=1

）

。

排除已明确诊断以

下疾病及禁忌症的患者:支气管炎

,PCR

活动性肺结核

,

症

。

二

、

实验材料

TNF-a

、

IL-6

、

IL-8

试剂盒购

自

Elabscienca

公

司

。

Atg5

、

P62

引物合成

（

上海生物工程有限公司

）

、

逆转录试剂盒

［

TakaRa

］。

微管相关蛋白

1

轻链

3

microtubuia

associa-ted

protein

1

lighi

chainVB

,

LC3B

）

抗体

、

P62

抗体购自

Abeam

,

Beclin1

抗体购自

CST

。、

GAPDH

抗体

辣根过氧化物酶山羊抗兔

（

二

抗

）

、

辣根过氧化物酶山羊抗小鼠

（

二抗

）

购自碧云

。

三

、

试验方法

1

肺功能检测采用意大利科时迈肺功能仪

（

COSMED

公司产

）

测定

3

组受试者的第一秒用力呼

气量占预计值百分比

（

FEV/

预计值

％

）

、

肺活量占预

计值百分比

（、

FVC/

预计值

％

））

FEV

1/

FVC

（

%

。

2

酶联免疫吸附法

ELISA

检测血清

、

肺泡灌

洗液中炎症因子

IL-6IL-8

、

、

TNF-

v

于清晨空腹抽

肘正中静脉血

（

5

mL

下

,

OLYMPUS

公司产

）,

支气管电子内镜系统

灌洗液

52

mL

BF290

无菌纱布过滤待离心

，

外周血及肺泡灌洗液均

3

800

r/min

转速离心

15

min

,

取上清置于

-80

V

冰箱保

存待测

。

采用酶联免疫吸附法

（

ELISA

）

测定血清及

肺泡灌洗液

IL-6

、、

ILV

TNF-

清

,

所有操作严格按试

剂盒

。

3

免疫组织化学染色支气管镜下收集患者

支气管黏膜组织约免疫组织化

15

my

,

操作按

SABC

学试剂盒说明进行

。抗

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

999

中

Atg5

、

P62

的

mRNA

表达

支气管镜下收集患者

支气管黏膜组织约

15

mg

与

1TGzol

mL

相混合后放

BCA

浓度测定试剂盒检测

浓度

。

12%80120

SDS-PAGE

凝胶

V

电泳

min

,

转移至

入组织匀

中充分研磨

,,

RNA

分离提取后

反向

PVDF

膜

,

5%

脱脂奶粉封闭

2

h

,

一抗

（

11

:

000

稀

转录成

cDNA

,

采用

SYBR4

Green

以

cDNA30

为模板进

实时荧光

PCR

反应

;

反应参数

：

95

V1

30

s

个循

释

）,（

孵

一抗

V

过夜

。

Image

LabTM

min

二抗

1

:

1

000

稀释

）

孵

40

ml

,

光剂

像

。

用

环

,

9534s95

VVV

5

s,60

4015

个循环

,

s,60

V

目的基因的计算公式为

2

-

）

）

Ct

。

以

GAPDH

为内参照

，

人

GAPDH

上游引物

60ss

,

15

1

个循环

,

灰度值分析

。

、

采用

SPSS

22.0

采用均数

±

,

CAGGAGGCATTGCTGATGA

,下游弓

|

物

GAAGGCT-

GGGGCTCATTT

,

Ag5

游引

物

TGGACAGTTG-

CACACACTAGGATCAGATGTTCACT-

,

下

游

引

物

（

J±s

）

，

多组

用单因素方差分析

,

SpeaGnanl

相关分析非正态

分布定

的相关性

，

应用

GraphPad

PGsm5

统

CAGCCACTG

;

P62

游

引

物

TGGCCATGTC-

制为

，。

P<0.05

结果

CTACGTGAAG

,

下游

AGCCATCGCAGATCACATTG

。

5

Western

blot

测定支气管黏膜自噬相关蛋白

Atg5

、

Becen1

、

LC3B

的表达支气管镜下收集患者

—

、

实验

的一般性描述

A

组

、

B

组

支气管黏膜组织约

15y

mg

与

300

&

液

（

RI-

照组性别比例和病情严重程度

（

P

>

PAPMSF

裂解液

：

=

100

:

1

）

混合后加入匀浆器中

，

等一般

相比

，

性别

无

充分研磨,转移入

1.5mLEP

管超声粉碎

，

冰解

30000

min

,

以

14

r/min

离心

20

min

后取上清

，

用

0.

05FEV/

）

,

A

组

、

B

组

预计值

％

低于对照组

（

P<0.

001

）

（

见表

1

）!

表

1

实验对象临床资料的一般性描述

目

照组

度

+

中度组

8:4

重度

+

重度组

F

P

性别

（女

男

：

）

年龄

（

岁

）

FEV62.4641.08

1

L78.861<0.001

%

4

:

65:3

1.731

*

12.320

0.421

<0.01

61.3±4.45±8.99±6.20

93.02±11.07

66.6077.00

±9.58 ±5.99

备注

：

为

x

2

值

*

二

、

人血清和肺泡灌洗液上清中

IL-6

、

IL-8

及

TNF-的

的表达

有统计学意义

（）

P

<0.

05

,

B

组中

IL-6

、

IL-8

及

TNF-

（

高

，

（

IL-6

P<0.05

,

照组相比,血清炎

A

组

IL-8

的的

P<0.

001

^

TNF--

P<0.05

））

（

见图

1

、。

2

意义

，

B

组中

IL-6

、

IL-8

及

TNF-

（

0.01

）

。

灌洗液

A

组

IL-6

高

，

有

、

支气管黏

膜组织

免疫组化

LC3B

照组相比,

A

组

、

B

组患者支气管黏

膜

组织

（

IL-6

的

P

<

1000

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

一

(

_

E

/

6

d

)

9

JI

图

2

肺泡灌洗液上清炎症因子TNF

IL乙及

乙 05

、

IL"K0.

乙的表达*

（，

与对照组比较001

P<0.

,

）

四

、

自

噬

相关基因

Atg5

、（

P62P62

的

mRNA

表达

Real-time

PCRB

对照组

其中

A

组

、

B

组

P

<0.001

）

,

在

A

组显著高于对照组

、

B

组

mRNA

（、

其中

A

组

、

组

P

<0.001

））

（

见图

4

。

分析

Atg5

在

A

组

B

组

mRNA

显著低于

图

3

支气管黏膜组织t200

LC3B

蛋白免疫组织化学

（

HE

）

a.c.

对照组极重度组

;b.

轻度中度组重度

+

;

+

i

-

i

3

集

Atg5

图Atg5

4

支气管黏膜组织、P62

的

mRNA

基因表达

与对照组比较

，

$

$$

P<0.001

P62

五

、

自噬相关蛋白

Beclin1%P62

%

MAP-CC3

*

/

I

B

组

P<

0.001

）

o

P62

在

A

组

、

B

组蛋白表达显著

的蛋白

Western

blot

分析结果显示

，

Beclin1

在

A

组

、

B

高于对照组

（

其中

A

组

P<0.

001

,

B

组

P

<0.001

）

。

LC3B

在组蛋白表达显著低于对照组

A

组、

B

（

其中

A

组

P<0.

01

,。

B

组见图

P

<0.001

））

（

5

组蛋白表达显著低于对照组

（

其中

A

组

P

<0.001

,

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

1001

正常组

中度组 极重度组

Beclinl

轻度重度

+

+

P62

GAPDH

BeclinlLC3B

P62

图的蛋白表达

5

支气管黏膜组织

BecIin1

、P62LC3B

、

与对照组比较

，

**

P<0.P<0.

01001

,

***

六

、

炎

水平与自噬作用的相关性分析

重程度的

，

常对照组对比

随

着

0.IL-8

001

,

P<0.

01

),

-

讨

论

慢阻肺患者炎症的发生及发展与多种炎症细胞

-C3B

蛋白表达量与血清

IL-8

水平呈负相关

(

r=

-

灌洗液

水平呈负相关

、

肺泡

灌洗液

IL-6

、

活化及炎

和介质的释放有关

，

气和

，

对

(

r

=

0.022

,

P

<0.01

),

TNF-

水平无相关性

(

见

2

%

3

)

o

表TNF-

2、、

血清炎症因子IL-6

IL-8

症

毒

及气体的炎症反应增强是慢

最主要的

机制

[

5

]

!

慢 、

的慢性炎症主

及气道

肺

实质和

细

管淋

，

其中中性粒细胞

、巴

细胞以及巨噬

慢性炎症的发生和

，

这些细胞激活后

与蛋白表达量的相关性分析

LC3B

数95%

II-6

TNF-(

r

P

可信区间

释放包括

IL-6

、

IL-8

、

TNF-

在内的多种炎症介

[

6

]

o

IL-6

是一种

多种生物活性的趋化

，

0.002)

0.030-0.007

0.767-0.010

(

〜

0.013

(

〜

0.068

)

(

-0.002

〜

0.000-0.001

)

0.103

0.007

激活和调节免疫细

过

、

生理特性

，

可以通

IL-8

B

细胞的成熟

，、

分泌

IgG

IgE

IgA

等细胞因

子

，

从而

诱

导炎症反应

表

3

肺泡灌洗液炎症因子

ILQ

、、

ILQ

TNF

症

与

LC3B白表量的关性分析

多种

的发生

过

程

。

慢

患者灌洗

IL-6

和

液中巨噬细胞

、

中性粒细胞水平显著升高

[

7

]

o

IL-8

数

LL-6BALF

LL-8BALF

r

P

95%

信区

0.0860.377

TNF-(BALF

0.497

0.119-0.144

(

-0.115

〜

0.287

)

(

〜

1.137

)

( )

-0.036-0.022

〜

-0.009

是一种多细胞源性的炎

中性粒细 ，

症反应

IL-8

Ca

+

浓度升高脱

，

多种生物效能

，

后

生形态变化

胞内

0.003

，

外周组胺释放

引发炎

节疾病的关

改变

，

IL-8

对

淋

巴

细胞

、

嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细

1002

临床肺科杂志

2021

年

7

月

第

26

卷第

7

期

重程度密切相关,

作用

,

在慢阻肺疾病病理中

IL-8

可诱导气道炎症反

慢

的

过

应和气道重塑

TNF

清

可以激活中性粒细胞和

巨噬细胞

，

以增加其细胞毒性作用

，

释放更多

IL-6

%

ILV

等细胞炎性因子

，

进而加快炎症反应进

程

，

并且

IL-6

、

ILV

、

TNF

清

水平升高表明炎症反应

增强

，

可能对慢阻肺患者的生存质量造成负面影响

和作用

。

因此

，

检测患者血清

、

肺泡灌洗液中

IL-6

、

IL-8

、

TNF

清水平对慢阻肺严重程度的临床诊疗

、

预

@

[

9

'

10

]

。

本研究结果显示慢阻肺患者血清

IL-6

、

IL-

8

、

TNF

清

水平高于对照组

，

提示在慢阻肺患者的肺

后评估都有一定的指导意义

。

此外

，

本研究结果发

随慢

着

患者

重程度不

重,

照

组织和气道中存在炎症反应和气道重塑

，

这为临床

预测慢阻肺患者疾病严重程度提供了理论依据

！

细胞自噬作为一种新的细胞程序性死亡方式

,

组相比

，

轻度

+

中度组

、

重度

+

极重度组慢阻肺患者

支气管黏膜

Beclin1

、

LC3B

*

的蛋白表达量在慢阻

度、

+

中度组

重度

+

重度组

是维持细胞内环境自稳的一种重要保护机制

，

是通

著低

过溶酶体介导的降解细胞内受损蛋白质或者细胞器

的

代谢

及更新过程

[

11_12

]

!

自噬参与慢阻肺疾病的

气道重塑

、

肺气肿和血管重塑等病理过程

,

随着疾病

的不断进展!

，

自噬保护作用逐渐减弱

[

13

]

气道重塑

是慢阻肺发展过程中的一个重要特征

，

病理表现为

纤毛减少

、

缺失和运动障碍

,

杯状细胞增多

，显著高于对照组

支气管

黏膜假复层纤毛柱状上皮鳞化

，

纤维结缔组织等增

生并伴炎性细胞浸润

；

随着疾病的进展

,

后期还可出

现细小支气管管壁胶原化

,

终末细支气管远端异常

扩张进而导致肺气肿

[