新型多肽、融合多肽和包含其的抗革兰氏阴性菌的抗生素的制作方法
1.在本说明书中，提供了一种新型多肽、包含该多肽的融合多肽及其作为抗生素的用途。更具体地说，一种衍生自噬菌体的新型多肽、包含该多肽和杀菌肽a的融合多肽，以及包含该多肽和/或融合蛋白的抗革兰氏阴性菌的抗生素。
背景技术：
2.噬菌体是指感染特定细菌并抑制和阻碍受感染细菌生长的细菌特异性病毒。噬菌体能够在感染宿主细菌后以细菌细胞内增殖的方式杀死细菌，并使用内溶素(当子代噬菌体在增殖后从细菌中出来时噬菌体的一种蛋白质)破坏宿主细菌的细胞壁。因此，具有噬菌体内溶素活性的物质可以有效地用作抗生素候选物。
3.最近，抗生素耐药细菌迅速增加，不能用任何抗生素的多药耐药细菌也在增加。特别是，革兰氏阴性菌之一，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是eskape(屎肠球菌(enterococcus faecium)、金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(enterobacter species))细菌中的一种，其在全球范围内迫切需要开发新的方法，而大肠杆菌(escherichia coli)也是一种参与各种感染的细菌。因此，需要开发一种不同于传统抗生素的方法。
技术实现要素：
4.技术问题
5.一个实例提供了一种新型多肽。该多肽可包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列。该多肽可衍生自噬菌体或其变体。该多肽可能具有内溶素活性。
6.另一实例提供了一种编码该多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含seq id no：2或seq id no：7的核酸序列。
7.另一实例提供了一种包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可用作表达载体。
8.另一实例提供了一种包含该多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞。该重组细胞可用于表达多核苷酸。
9.另一实例提供了一种噬菌体，其包含seq id no：1的多肽、编码该多肽的多核苷酸(例如，seq id no：2)或其组合。噬菌体的基因组可包含seq id no：5的核酸序列。
10.另一实例提供了一种新型融合多肽。该融合多肽可包含杀菌肽a和内溶素。例如，杀菌肽a可以由seq id no：8的氨基酸序列表示。内溶素可衍生自噬菌体或其变体，例如，其可由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列表示。在融合多肽中，杀菌肽a(例如，seq id no：8)和内溶素(例如，seq id no：1或seq id no：6)可以任何顺序通过接头连接或在没有接头的情况下直接连接。在一个实例中，融合多肽可由seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列表示。
11.另一实例提供了一种编码该融合多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含seq id no：
11或seq id no：14的核酸序列。
12.另一实例提供了一种包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可用作表达载体。
13.另一实例提供了一种包含该多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体的重组细胞。该重组细胞可用于表达多核苷酸。
14.另一实例，提供了一种抗生素，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：
15.(1)选自seq id no：1和seq id no：6中的一种或多种多肽，
16.(2)包含该多肽和杀菌肽a的融合多肽(例如，seq id no：10或seq id no：13)或其组合，
17.(3)编码(1)中的多肽的多核苷酸，
18.(4)编码(2)中的融合多肽的多核苷酸，
19.(5)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合的重组载体，
20.(6)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞，和
21.(7)包含seq id no：1的多肽、编码该多肽的多核苷酸或其组合的噬菌体。
22.该抗生素可能对革兰氏阴性菌有抗菌作用。
23.本说明书中提供的抗生素(第一种抗生素)具有通过抗菌作用本身表现出协同效应的优势，并且与另一种抗生素(第二种抗生素)结合使用时，作为低浓度的第二种抗生素具有优异的抗菌作用。因此，可以减少使用高浓度抗生素的副作用，例如毒性(例如肾毒性、肝毒性等)。此外，它可以通过不同机制的抗生素的组合来抑制耐药细菌的出现。
24.因此，一个实例提供了一种组合抗生素，包括：
25.(a)选自以下组成的组中的一种或多种：(1)选自seq id no：1和seq id no：6中的一种或多种多肽，(2)包含该多肽和杀菌肽a的融合多肽(例如，seq id no：10或seq id no：13)或其组合，(3)编码(1)中的多肽的多核苷酸，(4)编码(2)中的融合多肽的多核苷酸，(5)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合的重组载体，(6)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞，和(7)包含seq id no：1的多肽、编码该多肽的多核苷酸或其组合的噬菌体；和
26.(b)抗生素(例如，基于多粘菌素的抗生素，如多粘菌素b和/或粘菌素等)。
27.另一实例提供了一种用于预防和/或假单胞菌属(pseudomonas sp.)细菌感染或由假单胞菌属细菌引起的疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。另一实例提供了一种用于预防或假单胞菌属细菌感染或由假单胞菌属细菌引起的疾病的方法，包括向需要预防和/或假单胞菌属细菌感染或由假单胞菌属细菌引起的疾病的受试者给药药学上有效剂量的抗生素或组合抗生素。
28.另一实例提供了一种包含抗生素或组合抗生素作为活性成分的饲料添加剂。
29.另一实例提供了一种包含该抗生素或组合抗生素作为活性成分的消毒剂。
30.另一实例提供了一种消毒方法，包括将抗生素或组合抗生素应用于需要消毒的受试者。
31.另一实例提供了一种包含该抗生素或组合抗生素作为活性成分的洗涤剂。
32.另一实例提供了一种清洁方法，包括将抗生素或组合抗生素应用于需要清洁的受试者。
33.技术方案
34.当可以通过增殖作为宿主的细菌将用作天然抗生素的噬菌体穿透细菌并在内部完成增殖时，完成的噬菌体颗粒被释放到细菌外部，然后，攻击和分解细菌细胞壁并创建释放到外部的途径的酶是内溶素。所有噬菌体的基因组中都含有这种内溶素基因，并使用在增殖过程中表达的内溶素蛋白。作为宿主增殖细菌的噬菌体和从具有分解细胞壁特性的噬菌体衍生的内溶素可以用作天然抗生素。
35.对于革兰氏阳性菌，由于细胞壁位于最外层壁，当从外部添加内溶素时，细胞壁立即受到攻击和分解。另一方面，对于革兰氏阴性菌，最外层部分存在外部细胞膜，细胞壁位于其内部，因此，即使从外部添加内溶素，它也必须首先通过细胞外膜与细胞壁接触。因此，已知内溶素基本上对革兰氏阴性菌没有影响。本说明书中提供的具有内溶素活性的多肽的特征在于具有杀死革兰氏阴性菌的效果。
36.另一方面，杀菌肽a是一种具有抗菌活性的肽，具有溶解细菌膜的作用。
37.在本说明书中，新型多肽或其中杀菌肽a与新型多肽融合的融合多肽显示出优于传统内溶素的抗菌作用，因此，提供了具有内溶素活性的多肽及其抗生素和/或与其相关的用途。
38.下文将更详细地描述本发明：
39.术语的定义
40.在本说明书中，多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成”可以指多核苷酸或多肽基本上包括特定的核酸序列或氨基酸序列，并且它可以被解释为包括“实质上等效的序列”，其中在维持多核苷酸或多肽的原始功能和/或期望功能(或不排除突变)的范围内将突变(删除、取代、修饰和/或添加)添加到特定核酸序列或氨基酸序列。
41.在一个实例中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成或由特定核酸序列或氨基酸序列表示”可以指多核苷酸或多肽(i)基本上包含特定核酸序列或氨基酸序列，或(ii)由与特定核酸序列或氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列组成，或基本上包含该序列，并维持原始功能和/或所需功能。在本说明书中，原始功能可以是内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)、杀菌肽a活性(例如，细胞膜水解活性)和/或抗菌作用(在氨基酸序列的情况下)或内溶素酶功能，或编码具有杀菌肽a活性和/或抗菌作用(在核酸序列的情况下)的蛋白质的功能，并且所需功能可以指抗革兰氏阴性菌(例如，假单胞菌属细菌，例如，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa))的抗菌活性。
42.在本说明书中，术语“同一性”是指与给定核酸序列或氨基酸序列的对应程度，可以用百分比(％)表示。例如，在核酸序列的同一性的情况下，可以通过文献(参考：karlin和altschul，pro.natl.acad.sci.usa，90，5873，1993)或pearson的fasta(参考：methods enzymol，183，63，1990)使用算法blast来确定。基于此算法blast，开发了名为blastn或blastx的程序(参考：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov).
43.本说明书中提供的蛋白质或多肽可从自然界中分离和/或纯化，或重组或化学合成。当本说明书中提供的蛋白质或多肽的氨基酸序列包含甲硫氨酸(met，m)或met-ala-ser
(mas)序列作为从n端开始的第一个氨基酸残基时，可以重组产生蛋白质或多肽，并且从n端开始的第一个氨基酸位置的甲硫氨酸可以由起始密码子编码。因此，当本说明书中提供的蛋白质或多肽的氨基酸序列在n端通过重组生产包含甲硫氨酸时，以及当通过其他方法(例如，化学合成或从自然界分离)获得蛋白质或多肽时，它可以被解释为：包含从第二个氨基酸残基开始的氨基酸序列，但排除通过重组生产从n-末端开始的第一个位置的甲硫氨酸，或者包含mas序列之后的氨基酸残基开始的氨基酸序列(例如，第四个氨基酸残基)。
44.新型多肽和编码该多肽的多核苷酸
45.一个实例提供了一种新型多肽。该多肽可包含seq id no：1的氨基酸序列。该多肽可以衍生自噬菌体。该多肽可以具有衍生自噬菌体的内溶素活性。该多肽的分子量约为28kda(28kda
±
2)。
46.在另一实例中，该多肽可包含seq id no：6的氨基酸序列。该多肽可以是衍生自噬菌体的内溶素变体，并且与衍生自噬菌体的内溶素相比，可以具有优异的内溶素活性和/或抗菌活性。该多肽的分子量约为28kda(28kda
±
2)。该多肽可以重组或合成(例如化学合成)制备。
47.另一实例提供了一种编码该多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含seq id no：2或seq id no：7的核酸序列。
48.内溶素是指由噬菌体编码的肽聚糖水解酶。内溶素在噬菌体增殖的裂解周期的后期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖介导从感染的细胞释放子代病毒粒子。关于酶活性，内溶素通常可以具有选自由氨基葡萄糖苷酶、胞壁酸酶(muramidase)(一种溶菌酶(lysozyme))、转糖苷酶、酰胺酶、内肽酶等组成的组中的一种或多种活性。
49.在本说明书中，除非另有说明，否则具有内溶素活性的多肽为“包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列”或“由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列组成”的多肽，
50.可以指：
51.(1)由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列组成或基本上包含其的多肽，和/或
52.(2)由与seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高同一性的氨基酸序列(例如，与seq id no：1的氨基酸序列具有99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列，或与seq id no：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列)组成或基本上包含该氨基酸序列，并且具有(维持)内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性的多肽。
53.此外，在本说明书中，除非另有说明，否则编码“包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列”或“由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列组成”的多肽的多核苷酸，
54.可以指
55.(a)编码由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列组成或基本上包含其的多肽
的多核苷酸，和/或
56.(b)由与seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高同一性的氨基酸序列(例如，与seq id no：1的氨基酸序列具有99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列，或与seq id no：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列)组成或基本上包含该氨基酸序列，并且具有(维持)内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性的多肽，和/或
57.(c)“包含seq id no：2或seq id no：7的核酸序列”或“由seq id no：2或seq id no：7的核酸序列组成”的多核苷酸，和
58.所述“包含seq id no：2或seq id no：7的核酸序列”或“由seq id no：2或seq id no：7的核酸序列组成”的多核苷酸，
59.可以指
60.(d)由seq id no：2或seq id no：7的核酸序列组成或基本上包含该核酸序列的多核苷酸，或
61.(e)由与seq id no：2或seq id no：7的核酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高同一性的核酸序列(例如，与seq id no：2的核酸序列具有99.7％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高同一性的核酸序列，或与seq id no：7的核酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的核酸序列)组成或基本上包含该核酸序列，并且具有(维持)内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性的多核苷酸。
62.融合多肽和编码该融合多肽的多核苷酸
63.另一实例提供了一种新型融合多肽。该融合多肽可包含杀菌肽a和内溶素。
64.杀菌肽a可衍生自蛾(hyalophora cecropia)，并且例如可由seq id no：8的氨基酸序列表示。内溶素可衍生自噬菌体或其变体，例如，其可由seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列表示。
65.在融合多肽中，杀菌肽a(例如，seq id no：8)和内溶素(例如，seq id no：1或seq id no：6)可以任何顺序连接。换言之，在融合多肽中，杀菌肽a和内溶素可以按照杀菌肽a和内溶素的顺序或内溶素和杀菌肽a的顺序连接，例如，可以按照杀菌肽a和内溶素的顺序连接。
66.此外，杀菌肽a(例如，seq id no：8)和内溶素(例如，seq id no：1或seq id no：6)可以通过接头连接或在没有接头的情况下直接连接。
67.在一个实例中，融合多肽可由seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列表示。
68.与内溶素或杀菌肽a相比，融合多肽可具有抗革兰氏阴性菌的优异的抗菌活性和/或优异的外膜透化作用。融合多肽的分子量可约为34kda(例如，34kda
±
3)。融合多肽或内
溶素和杀菌肽a可以重组或合成(例如，化学合成)制备。
69.另一实例提供了一种编码融合多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含seq id no：11或seq id no：14的核酸序列。
70.本说明书中提供的新型多肽(例如，seq id no：1或seq id no：6)可具有内溶素活性。内溶素是指编码噬菌体的肽聚糖水解酶。内溶素在噬菌体增殖的裂解周期中的后期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖介导子代病毒粒子从感染细胞中的释放。关于酶活性，内溶素通常可以具有选自由氨基葡萄糖苷酶、胞壁酸酶(一种溶菌酶)、转糖苷酶、酰胺酶、内肽酶等组成的组中的一种或多种活性。
71.在本说明书中，除非另有说明，融合多肽，
72.可包括
73.(1)由与seq id no：8的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列组成或seq id no：8或基本上包含该氨基酸序列，并具有(维持)杀菌肽a活性的多肽；和
74.(2)由seq id no：1、seq id no：6或与这些氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列(例如，与seq id no：1的氨基酸序列具有99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列，或与seq id no：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列)组成或基本上包含该氨基酸序列，并具有(维持)内溶素活性的多肽；
75.以任意顺序(例如，从n-端开始的顺序)。
76.在一个实例中，该融合多肽
77.可以指
78.基本上包含seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列的多肽，和/或
79.由与seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列组成或基本上包含该氨基酸序列，并具有(维持)对抗革兰氏阴性菌的抗菌活性的多肽。
80.此外，在本说明书中，除非另有说明，否则编码包含seq id no：10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
81.可以指
82.(a)编码由seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列组成的多肽或基本上包含该氨基酸序列的多肽的多核苷酸，和/或
83.(b)由与seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的氨基酸序列组成或基本上包含该氨基酸序列，并具有(维持)抗革兰氏阴性菌的抗菌活性的多核苷酸，和/或
84.(c)包含seq id no：11或seq id no：14的核酸序列的多核苷酸，和
85.包含seq id no：11或seq id no：14的核酸序列的多肽
86.可以指
87.(d)由seq id no：11或seq id no：14的核酸序列组成或基本上包含该核酸序列的多核苷酸，和/或
88.(e)由与seq id no：11或seq id no：14的核酸序列具有96％或更高、96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性的核酸序列组成或基本上包含该核酸序列，并具有(维持)抗革兰氏阴性菌的抗菌活性的多核苷酸。
89.在本说明书提供的融合多肽中，杀菌肽a和内溶素可通过肽接头连接或在没有肽接头的情况下直接连接。肽接头可以是由1至100、2至50、1至30、2至20或2至10个的任何氨基酸组成的多肽，其中包含的氨基酸种类没有限制。肽接头可以包含分别选自由例如gly、ser、leu、gln、asn、thr和ala组成的组中的一种或多种氨基酸残基。适用于肽接头的氨基酸序列是本领域已知的。另一方面，接头的长度可以在不影响融合蛋白的结构和/或功能的限制内不同地确定。例如，肽接头可组成为包括选自由gly、ser、leu、gln、asn、thr和ala组成的组中的一种或多种的总共1至100、2至50、1至30、2至20或2至10个。在一个实例中，肽接头可由gsgsgs(seq id no：12)、(g)
4～10
(如gggggg，gggggggg等)、(ggggs)
1～5
(如(ggggs)1等)、(eaaak)
1-5
(如(eaaak)3，(eaaak)5等)、(eaaak)4(ggggs)1表示，但不限于此。
90.重组载体和重组细胞
91.另一实例提供了一种包含前述多肽(包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列的多肽)或编码前述融合多肽(例如，seq id no：10或seq id no：13)的多核苷酸的重组载体。重组载体可用作表达载体。
92.另一实例提供了一种制备多肽或融合多肽的方法，包括在适当的宿主细胞中表达多肽或融合多肽。多肽或融合多肽在适当宿主细胞中的表达可通过在重组细胞中培养包含其的多核苷酸或重组载体来执行。制备内溶素的方法可进一步包括在表达后分离和/或纯化表达的内溶素。
93.可通过适当选择转化方法将多核苷酸或载体引入宿主细胞。在本说明书中，术语“转化”是指将包含编码该多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞，以便编码该多核苷酸的多肽可以被表达。转化的多核苷酸可以包括无论是插入并定位在宿主细胞的染体中还是位于染体外的所有，只要它们可以在宿主细胞中表达。要引入的多核苷酸的类型不受限制，只要它被引入宿主细胞并表达。例如，可将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是包含自表达所需所有元件的基因结构。表达盒通常可包括表达调节元件，例如可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号等。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以其自身形式引入宿主细胞，并可操作地连接到在宿主细胞中表达所需的序列。在上文中，术语“可操作地连接”可以指表达调节元件(例如启动子)和多核苷酸在功能上连接以执行多核苷酸的转录调节(例如转录起始)。可使用本领域已知的基因重组技术进行可操作地连接。
94.将多核苷酸转化为宿主细胞的方法可以通过将核酸引入细胞(微生物)的任何方法来执行，并且可以通过根据宿主细胞适当选择本领域已知的转化技术来执行。作为已知
sp.)细菌等组成的组中的一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种或5种)。例如，假单胞菌属细菌可以是铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，不动杆菌属细菌可以是鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)，埃希氏杆菌属细菌可以是大肠杆菌(escherichia coli)，肠杆菌属细菌可以是产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)，克雷伯菌属细菌可以是肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)，但不限于此。
110.除了选自由上述多肽(包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸序列的多肽)或融合多肽、编码该多肽或融合多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体和包含该多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞组成的组中的一种或多种之外(以下简称第一抗生素)，本说明书中提供的抗生素可进一步包含另一种抗生素(第二种抗生素)。
111.第二种抗生素可以是从常用抗生素中选择的一种或多种，例如，对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的抗生素。在一个具体实例中，第二种抗生素可以是基于多粘菌素的抗生素，例如，它可以是多粘菌素b、粘菌素或其组合，但不限于此。
112.因此，通过将抗生素(第一种抗生素)与其他抗生素(第二种抗生素)组合使用，其优点是通过第一种抗生素本身的抗菌作用和在低浓度下作为第二种抗生素的优异的抗菌作用表现出协同效应。因此，可以减少使用高浓度抗生素的副作用，例如毒性(例如，肾毒性、肝毒性等)。此外，通过与其他机制的抗生素结合使用，可以抑制耐药性细菌的出现。
113.因此，一个实例
114.提供了一种组合抗生素，包括
115.(a)选自由以下组成的组中的一种或多种：(1)选自seq id no：1和seq id no：6中的一种或多种多肽，(2)包含该多肽和杀菌肽a的融合多肽(例如，seq id no：10或seq id no：13)或其组合，(3)编码(1)中的多肽的多核苷酸，(4)编码(2)中的融合多肽的多核苷酸，(5)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合的重组载体，(6)包含(3)中的多核苷酸、(4)中的多核苷酸或其组合或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞，和(7)包含seq id no：1的多肽、编码该多肽的多核苷酸或其组合的噬菌体：和
116.(b)抗生素(例如，基于多粘菌素的抗生素，例如多粘菌素b、粘菌素或其组合等)。
117.在本说明书中，术语“抗生素”包括对革兰氏阴性菌具有生长抑制能力和/或杀伤能力的所有类型的试剂，并且除非另有说明，否则其可与抗菌剂、防腐剂、消毒剂等互换使用。
118.药物组合物
119.另一实例提供了一种用于预防和/或革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物组合物，其包含抗生素或组合抗生素。
120.另一实例提供了一种用于预防或革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的方法，向需要预防和/或革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的受试者给药学上有效剂量的抗生素或组合抗生素。用于预防或的方法还可以包括在给药之前确认需要预防和/或革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的受试者。革兰氏阴性菌与上述相同。
121.由革兰氏阴性菌引起的疾病可以选自革兰氏阴性菌感染引起的所有疾病，例如，可以选自由假单胞菌属细菌引起的疾病，例如皮肤感染、褥疮、肺炎、菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髓炎、肠炎、腹膜炎或囊性纤维化；由不动杆菌属
细菌引起的疾病，如皮肤感染、肺炎、菌血症或败血症；由埃希氏杆菌属细菌引起的疾病，如肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、泌尿道感染、皮肤感染、菌血症或败血症等组成的组，但不限于此。
122.如在本说明书中所使用的，药物有效剂量是指能够获得预期效果的活性成分的所含量或剂量。药物组合物中活性成分的所含量或剂量可根据制备方法、给药方法、患者年龄、体重、性别、发病率、食物、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率和反应敏感性等因素而不同。例如，当活性成分为多肽时，单次剂量可为0.001至1000mg/kg、0.01至100mg/kg、0.01至50mg/kg、0.01至20mg/kg、0.01至10mg/kg、0.01至5mg/kg、0.1至100mg/kg、0.1至50mg/kg、0.1至20mg/kg、0.1至10mg/kg、0.1至5mg/kg、1至100mg/kg、1至50mg/kg、1至20mg/kg、1至10mg/kg或1至5mg/kg，但不限于此。
123.在另一实例中，基于药物组合物的总重量，药物组合物中活性成分的含量可为0.01重量％至99.9重量％、0.01重量％至90重量％、0.01重量％至80重量％、0.01重量％至70重量％、0.01重量％至60重量％、0.01重量％至50重量％、0.01重量％至40重量％、0.01重量％至30重量％、1重量％至99.9重量％、1重量％至90重量％、1重量％至80重量％、1重量％至70重量％、1重量％至60重量％、1重量％至50重量％、1重量％至40重量％、1重量％至30重量％、5重量％至99.9重量％、5重量％至90重量％、5重量％至80重量％、5重量％至70重量％、5重量％至60重量％、5重量％至50重量％、5重量％至40重量％、5重量％至30重量％、10重量％至99.9重量％、10重量％至90重量％、10重量％至80重量％、10重量％至70重量％、10重量％至60重量％、10重量％至50重量％、10重量％至40重量％或10重量％至30重量％，但不限于此。
124.此外，除活性成分外，药物组合物还可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可指通常用于制备包含蛋白质、核酸或细胞的药物的载体，并且不刺激生物体并且不抑制活性成分的生物活性和/或性质。在一个实例中，载体可以是选自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等组成的组中的一种或多种，但不限于此。药物组合物还可以包括选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等组成的组中的一种或多种，它们通常用于制备药物组合物。
125.药物组合物的给药对象可以是选自包括灵长类动物(如人和猴子)、啮齿动物(如小鼠和大鼠)、家畜(如狗、猫、猪、牛、马、绵羊和山羊)的哺乳动物，家禽(如鸡、鸭、鹅、雉鸡、鹌鹑和火鸡等)，或其衍生的细胞、组织或培养物中的一种或多种。
126.药物组合物可以通过口服给药或肠外给药来给药，或者通过接触细胞、组织或体液来给药。具体而言，在肠外给药的情况下，可以通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药和直肠内给药等进行给药。在口服给药的情况下，当蛋白质或肽被消化时，应配制口服组合物以包覆活性剂或防止其在胃中降解。在经鼻给药的情况下，可通过鼻喷雾给药以稀释药物组合物，并通过喷雾器或喷雾系统吸收到鼻腔中，并且鼻喷雾器或用于鼻喷雾的呼吸制剂可包括气溶胶。
127.此外，药物组合物可以油或水介质溶液、注射液、悬浮液、糖浆、乳液、软膏、贴剂、提取物、粉末、粉末、颗粒、片剂、胶囊、气溶胶等形式配制，并且它还可以包括用于配制的分
散剂或稳定剂。
128.另一实例提供了一种包含抗生素或组合抗生素作为活性成分的饲料添加剂。
129.另一实例提供了一种包含饲料添加剂的组合物的饲料。
130.对于饲料，抗生素或组合抗生素可以以饲料添加剂的形式单独制备并混合到饲料中，或者可以通过在饲料制备过程中直接添加来制备。
131.饲料中的抗生素或组合抗生素可以是液体或干燥形式，例如，它可以是干燥的粉末形式。抗生素的含量可为饲料总重量的0.005至10重量％、0.05至10重量％、0.1至10重量％、0.005至5重量％、0.05至5重量％、0.1至5重量％、0.005至2重量％、0.05至2重量％或0.1至2重量％，但不限于此。此外，除了抗生素或组合抗生素外，饲料还可以包括常见添加剂，其可以提高饲料的储藏性。
132.在本说明书中，饲料中的抗生素或组合抗生素可以选自由市售饲料或谷物、根果、食品加工副产品、藻类、纤维、医药副产品、油脂、淀粉、葫芦、谷物副产品、蛋白质、无机物、油脂、矿物质、单细胞蛋白质、浮游动物、剩饭等组成的组，但不限于此。
133.另一实例提供了一种包含该抗生素或组合抗生素作为活性成分的食品添加剂或饮用水添加剂。通过在饮用水中混合并提供抗生素或组合抗生素，可以减少饮用水中革兰氏阴性菌的数量。革兰氏阴性菌与上述相同。
134.另一实例提供了一种包含该抗生素或组合抗生素作为活性成分的消毒剂。另一实例提供了一种消毒方法，包括将抗生素或组合抗生素应用于需要消毒的受试者。消毒剂是防止病原体感染的药剂的通称，可用于一般生活消毒剂、食品和烹饪场所及设施的消毒剂以及各种生长和发育用品(例如家禽养殖场和围栏、牲畜尸体、饮用水、垃圾、蛋盘、运输车辆、餐具等建筑物)的消毒。
135.另一实例提供了一种包含抗生素或组合抗生素作为活性成分的洗涤剂。另一实例提供了一种清洁方法，包括将抗生素或组合抗生素应用于需要清洁的受试者。由于抗生素对革兰氏阴性菌具有抗菌作用，因此可用于清洁(清洗)暴露于或可能暴露于革兰氏阴性菌的个人的皮肤表面或身体部位。革兰氏阴性菌与上述相同。
136.有益效果
137.本说明书中提供的新型多肽、多肽变体或新型融合多肽现出优异的外膜透化作用和抗各种革兰氏阴性菌的杀伤活性，因此可以有效地用作对抗革兰氏阴性菌的抗生素。
附图说明
138.图1是表达感染铜绿假单胞菌的噬菌体pbpa90的内溶素(lnt101)基因的表达载体的裂解图谱。
139.图2示出了纯化衍生自噬菌体pbpa90的内溶素(lnt101)的过程。
140.图3是示出衍生自噬菌体pbpa90的内溶素(lnt101)在体外对铜绿假单胞菌的抗菌作用图。
141.图4是示出衍生自噬菌体pbpa90的内溶素(lnt101)在体内对铜绿假单胞菌的抗菌作用图。
142.图5示出了根据一个对比例的内溶素(lnt102)(seq id no：6)和内溶素(lnt101)(seq id no：1)的氨基酸序列。
143.图6是表达内溶素(lnt102)的表达载体pbt7-lnt102的裂解图谱。
144.图7示出了内溶素(lnt102)纯化过程中获得的反应物的sds-page结果。
145.图8是示出内溶素(lnt102)和内溶素(lnt101)对各种革兰氏阴性菌的杀伤能力图。
146.图9和10是示出根据内溶素(lnt102)的浓度和处理时间对革兰氏阴性菌的杀伤能力图。
147.图11是根据一个实例的融合多肽(lnt103)的示意图。
148.图12是示出根据一个实例在纯化融合多肽(lnt103)的过程中获得的反应物的sds-page结果的图像。
149.图13是示出内溶素(lnt101)、内溶素变体(lnt102)和融合多肽(lnt103)对各种革兰氏阴性菌的外膜透化活性图。
150.图14是示出内溶素(lnt101)、内溶素变体(lnt102)和融合多肽(lnt103)对各种革兰氏阴性菌的杀伤能力图。
151.图15是示出融合多肽lnt103和ceca-lnt101对各种革兰氏阴性菌的杀伤能力图。
152.图16是示出根据一个实例的融合多肽(lnt103)和杀菌肽a对革兰氏阴性菌的杀伤能力的对比图。
153.图17是示出根据一个实例的融合多肽(lnt103)的浓度和处理时间对革兰氏阴性菌的杀伤能力图。
154.图18和19是示出根据一个实例的融合多肽(lnt103)的细胞毒性和溶血测定的评估结果图。
155.图20是示出在鲍曼不动杆菌系统感染小鼠模型中融合多肽lnt103与粘菌素相比的活力图。
具体实施方式
156.本说明书中提供的新型内溶素和/或表达其的噬菌体对假单胞菌属细菌(例如铜绿假单胞菌)表现出优异的生长抑制能力和杀伤能力，因此，它们可以有效地用作抗假单胞菌属细菌(例如铜绿假单胞菌)的抗生素。
157.实施例1：lnt101内溶素的制备和抗菌活性测试
158.1.1.能够杀伤铜绿假单胞菌的噬菌体的分离
159.1.1.1.菌株培养条件
160.将铜绿假单胞菌(pr01957)用作宿主，在37℃的条件下，在lb(luria-bertani)培养基中震荡培养。
161.1.1.2.噬菌体的分离
162.为了选择感染铜绿假单胞菌的噬菌体，从韩国京畿道果川区果川污水处理厂(gwacheon sewage treatment plant，gwacheon-si，gyeonggi-do，korea)收集了样本。收集的样本和铜绿假单胞菌在37℃下培养3小时，然后在500rpm下离心20分钟，收集上清液。随后，用0.45μm过滤器过滤，然后进行双琼脂层菌斑测定。
163.简要描述分析方法，将宿主菌、铜绿假单胞菌和噬菌体的培养液通过0.1m.o.i.混合到顶部琼脂5ml中，并倒入琼脂板，在37℃下培养24小时以获得斑块。通过反复试验，获得
了纯化的纯噬菌体，该噬菌体命名为噬菌体pbpa90。
164.1.2：噬菌体pbpa90的基因组的分离和分析
165.对实施例1.1中获得的噬菌体pbpa90的基因组进行测序。在200ml的lb培养基中将铜绿假单胞菌培养至od
600
＝0.5后，通过感染过滤的噬菌体109pfu/ml或0.1 m.o.i.进行裂解。之后，添加氯化钠，使最终浓度为1m，然后将其在4℃下放置1小时。随后，在11000
×
g下离心10分钟后，向沉淀物中添加10％(w/v)的peg(聚乙二醇8000)，并将其在4℃下放置1小时。随后，在11000
×
g下离心10分钟后，去除上清液，并用sm缓冲溶液[100mm nacl，10mm mgso4(七水)，50mm tris-hcl，ph 7.5]悬浮沉淀物。此处以1∶1的比例添加，并进行涡旋，然后在3000
×
g下离心15分钟以获得上清液。
[0166]
将40％(w/v)甘油3ml添加到聚碳酸酯试管中，然后添加5％(w/v)甘油4ml以避免混合。随后，去除上清液，然后用sm缓冲液重新悬浮沉淀物，以获得噬菌体基因组dna。根据制造商手册，使用噬菌体dna分离试剂盒(norgen biotek corp.)分离噬菌体基因组dna。使用如上分离的基因组样本分析基因组序列(las，illumina-miseq平台)。
[0167]
最终分析的噬菌体pbpa90基因组的总核酸序列长度为304052bp，gc含量为44％。噬菌体pbpa90基因组的全长核酸序列在seq id no：5中表示。基于基因组核酸序列信息，使用在线blast研究了与传统已知噬菌体基因组核酸序列的相似性。blast研究结果证实，噬菌体pbpa90的基因组序列与假单胞菌噬菌体ktn4(genbank登录号：ku521356.1)的序列相似性较低(查询覆盖率：4％，同一性：97.34％)。基于这一事实，证实噬菌体pbpa90是一种传统上未知的新噬菌体。
[0168]
1.3：lnt101内溶素的克隆和纯化
[0169]
通过对所分析的噬菌体pbpa90(seq id no：5)的基因组序列进行orf搜素，估计第180029-180806位置(seq id no：2)处780bp的orf是内溶素基因，噬菌体pbpa90衍生的内溶素和编码该内溶素的基因分别被命名为lnt101内溶素和lnt101基因。
[0170]
使用引物(f：5
′‑
aaggatccatgggtactgtactcaaacgtggc-3
′
(seq id no：3)，r：5
′‑
aactcgagtgcccgatgtttcgaaactttatcttc-3
′
(seq id no：4))，对噬菌体pbpa90的基因组进行pcr(聚合酶链式反应)以获得lnt101基因(seq id no：5中第180029-180806位置处的长度为780bp的核酸序列)。lnt101基因编码的lnt101内溶素的氨基酸序列在seq id no：1(259个aa)中表示。pcr在以下条件下进行：步骤1：94℃，5分钟；步骤2：94℃，30秒；步骤3：52℃，45秒；步骤4：72℃，1分钟；步骤5：重复步骤2-4 30次；步骤6：72℃，10分钟。将获得的pct产物克隆到具有n末端6x his标签的pet-21a载体(novagen)的bamhi/xhoi位点，以制备用于lnt101内溶素表达的表达载体(pet-lnt101质粒)。制备的表达载体pet-lnt101如图1所示。
[0171]
制备的pet-lnt101质粒在大肠杆菌bl21 plyss菌株(novagen)中转化，然后在lb肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)nacl)中培养至od
600
＝0.5。之后，添加1mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)，然后在37℃振荡培养4小时。细胞收获后，用裂解缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、10mm咪唑)将其重新悬浮，并添加1mm pmsf和1mg/ml溶菌酶，并将其放在冰上30分钟。通过超声波裂解细胞，并在13000rpm下离心40分钟以获得上清液。将其通过填充ni-nta琼脂糖树脂(qiagen)的柱。之后，用洗涤缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、30mm咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、
300mm咪唑)洗脱，以纯化lnt101蛋白质(包括6xhis标签)。
[0172]
lnt101蛋白的纯度通过15％sds-page确认，lnt101蛋白的浓度通过bradford分析测定。通过sds-page确认纯化过程中获得的每个反应物的结果如图2所示。经sds-page证实，纯化的lnt101蛋白的分子量约为28kda。lnt101蛋白质的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0173]
1.4.噬菌体pbpa90及其衍生的内溶素lnt101的靶菌谱研究
[0174]
在本实施例中，为了研究在实施例1.1和1.2中选择的噬菌体pbpa90和在实施例1.3中分离和纯化的内溶素lnt101的靶菌谱，对抗革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌atcc13388、atcc9027、atcc10145、atcc15692、atcc15522、atcc25619、atcc27853、ccarm2134、ccarm2200、ccarm2029、ccarm2144、ccarm2298、ccarm2326、pr01957，大肠杆菌(e.coli)atcc8739，阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)ccarm0252，肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)kctc2261，产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)ccarm1606，空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)kctc5327，阪崎肠杆菌(cronobacter sakazakii)kctc2949，鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)atcc14028，肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)atcc13076的抗菌活性进行了测试。
[0175]
噬菌体pbpa90和内溶素lnt101的靶菌谱通过斑点测试得到证实。对于斑点测试，在加入1
×
10
11
cfu/200μl的4ml顶部琼脂(1％胰蛋白酶、0.5％酵母抽提物、0.5％氯化钠、0.7％琼脂)中灭菌的细菌并倒入lb板上。在硬化顶部琼脂后，噬菌体pbpa90 10μl(1
×
108pfu/ml)或lnt101 10μl(2mg/ml)出现斑点，并在37℃下培养18小时。
[0176]
证实了由于培养而形成的光晕区的产生，结果如下表1所示：
[0177]
【表1】
[0178]
[0179][0180]
(在表1中，“ο”指光晕区的产生)
[0181]
如表1所示，内溶素lnt101在所有测试的革兰氏阴性菌中形成了光晕区(halo zone)，这些革兰氏阴性菌是铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、弯曲菌属(campylobacter)、克罗诺杆菌属(cronobacter)和沙门氏菌属菌株。这一结果表明，内溶素lnt101对上述各种革兰氏阴性菌的肽聚糖具有降解能力，并且具有广泛的靶菌谱。
[0182]
1.5.内溶素lnt101对铜绿假单胞菌的杀伤能力的研究
[0183]
在本实施例中，对于在实施例1.4中证实噬菌体pbpa90和内溶素lnt101具有抗菌活性的铜绿假单胞菌(atcc 13388)，测试内溶素lnt101的杀菌能力。
[0184]
体外测试
[0185]
为此，添加浓度为0.1、0.5、1.0μm的内溶素lnt101和铜绿假单胞菌(atcc 13388)1
×
106cfu，至反应缓冲液(20mm tris-cl，ph 7.5)，使最终体积为200μl并将其在37℃下放置1小时。在30分钟、1小时和2小时内，确认铜绿假单胞菌的菌落数，结果如图3所示。如图3所示，证实内溶素lnt101在所有测试的剂量和时间内对铜绿假单胞菌具有杀伤能力，并且表明这种铜绿假单胞菌杀伤能力取决于时间和剂量。
[0186]
此外，通过cfu减少测试证实lnt101内溶素在各种革兰氏阴性菌中具有抗菌能力，结果如下表2所示。
[0187]
【表2】
[0188][0189]
(在表2中，
′
ο
′
指通过cfu减少测定减少0.5log cfu或更多)
[0190]
如表2所示，证实其对包括抗生素耐药菌的8种铜绿假单胞菌、3种鲍曼不动杆菌、1种阴沟肠杆菌和1种产气克雷伯菌的所有测试的革兰氏阴性菌均具有剂量依赖性杀菌作用。
[0191]
体内测试
[0192]
内溶素lnt101对铜绿假单胞菌的杀伤能力也在体内得到证实。作为体内有效性评估的动物模型，使用了大蜡螟(galleria mellonella)。大蜡螟模型分为健康组(非感染组)、铜绿假单胞菌感染组(药物非给药组)、2个lnt101给药组(其中lnt101给药至感染模型)、粘菌素给药组(其中粘菌素给药至铜绿假单胞菌感染的模型)、联合给药组(将lnt101和粘菌素联合给药至铜绿假单胞菌感染的模型)以进行实验，每组10只大蜡螟。
[0193]
通过以ld80浓度，50cfu/幼虫，感染铜绿假单胞菌pao1制备铜绿假单胞菌感染的模型，分别以0.6μg/幼虫(3mg/kg)和6μg/幼虫(30mg/kg)给药lnt101。粘菌素以0.5μg/幼虫(2.5mg/kg)给药，对于联合给药，粘菌素以0.5μg/幼虫(2.5mg/kg)给药，lnt101以6μg/幼虫(30mg/kg)给药。根据72小时的观察结果，大蜡螟的生存能力如图4所示。如图4所示，证实感染组100％死亡，但在lnt101和粘菌素给药组中，存活率增加。特别是，在lnt1016μg/幼虫(30mg/kg)给药组中，证实30％的存活率。
[0194]
1.6.内溶素ltn101和多粘菌素抗生素对铜绿假单胞菌杀伤能力的协同作用
[0195]
证实了多粘菌素基抗生素(具有作用于细菌细胞膜的机制)和内溶素lnt101联合的协同作用。具体来说，多粘菌素b(32μg/ml-0.03μg/ml)和粘菌素(128μg/ml-0.1μg/ml)在微孔板中每孔稀释1/二2，然后制备lnt101内溶素1μm联合组和等量pbs组。在所有孔中，铜绿假单胞菌1
×
105cfu/ml用100μl总量处理。然后在37℃下培养18小时。mic(最小抑制浓度)是指细菌未生长的孔中最小多粘菌素基抗生素的浓度值，mic测试通过肉汤微量稀释技术进行。
[0196]
通过多粘菌素基抗生素(多粘菌素b、粘菌素)和lnt101内溶素在不同浓度下的联合，证实多粘菌素基抗生素的mic变化，如下表3所示。
[0197]
【表3】
[0198][0199]
如表3所示，证实了在与lnt101内溶素联合使用的情况下，多粘菌素基抗生素、多粘菌素b和粘菌素的mic降低了50％。
[0200]
实施例2.lnt102内溶素的制备及抗菌活性测试
[0201]
2.1.具有内溶素活性的新型多肽的发现
[0202]
在实施例1.3中分离和纯化的内溶素lnt101(seq id no：1)由pg_结合_1结构域(10-65个氨基酸)和转糖苷酶slt结构域(95-179个氨基酸)组成。
[0203]
基于blastp分析，通过对比内溶素lnt101 pg_结合_1结构域的氨基酸序列与具有相似氨基酸序列的嗜热厌氧杆菌噬菌体(thermoanaerobacterium phage)thsa-485a的糖苷水解酶家族25(登录号yp_006546280.1)、沙雷氏菌噬菌体(serratia phage)phimam1的肽聚糖结合蛋白(登录号yp_007349105.1)、沙雷氏菌噬菌体2050h1的肽聚糖结合蛋白(登录号asz78903.1)、沙雷氏菌噬菌体vb_smaa_3m的推定肽聚糖结合蛋白(登录号ayp28388.1)、欧文氏菌噬菌体(enwinia phage)vb_eamm-bue1的推定肽聚糖结合蛋白(登录号avo22912.1)、假单胞菌噬菌体(pseudomonas phage)noxifer的推定肽聚糖结合蛋白(登录号yp_009609055.1)、沙门氏菌噬菌体(salmonella phage)mutine的内溶素(登录号aug88272.1)和沙门氏菌噬菌体bering的肽聚糖结合蛋白(登录号qiq61961.1)，用对比蛋白的优势氨基酸序列取代lnt101内溶素和其他氨基酸位点的11个氨基酸。
[0204]
基于blastp分析，通过对比lnt101内溶素转糖苷酶slt结构域的氨基酸序列与具有相似氨基酸序列的假单胞菌噬菌体noxifer的尾部纤维蛋白(登录号yp_009609112.1)、假单胞菌噬菌体sl2的推定蛋白sl2_199(登录号yp_009619739.1)、假单胞菌噬菌体ktn4的推定内溶素(登录号anm44938.1)、假单胞菌噬菌体phikz的phikz144(登录号np_803710.1)、假单胞菌噬菌体psa21的尾部纤维蛋白(登录号qbj02724.1)和假单胞菌噬菌体vb_paem_ps119xw的推定蛋白(登录号qem41943.1)，用对比蛋白的优势氨基酸序列取代lnt101内溶素和其他氨基酸位点的4个氨基酸。
[0205]
考虑到密码子的使用，在lnt101基因序列部分修改了15个取代的氨基酸序列部分(seq id no：7)，这被命名为lnt102(seq id no：6)。lnt101和lnt102序列的对比如图5所示。将lnt102克隆到基因合成和c末端6x组氨酸标签连接的pbt7-c-his载体(bioneer)。制备的lnt102的表达载体pbt7-lnt102如图6所示。
[0206]
下表4总结了所述的lnt102和lnt101的序列：
[0207]
【表4】
[0208][0209][0210]
2.2.lnt102内溶素的纯化
[0211]
将制备的pbt7-lnt102质粒转化到大肠杆菌bl21-star(de3)菌株(invitrogen)中后，将在lb肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)nacl)中培养到od
600
＝0.5。之后，添加1mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)，然后在37℃振荡培养4小时。细胞收获后，用裂解缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、10mm咪唑)重新悬浮，添加1mm pmsf和1mg/ml溶菌酶，并将其放在冰上30分钟。通过超声波裂解细胞，并在13000rpm下离心40分钟以获得上清液。将其通过填充ni-nta琼脂糖树脂(qiagen)的柱。然后，在用洗涤缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、30mm咪唑)洗涤后，用洗脱缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、300mm咪唑)洗脱，以纯化lnt102蛋白质(包括6xhis标签)。
[0212]
通过15％sds-page确认lnt102蛋白的纯度，并通过bradford分析测定lnt102蛋白的浓度。通过sds-page确认纯化过程中获得的每种反应物的结果如图7所示。经sds-page证实，纯化的lnt102蛋白的分子量约为28kda。
[0213]
2.3.内溶素lnt102对革兰氏阴性菌的杀伤能力的研究
[0214]
在本实施例中，证实了在实施例2.2中纯化的内溶素lnt102对各种革兰氏阴性菌
的杀菌能力和靶菌谱。
[0215]
体外测试
[0216]
为此，将2μm浓度的内溶素lnt101和lnt102，以及铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)、鲍曼不动杆菌(atcc 17978)、大肠杆菌(atcc 8739)、肺炎克雷伯菌(atcc 13883)、产气肠杆菌(ccarm 16006)、肠炎沙门氏菌(atcc 13076)各1
×
106cfu添加到反应缓冲液(20mm tris cl，ph 7.5)中，使最终体积为200μl，在37℃下放置2小时。在2小时内，确认每个革兰氏阴性菌的菌落数，结果如图8所示(在图8中，pa90代表内溶素lnt101和mtpa90代表内溶素lnt102)。如图8所示，证实与对照组相比，所有内溶素lnt101和lnt102对所有测试的革兰氏阴性菌均具有优异的杀伤能力，特别是，与lnt101相比，在相同剂量下，lnt102对革兰氏阴性菌显示出更优异的杀伤能力。
[0217]
将浓度为0.1、0.5、2.5μm的内溶素lnt102和铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌各1
×
106cfu添加到反应缓冲液(20mm tris-cl，ph 7.5)中，使最终体积为200μl，在37℃下放置2小时。在30分钟、1小时和2小时内，结果如图9和图10所示。如图9和图10所示，证实了内溶素lnt102在所有测试的剂量和时间内对革兰氏阴性菌具有杀伤能力，并且表明这种对革兰氏阴性菌的杀伤能力取决于时间和剂量。
[0218]
2.4.内溶素ltn102与抗生素联合使用时对革兰氏阴性菌的杀伤能力的协同作用
[0219]
通过组合处理具有作用于细菌细胞膜的机制的多粘菌素基抗生素和在实施例2.2中纯化的内溶素lnt102，证实了协同作用。具体而言，在将4μg/ml多粘菌素b处理到96孔微孔板a行后，在b-g行进行1/二2的连续稀释。多粘菌素未处理到h行。在将8μg/ml粘菌素处理到96孔微孔板a行后，进一步处理lnt102内溶素1μm的组合处理组和等量的pbs处理组。分别用总计100μl的1
×
105cfu/ml量的铜绿假单胞菌和大肠杆菌处理所有微孔。然后在37℃下培养18小时。mic(最小抑制浓度)是指细菌不生长的孔中最小多粘菌素基抗生素的浓度值，根据clsi(临床和实验室标准研究所)(临床和实验室标准研究所(clinical and laboratory standards institute)，有氧生长细菌的稀释抗菌药物敏感性试验方法；批准标准(methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacterium that grow aerobically；approved standard.)，第11版，文件m07，wayne，pa：clsi；2018)，通过肉汤微量稀释技术进行mic测试。
[0220]
通过不同浓度的多粘菌素基抗生素(多粘菌素b、粘菌素)和lnt102内溶素的联合处理，测量了多粘菌素基抗生素的mic变化，如下表5所示。
[0221]
【表5】
[0222][0223]
如表5所示，证实，在与lnt102内溶素联合使用的情况下，多粘菌素基抗生素(多粘
菌素b和粘菌素)的mic最多减少1/16倍。这一结果表明，当传统抗生素(例如，多粘菌素基抗生素和lnt102内溶素联合处理时)，可以显著提高抗菌作用。
[0224]
实施例3：融合多肽的制备
[0225]
3.1.多肽(lnt101和lnt102内溶素)的制备
[0226]
内溶素lnt101(seq id no：1)由pg_结合_1结构域(10-65个氨基酸)和转糖苷酶slt结构域(95-179个氨基酸)组成。通过在内溶素lnt101(seq id no：1)中添加15个氨基酸突变来制备seq id no：6的内溶素lnt101变体(以下称为内溶素lnt102)。
[0227]
将内溶素lnt102的编码基因(seq id no：7)插入pbt7质粒，制备用于内溶素lnt102表达的pbt7-lnt102质粒。将制备的pbt7-lnt102质粒转化到大肠杆菌bl21-star(de3)菌株(invitrogen)中，在lb肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)nacl)中培养到od
600
＝0.5。之后，添加1mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)，然后在37℃振荡培养4小时。细胞收获后，用裂解缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、10mm咪唑)重新悬浮，添加1mm pmsf和1mg/ml溶菌酶，并将其放在冰上30分钟。通过超声波裂解细胞，并在13000rpm下离心40分钟以获得上清液。将其通过填充ni-nta琼脂糖树脂(qiagen)的柱。然后，在用洗涤缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、30mm咪唑)洗涤后，用洗脱缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、300mm咪唑)洗脱，以纯化lnt102蛋白质(包括6xhis标签)。
[0228]
通过15％sds-page确认lnt102蛋白的纯度，并通过bradford分析测定lnt102蛋白的浓度。通过sds-page确认纯化过程中获得的每种反应物，纯化的lnt102蛋白质的分子量约为31kda。
[0229]
3.2.融合多肽的制备
[0230]
制备了一种融合多肽，其中杀菌肽a融合在制备的lnt102蛋白中。具体而言，将编码以从n端开始的顺序包括[杀菌肽a(seq id no：8)]-[接头(gsgsgs)(seq id no：12)]-[内溶素(命名为lnt102)(seq id no：6)]的融合多肽(命名为lnt103)(seq id no：10)的多核苷酸(seq id no：11)插入pet 21a(novagen)质粒中，以制备用于pet-lnt103表达的质粒pet-lnt103。将制备的pet-lnt103质粒转化到大肠杆菌bl21-star(de3)菌株(invitrogen)中后，将其在lb肉汤(1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)nacl)中培养到od
600
＝0.5。
[0231]
然后，添加1mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)后，在25℃下振荡培养6小时。细胞收获后，用裂解缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、10mm咪唑)重新悬浮，并添加1mm pmsf(苯)和1mg/ml溶菌酶，并将其放在冰上30分钟。通过超声波裂解细胞，并在13000rpm下离心40分钟以获得上清液。将获得的上清液通过填充ni-nta琼脂糖树脂(qiagen)的柱。然后，在用洗涤缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、30mm咪唑)洗涤后，用洗脱缓冲液(50mm nah2po4、300mm nacl、300mm咪唑)洗脱。通过15％sds-page纯化/确认，并通过bradford分析测定浓度。
[0232]
获得的sds-page结果如图12所示。如图12所示，证实纯化的融合多肽lnt103(seq id no：10)的分子量为34kda。
[0233]
此外，通过与上述方法相同的方法，制备了其中杀菌肽a与内溶素lnt101(seq id no：1)融合的融合多肽(ceca-lnt101；seq id no：13)。对于得到的ceca-lnt101，采用上述方法进行sds-page，以确认ceca-lnt101的分子量为34kda。
[0234]
另一方面，为了便于测试，用mas(met-ala-ser)取代纯化的融合多肽lnt103(seq id no：10)和ceca-lnt101(seq id no：13)的第一个氨基酸m，并以将额外序列和his标签添加到c末端的形式产生(seq id no：15或seq id no：16)，并且在以下测试中，分别将seq id no：15用于lnt103，将seq id no：16用于ceca-lnt101。
[0235]
下表6总结了本实施例中所述的多肽及其编码基因的氨基酸序列和核酸序列：
[0236]
【表6】
[0237]
[0238]
[0239]
[0240][0241]
3.3.融合多肽lnt103的外膜透化活性评价
[0242]
为了评估实施例3.2中制备的融合多肽的革兰氏阴性菌的外膜透化活性，进行npn摄取测定。对以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为代表的革兰氏阴性菌进行测试。
[0243]
培养铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)或鲍曼不动杆菌(atcc 19606)至od
600
＝0.3，并在1000g下离心10分钟，然后用1/2体积的5mm hepes(羟乙基哌嗪乙烷磺酸)(ph 7.2)重新悬浮。将40μm npn(1-n-苯基萘胺)溶液(5mm hepes中40μm npn，ph7.2)50μl、测试物质(lnt101、lnt102或lnt103)50μl和菌株悬浮液100μl(总计200μl)添加到微孔板中，并在37℃下反应1小时。然后，在激发350nm和发射420nm的条件下，使用微孔板读取器(infmite m200 pro，tecan)测量荧光。作为阳性对照组，使用杀菌肽a(seq id no：8)、edta或多粘菌素b，作为阴性对照组，使用10μm npn溶液。所有实验分3组进行。
[0244]
获得的结果如图13所示。为了对比lnt101、lnt102和lnt103对革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)和鲍曼不动杆菌(atcc 19606))的外膜渗透活性，处理相同浓度的2μm浓度，并处理2μm杀菌肽a和多粘菌素b以及1mm edta。获得的结果如图13的a和b所示，为相对于对照的倍数变化。如图13的a和b所示，证实融合多肽lnt103对革兰氏阴性菌的外膜透化活性高于相同浓度的多肽lnt101和lnt102，并且证实其甚至高于阳性对照组，杀菌肽a、edta和多粘菌素b。
[0245]
另一方面，为了确认根据lnt103的浓度对革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)和鲍曼不动杆菌(atcc 19606))的外膜透化活性的差异，将lnt103以0.29μm、0.88μm或(2.65μm)的量处理，以及处理2μm的杀菌肽a、多粘菌素b和1mm edta。所得结果如图13的c和d所示，为相对于阴性对照的倍数变化。如图13的c和d所示，证实与lnt101、lnt102、杀菌肽a和多粘菌素b相比，lnt103对革兰氏阴性菌具有优异的外膜透化活性，并且对革兰氏阴性菌的外膜透化活性以浓度依赖性方式增加。
[0246]
3.4.融合多肽lnt103对革兰氏阴性菌的杀伤能力的研究
[0247]
为了确认在实施例3.2中制备的融合多肽lnt103对革兰氏阴性菌的杀伤能力，对各种革兰氏阴性菌进行cfu减少评估。为了进行cfu减少评估，将实施例3中制备的lnt101、lnt102和lnt103各2μm，以及铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)、鲍曼不动杆菌(atcc 17978)、大肠杆菌(atcc 8739)、肺炎克雷伯菌(atcc 13883)、产气肠杆菌(ccarm 16006)各1
×
106cfu添加到反应缓冲液(20mm tris cl，ph7.5)中，使最终体积为200μl，在37℃下放置2小时。然后，确定每种革兰氏阴性菌的菌落数，以对比和评估每种多肽的抗菌效果。作为对照组，使用pbs组(以与融合多肽相同的体积处理pbs)。
[0248]
获得的结果如图14所示。如图14所示，与lnt101和lnt102相比，证实融合多肽lnt103显示出1.5～5.5log cfu/ml的cfu减少效果。特别是，杀死所有细菌的融合多肽lnt103对鲍曼不动杆菌(atcc 19606、atcc17978)、大肠杆菌(atcc 8739)、肺炎克雷伯菌
(atcc 2208)的cfu计数结果(对数cfu/ml)被视为0。
[0249]
此外，使用浓度为2μm的融合多肽lnt103和ceca-lnt101进行相同的测试，结果如图15所示。为了进行对比，对lnt102或pbs处理组进行了相同的测试。如图15所示，使用融合多肽lnt103和ceca-lnt101处理的所有组与使用lnt102或pbs处理的组相比，均具有优异的抗菌活性，尤其是，在2μm量的lnt103和ceca-lnt101处理的情况下，所有测试的细菌的计数结果(log cfu/ml)分别显示为0，因此，证实，他们杀死了所有的细菌。
[0250]
另一方面，为了对比除内溶素(lnt102或lnt101)以外的蛋白质与杀菌肽a融合的情况下的抗菌活性，评估了融合多肽lnt103和杀菌肽a-egfp融合蛋白(一种通过在lnt103中替换lnt102而使egfp(genbank登录号aab02572.1)不具有内溶素活性的蛋白质)对革兰氏阴性菌的杀伤能力。为此，分别以0.2μm或2μm的量处理蛋白质，以执行cfu减少测试。获得的结果如图16所示。如图16所示，证实杀菌肽a-egfp融合蛋白没有抗菌活性，而融合多肽lnt103具有优异的抗菌活性。特别是，当处理lnt103 2μm时，可以证实杀死所有细菌的所有测试的革兰氏阴性菌的cfu计数结果被视为0。
[0251]
此外，根据融合多肽lnt103的浓度和/或处理时间测试其对革兰氏阴性菌的杀伤能力。具体而言，将浓度为0.1、0.3、0.9或2.7μm的融合多肽lnt103，以及铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)或鲍曼不动杆菌(atcc 19606)1
×
106cfu添加到反应缓冲液(20mm tris cl，ph7.5)中，使最终体积为200μl，将其在37℃下放置2小时，然后确认菌落数，结果如图17的a所示。
[0252]
此外，将浓度为2μm的融合多肽lnt103和1
×
106cfu的铜绿假单胞菌(pao1；atcc 15692)添加到反应缓冲液(20mm tris-cl，ph7.5)中，使最终体积为200μl，在37℃的0、20分钟、40分钟和60分钟内确认菌落数量，结果如图17的b所示。
[0253]
此外，将浓度为1μm的融合多肽lnt103和1
×
106cfu的鲍曼不动杆菌(atcc 19606)添加到反应缓冲液(20mm tris-cl，ph7.5)中，使最终体积为200μl，在37℃的0、1分钟、3分钟、5分钟和10分钟内确认菌落数，结果如图17的c所示。
[0254]
如图17的a、b和c所示，已证实融合多肽lnt103以浓度和时间依赖性方式对革兰氏阴性菌具有杀伤能力(在图17的a、b和c中，未表示条形图的部分表示log cfu/ml值为0，表示所有处理的细菌都被杀死)。
[0255]
此外，测定了融合多肽lnt103的mic(最小抑制浓度)和mbc(最小杀菌浓度)。根据clsi(临床和实验室标准研究所)的标准测试方法，通过肉汤微量稀释技术进行mic和mbc，并在相应的测试方法中，使用caa培养基(酪蛋白氨基酸5g/l，k2hpo
4 5.2mm，mgso
4 1mm)代替m汤(酪蛋白酸水解产物17.5g/l，牛肉提取物3.0g/l，淀粉1.5g/l，ph 7.3)进行(临床和实验室标准研究所，有氧生长细菌的稀释抗菌药物敏感性试验方法；批准标准(methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacterium that grow aerobically；approved standard.)，第11版，文件m07，wayne，pa：clsi；2018)。具体而言，在96孔微孔板a行中以64μg/ml的浓度处理lnt103，在b-g行中以1/2进行连续稀释的浓度处理lnt103。在h行中，不处理lnt103。之后，以5
×
105cfu/ml的量处理相应的细菌菌株(类型或qc、ccarm和临床分离菌株；见表2-4)，在所有孔中总量为100μl。然后在37℃培养18小时。通过确认每个孔中的菌落数，确定mic为未鉴定菌落的最低浓度。所得结果如下表7至表9所示：
[0256]
【表7】
[0257][0258]
【表8】
[0259][0260][0261]
【表9】
[0262][0263]
3.5.融合多肽lnt103与多粘菌素抗生素联合使用对革兰氏阴性菌的杀伤能力的协同作用
[0264]
证实了具有作用于细菌细胞膜机制的多粘菌素基抗生素与融合多肽lnt103的联合对革兰氏阴性菌的杀伤能力的协同作用。具体来说，将16μl/ml的粘菌素(多粘菌素e)处理至96孔微孔板的第1列，并在第2-11列中按1/2进行连续稀释的浓度下处理。将16μg/ml的lnt103处理到a行，并在b-g行按1/2连续稀释的浓度下进行处理。之后，将鲍曼不动杆菌(atcc19606)以5
×
105cfu/ml的量处理，在所有孔中总量为100μl。然后，将其在37℃下培养18小时，并通过以下公式计算fic(分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration))指数值：
[0265]
fic指数＝fica+ficb＝(ca/mica)+(cb/micb)
[0266]
(ca和cb是联合处理的每种物质的浓度(多粘菌素e和lnt103)，mica和micb是单一药物的mic，
[0267]
fic值：协同作用＜0.5；拮抗作用＞4；相加作用：0.5-4)
[0268]
测试结果表明，fic指数为0.375，证实两种物质之间存在协同作用。
[0269]
3.6.融合多肽lnt103的体外毒性评价
[0270]
融合多肽lnt103的体外毒性通过使用huh-7细胞系的细胞毒性测定(wst wst assay)和使用羊血(mb细胞)的溶血测定进行评估。
[0271]
细胞毒性测定的进展过程如下。制备huh07细胞培养液，并在96孔板中按每孔1
×
109个细胞的量等分，并在co2培养箱中培养24小时。然后，pbs作为阴性对照和1％(w/v)triton x-100作为阳性对照进行处理，作为实验组，以0.25、0.5或1mg/ml的浓度处理融合多肽lnt103，然后将其放置在co2培养箱中24小时和48小时。然后，使用d-plus
tm cck细胞活
力测定试剂盒(dongin ls)测量细胞活力，结果如图18所示。如图18所示，与阴性对照(pbs)相比，当融合多肽lnt103在0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的浓度下处理24小时时，分别显示93％、90％、78％的细胞活力；当其处理48小时时，与阴性对照相比，分别显示108％、105％、86％的细胞活力。换言之，在处理融合多肽lnt103的情况下，与对照组(pbs)相比，证实其显示约80％或更高的细胞活力，因此，可以证实细胞毒性相对较低。根据该结果，证实lnt103的ic50＞1mg/ml。
[0272]
溶血测定的进展过程如下。混合3ml羊血和14ml pbs(ph 7.2)后，在1000g、4℃下离心5分钟以去除上清液。之后，再次填充pbs至去除体积，并将上述洗涤总共进行4次。去除通过洗涤溶解的血红蛋白，最后一次离心后，将400μl凹陷的红细胞(红细胞)溶解在9.6ml pbs中，制成4％(v/v)的血液溶液。在96孔微孔板中混合50μl样品和50μl 4％(v/v)血液溶液后，在37℃下反应1小时。对于实验组，在2倍稀释范围内(pbs，ph 7.2)将融合多肽lnt103从128μg/ml处理至2μg/ml，对于阳性对照组，0.1％(w/v)triton x-100，对于阴性对照组，处理pbs。反应1小时后，将微孔板在1000g、4℃下离心5分钟，收集50μl上清液，将其转移到新的微孔板上，并在570nm处测量吸光度(infmite m200 pro，tecan)。获得的结果如图19所示。如图19所示，证实融合多肽lnt103在所有测试浓度下均未显示溶血活性。根据该结果，证实lnt103的mhc(最小溶血浓度)大于128μg/ml。
[0273]
3.7.融合多肽lnt103的体内有效性评价
[0274]
为了评估融合多肽lnt103的体内有效性，基于鲍曼不动杆菌atcc19606系统感染小鼠模型确认了其活性。
[0275]
进行动物实验的过程如下。当购买4周龄icr雄性小鼠并经过一周的适应期时，使用小鼠，5-6周龄时体重为20～21g。将不动杆菌属细菌与10％粘蛋白按1∶1混合，并将0.5ml 2
×
108cfu/ml(5％粘蛋白)的细菌溶液腹腔接种到小鼠体内。在感染后1小时和4小时内，分别通过皮下注射给予lnt103 20mpk和lnt103 100mpk，和作为对照组的粘菌素20mpk。之后，确认96小时的生存能力，结果如图20所示。如图20所证实的，与未给药组(对照组)和比较组(粘菌素给药组)相比，将lnt103给予全身感染小鼠模型中的组显示出更高的活力，并且lnt103以浓度依赖性方式显示出高活力，因此，证实，在相应的小鼠模型中存在这种作用。
[0276]
从以上描述中，本技术所属领域的技术人员将能够理解，本技术可以以其他特定形式执行，而不改变其技术精神或基本特征。在这方面，应当理解，上述实施例在所有方面都是说明性的，而不是限制性的。本技术的范围应解释为，从下文描述的权利要求的含义和范围以及等效概念(而非详细描述)衍生的所有更改或修改的形式都包括在本技术的范围内。
技术特征：
1.一种多肽，包含seq id no：1或seq id no：6的氨基酸。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽具有内溶素活性。3.一种多核苷酸，编码权利要求1所述的多肽。4.根据权利要求3所述的多核苷酸，包含seq id no：2或seq id no：7的核酸序列。5.一种重组载体，包含权利要求3所述的多核苷酸。6.一种重组细胞，包含权利要求3所述的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体。7.一种噬菌体，包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含seq id no：1的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的噬菌体，其中，编码包含seq id no：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸包含seq id no：2的核酸序列。9.根据权利要求7或8所述的噬菌体，其中，所述噬菌体具有抗假单胞菌属细菌的抗菌活性。10.一种融合多肽，包括：杀菌肽a和seq id no：1或seq id no：6的多肽。11.根据权利要求10所述的融合多肽，其中，杀菌肽a由seq id no：8的氨基酸序列表示。12.根据权利要求10所述的融合多肽，其中，杀菌肽a和seq id no：1或seq id no：6的多肽以从n-端开始的顺序连接。13.根据权利要求10所述的融合多肽，其中，杀菌肽a和seq id no：1或seq id no：6的多肽通过肽接头连接。14.根据权利要求10所述的融合多肽，其由seq id no：10或seq id no：13的氨基酸序列表示。15.一种编码权利要求10至14中任一项所述的融合多肽的多核苷酸。16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其由seq id no：11或seq id no：14的核酸序列表示。17.一种重组载体，其包含权利要求15所述的多核苷酸。18.一种重组细胞，其包含权利要求15所述的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体。19.一种抗生素，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：根据权利要求1所述的多肽，根据权利要求10至14中任一项所述的融合多肽，编码所述多肽的多核苷酸，编码所述融合多肽的多核苷酸；包含编码所述多肽的多核苷酸的重组载体，包含编码所述融合多肽的多核苷酸的重组载体；和包含所述多核苷酸或所述重组载体的重组细胞。20.根据权利要求19所述的抗生素，其进一步包含多粘菌素基抗生素。21.根据权利要求20所述的抗生素，其中，所述多粘菌素基抗生素为多粘菌素b、粘菌素或其组合。22.根据权利要求19所述的抗生素，其具有抗革兰氏阴性菌的抗菌活性。
23.根据权利要求22所述的抗生素，其中，所述革兰氏阴性菌为选自由假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌、埃希氏杆菌属细菌、肠杆菌属细菌和克雷伯菌属细菌组成的组中的一种或多种。24.根据权利要求23所述的抗生素，其中，所述假单胞菌属细菌为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，所述不动杆菌属细菌为鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)，所述埃希氏杆菌属细菌为大肠杆菌(escherichia coli)，所述肠杆菌属细菌为产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)，所述克雷伯菌属细菌为肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)。25.一种用于预防或革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物组合物，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：根据权利要求1所述的多肽，根据权利要求10至14中任一项所述的融合多肽，编码所述多肽的多核苷酸，编码所述融合多肽的多核苷酸；包含编码所述多肽的多核苷酸的重组载体，包含编码所述融合多肽的多核苷酸的重组载体；和包含所述多核苷酸或所述重组载体的重组细胞。26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中，所述革兰氏阴性菌选自由假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌、埃希氏杆菌属细菌、肠杆菌属细菌和克雷伯菌属细菌组成的组中的一种或多种。27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述假单胞菌属细菌为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，所述不动杆菌属细菌为鲍曼不动杆菌(acmetobacter baumannii)，所述埃希氏杆菌属细菌为大肠杆菌(escherichia coli)，所述肠杆菌属细菌为产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)，所述克雷伯菌属细菌为肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)。28.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述革兰氏阴性菌为假单胞菌属细菌，由假单胞菌属细菌引起的疾病为皮肤感染、褥疮、肺炎、菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髓炎、肠炎、腹膜炎或囊性纤维化。29.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述革兰氏阴性菌为不动杆菌属细菌，由不动杆菌属细菌引起的疾病为皮肤感染、肺炎、菌血症或败血症。30.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述革兰氏阴性菌为埃希氏杆菌属细菌，由埃希氏杆菌属细菌引起的疾病为肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、尿路感染、皮肤感染、菌血症或败血症。31.一种饲料添加剂，包含权利要求19所述的抗生素。32.一种消毒剂，包含权利要求19所述的抗生素。33.一种洗涤剂，包含权利要求19所述的抗生素。
技术总结
本发明提供了一种新型多肽、包含该多肽的融合多肽及其作为抗生素的用途。更具体地说，提供了一种衍生自噬菌体的新型多肽、包含杀菌肽A的新型融合多肽和包含该多肽和/或融合多肽的抗革兰氏阴性菌的抗生素。肽的抗革兰氏阴性菌的抗生素。肽的抗革兰氏阴性菌的抗生素。
