靶向GPRC5D的嵌合抗原受体及其用途的制作方法
靶向gprc5d的嵌合抗原受体及其用途
1.本发明要求在2021年5月23日提交中国专利局、申请号为202110561829.9、申请名称为“靶向gprc5d的嵌合抗原受体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明涉及细胞领域，进一步地，本发明涉及靶向g蛋白偶联受体c5家族亚型d(gprc5d)的嵌合抗原受体及其制备方法和应用。
背景技术：
3.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)t细胞疗法是将识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scfv)与t细胞激活结构域相结合，使t细胞表达嵌合抗原受体，从而识别并结合肿瘤表面抗原，诱导t细胞活化、分泌细胞因子进而杀伤肿瘤细胞。在b淋巴细胞瘤与急性淋巴细胞白血病的中疗效显著[1]。
[0004]
g蛋白偶联受体c5家族亚型d(gprc5d)是最早于2001年鉴定出的孤儿非典c类gpcr[2]。gpcr家族c组5受体(gprc5受体)共有4种亚型，即gprc5a、gprc5b、gprc5c和gprc5d，它们由视黄酸诱导表达，所以也称为视黄酸诱导的孤儿g蛋白偶联受体(raig)[3]。gprc5d在多发性骨髓瘤的浆细胞中高表达，在正常组织中基本不表达，仅在具有免疫赦免性的毛囊区域有表达[4]。研究报道，gprc5d的高表达与多发性骨髓瘤的不良预后相关[5]。靶向gprc5d的car-t在小鼠多发性骨髓瘤(mm)模型中表现出良好的效果。由于gprc5d与bcma的表达并不重合，对于bcma丢失的肿瘤复发模型，gprc5d car-t仍有效果[4]。在gprc5d阳性的小鼠mm模型中，gprc5d/cd3双抗可招募t细胞并诱导肿瘤消退[6]。
[0005]
gprc5d是一种有望用于mm免疫的表面抗原，但目前大多数gprc5d药物还处于临床试验阶段或者研发阶段，还没有靶向gprc5d的细胞药物上市，因此，有必要开发具有更高活性和效果的gprc5d细胞药物，以进行相关疾病的研究和应用。
[0006]
参考文献：
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技术实现要素：
[0013]
本发明的第一个目的在于提供一种嵌合抗原受体，其包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含gprc5d抗体轻链可变区与gprc5d抗体重链可变区，其中，所述gprc5d抗体轻链可变区包含下组序列中的任意一个：seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:39、seq id no:41和seq id no:43；
[0014]
所述gprc5d抗体重链可变区包含下组序列中的任意一个：seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:38、seq id no:40和seq id no:42。
[0015]
在本发明的一个具体实施方案中，所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:3且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:4，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:5且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:6，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:7且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:8，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:9且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:10，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:11且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:12，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:38且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:39，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:40且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:41，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:42且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:43。
[0016]
在本发明的一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和细胞内结构域。
[0017]
在本发明的一个具体实施方案中，所述gprc5d抗体重链可变区和所述gprc5d抗体轻链可变区之间包含接头，所述接头优选为连接肽，所述连接肽的序列优选为(ggggs)n，其中n大于或等于1，优选为1、2、3、4或5，更优选地，n为3；
[0018]
或者，所述接头的序列为egkssgsgseskvd、kesgsvsseqlaqfrsld、ggrrgggs、lrqrdgerp、lrqkdgggserp或gstsgsgkpgsgegstkg。
[0019]
在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域还包含前导肽和铰链区。
[0020]
在本发明的一个具体实施方案中，所述前导肽序列为igg1重链信号多肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(gm-csfr2)信号肽或cd8α信号肽，和/或所述铰链区为cd8α、igg1或igg4的ch2和ch3，cd4，cd28或cd7。
[0021]
在本发明的一个具体实施方案中，所述跨膜结构域为下组中的任意一种或多种：t细胞受体的α、β或δ链、cd3ε、cd3δ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd 154和pd1，和/或所述细胞内结构域为下组中的任意一种或多种：card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134、cd137(4-1bb)、cd3ζ、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、trim和zap70。
[0022]
在本发明的一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:44所示的前导肽、gprc5d抗体轻链可变区、seq id no:45所示的连接肽、gprc5d抗体重链可变区、seq id no:46所示的铰链区、seq id no:47所示的cd8α跨膜结构域、seq id no:48所示的4-1bb共刺激信号传导区以及seq id no:49所示的cd3ζ信号传导结构域。
[0023]
在某些实施方式中，本技术所述的嵌合抗原受体的胞内结构域可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，所述一个或多个共刺激信号传导结构域还可以来自选自由以下组成的组的共刺激分子：card11、cd2、cd3ζ、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c slp76、trim和zap70。
[0024]
在特定实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域来自选自由以下组成的组的共刺激分子：cd28、cd134和cd137。
[0025]
在另外的实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域来自选自由以下组成的组的共刺激分子：cd137和cd3ζ。
[0026]
在另外的实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域来自cd28。
[0027]
在特定实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域来自cd134。
[0028]
在其它实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域来自cd137。
[0029]
本发明还提供了前述嵌合抗原受体用于制备药物或药物组合物的用途。
[0030]
在本发明的一个具体实施方案中，所述药物或药物组合物用于肿瘤。
[0031]
在本发明的一个具体实施方案中，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤。
[0032]
本发明还提供了一种多核苷酸，其编码前述的嵌合抗原受体。
[0033]
在一些具体实施例中，编码本文所涵盖的car的多核苷酸包含优化的kozac序列。
[0034]
在其它实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的所述启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(cmv)、延伸因子1α启动子(ef1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(pgk)、泛素-c启动子(ubq-c)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(cag)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(mc1)、β肌动蛋白启动子(β-act)、猿猴病毒40启动子(sv40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(mnd)启动子。
[0035]
本发明还提供了一种载体，其包含前述的多核苷酸。
[0036]
在某些实施例中，所述载体是表达载体。
[0037]
在另外的实施例中，所述载体是游离型载体。
[0038]
在特定实施例中，所述载体是病毒载体。
[0039]
在其它实施例中，所述载体是逆转录病毒载体。
[0040]
在其它实施例中，所述载体是慢病毒载体。
[0041]
在另外的实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(hiv)、人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。
[0042]
在特定实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒ltr、psi(ψ)包装信号、中心多嘌呤段/dna瓣(cppt/flap)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒ltr。
[0043]
在某些实施例中，所述5'ltr的启动子经异源启动子置换。
[0044]
在其它实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，rsv)启动子或猿猴病毒40(sv40)启动子。
[0045]
在特定实施例中，所述5'ltr或3'ltr是慢病毒ltr。
[0046]
在特定实施例中，所述3'ltr包含一个或多个修饰。
[0047]
在一些实施例中，所述3'ltr包含一个或多个缺失。
[0048]
在某些实施例中，所述3'ltr是自我失活(sin)ltr。
[0049]
本发明还提供了一种免疫效应细胞，其包含前述的多核苷酸或前述的载体。
[0050]
在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫效应细胞为t细胞。
[0051]
在各种实施例中，提供了一种免疫效应细胞，其包含本文所涵盖的载体。在各种实施例中，所述免疫效应细胞经本文所涵盖的载体转导。
[0052]
在其它实施例中，所述免疫效应细胞选自由以下组成的组：t淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤(nk)细胞。
[0053]
在各种实施例中，提供了一种生成包含本文所涵盖的car的免疫效应细胞的方法，其包含将包含编码所述car的多核苷酸的载体引入到免疫效应细胞中。
[0054]
在其它实施例中，所述免疫效应细胞为pd1基因敲除的细胞。
[0055]
在某些实施例中，通过电转的方式在所述t细胞中导入靶向pd1的sgrna、cas9蛋白和含gprc5d car序列的双链dna实现car元件在t细胞pd1基因位点的精准插入，从而获得靶向gprc5d非病毒pd1定点整合car-t细胞，提高靶向杀伤肿瘤的效果。
[0056]
需要说明的是，还可以通过以上方式在所述t细胞中导入靶向t细胞内其他基因的sgrna，获得靶向gprc5d在其他基因上定点整合的car-t细胞，提高靶向杀伤肿瘤的效果。
[0057]
本发明还提供了一种药物组合物，其包含前所述的嵌合抗原受体、多核苷酸、载体或宿主细胞。
[0058]
在本发明的一个具体实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
[0059]
在本发明的一个具体实施方案中，所述药学上可接受的辅料为柠檬酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘露醇吐温20、吐温60、吐温80、氯化钠、和注射用水中的一种或多种。
[0060]
在一个实施例中，car包含如seq id no:3和seq id no:4，或seq id no:5和seq id no:6，或seq id no:7和seq id no:8，或seq id no:9和seq id no:10，或seq id no:11和seq id no:12，或seq id no:38和seq id no:39，或seq id no:40和seq id no:41，或seq id no:42和seq id no:43中所阐述的氨基酸序列。
[0061]
在各种实施例中，提供了一种多核苷酸，其编码本文所涵盖的car。
[0062]
在各种特定实施例中，提供了一种编码car的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列阐述于seq id no:50和seq id no:51，或seq id no:52和seq id no:53，或seq id no:54和seq id no:55，或seq id no:56和seq id no:57，或seq id no:58和seq id no:59，或seq id no:60和seq id no:61，或seq id no:62和seq id no:63，或seq id no:64和seq id no:65中。
[0063]
在各种某些实施例中，提供了一种载体，其包含编码本文所涵盖的car的多核苷酸或如seq id no:50和seq id no:51，或seq id no:52和seq id no:53，或seq id no:54和seq id no:55，或seq id no:56和seq id no:57，或seq id no:58和seq id no:59，或seq id no:60和seq id no:61，或seq id no:62和seq id no:63，或seq id no:64和seq id no:65中所阐述的多核苷酸。
[0064]
在各种实施例中，提供了一种有需要的受试者的b细胞相关病况的方法，其包含向所述受试者施予有效量的组合物，所述组合物包含本文所涵盖的gprc5d car t细胞和任选地药学上可接受的赋形剂。在其它实施例中，所述b细胞相关病况是多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、恶性潜能不确定的b细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生病症、免疫调节病症、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(chagas'disease)、格雷弗氏病(grave's disease)、韦格纳氏肉牙肿病(wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦氏综合征(sjogren's syndrome)、寻常天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、anca相关血管炎、古德帕斯丘氏病(goodpasture'sdisease)、川崎病(kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血和快速进行性肾小球肾炎、重链病、原发性或免疫细胞相关的淀粉样变性或意义未确定的单克隆丙种球蛋白病。
[0065]
在其它实施例中，所述b细胞相关病况是b细胞恶性肿瘤。
[0066]
在某些实施例中，所述b细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(mm)或非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)。
[0067]
在某些实施例中，所述mm选自由以下组成的组：明显多发性骨髓瘤、郁积性多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨骼浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
[0068]
在一些实施例中，所述nhl选自由以下组成的组：伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(cll/sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体b成淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
[0069]
在特定实施例中，所述b细胞相关病况是浆细胞恶性肿瘤。
[0070]
在其它实施例中，所述b细胞相关病况是自身免疫疾病。
[0071]
在另外的实施例中，所述自身免疫疾病是全身性红斑狼疮。
[0072]
在某些实施例中，所述b细胞相关病况是类风湿性关节炎。
[0073]
在特定实施例中，所述b细胞相关病况是特发性血小板减少性紫癜或重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。
附图说明
[0074]
图1为本发明实施例4中靶向gprc5d靶标的嵌合抗原受体示意图；
[0075]
图2为本发明实施例7中靶向gprc5d靶标的嵌合抗原受体t细胞阳性率图；
[0076]
图3为本发明实施例8中靶向gprc5d靶标的鼠源嵌合抗原受体t细胞体外抗肿瘤效果图；
[0077]
图4为本发明实施例9中靶向gprc5d靶标的人源化嵌合抗原受体t细胞体外抗肿瘤效果图；
[0078]
图5为本发明实施例10中靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞和阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)的体外扩增速率和存活率结果图；
[0079]
图6为本发明实施例10中靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞和阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)的car阳性率流式细胞图；
[0080]
图7为本发明实施例10中靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞和阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)的ldh杀伤的细胞杀伤率结果图；
[0081]
图8为本发明实施例10中靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞和阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)的luciferase杀伤的细胞杀伤率结果图；
[0082]
图9为本发明实施例10中靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞和阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)的细胞因子的释放量结果图。
具体实施方式
[0083]
实施例1.人gprc5d表达载体及稳转细胞株的制备
[0084]
从ncbi数据库中获取编码人gprc5d基因cds区的碱基序列(nm_018654.1)，设计pcr引物1(seq id no:1)和引物2(seq id no:2)，选择高表达gprc5d的多发性骨髓瘤细胞系mm.1s(购自南京模式动物研究所)，和nci-h929(atcc)的cdna作为模板进行pcr扩增，限制性内切酶处理pcr产物和载体，t4连接酶连接后转染大肠杆菌dh5α，挑取单克隆进行测序。经测序验证序列正确性。成功构建的表达目的质粒的菌株，在培养基中培养并使用试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取质粒dna。选取生长状态良好的对数增长期的293t细胞，使用转染试剂pei共转染三质粒pspax2(购自clonetech)、pmd2.g(购自clonetech)和plvx-hugprc5d-ires-zsgreen1目的质粒。收集转染后48小时与72小时的病毒液，0.45μm针头滤器过滤病毒，按照moi＝10感染目的细胞。病毒感染48小时后换液。构建的细胞株通过流式细胞分析仪检测hgprc5d表达情况，hgprc5d稳定表达细胞株构建成功。
[0085]
实施例2.单克隆抗体的制备和抗体的筛选
[0086]
使用hgprc5d稳定表达的细胞株免疫小鼠，对小鼠进行眼眦采血，通过流式细胞分析仪检测小鼠血清效价。挑选效价最高且连续两次免疫效价趋于平稳的小鼠，在构建抗体库前腹腔注射进行一次冲击免疫。参照文献(krebber,a.,bornhauser,s.,burmester,j.,honegger,a.,willuda,j.,bosshard,h.r.,and pl
ü
ckthun,a.(1997).reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.journal of immunological methods 201,35-55.)的方法构建小鼠免疫噬菌体库，简言之处理小鼠，取脾脏并轻轻研碎，收集细胞，利用细胞裂解液裂解后提取细胞的总rna，反转录得到cdna，利
用小鼠特异性抗体重链可变区引物和轻链可变区引物，扩增抗体的可变区基因，并克隆到噬菌体展示载体上。对构建好的噬菌体展示库进行ngs测序、有限稀释法计数库容、pcr检测克隆阳性率等评价抗体库的多样性和有效性。对质控合格的噬菌体展示库制备噬菌体，使用hgprc5d稳定表达的细胞对预处理过的噬菌体上清进行富集淘选，dpbs洗去未结合的噬菌体后0.1m的hcl-glycine洗脱结合在细胞上的噬菌体，之后用tris-hcl中和洗脱液，取噬菌体侵染对数生长期的大肠杆菌，制备噬菌体用于下一轮淘选。挑选终止淘选的噬菌体侵染的大肠杆菌单克隆，接种于96孔板中，iptg诱导制备单链抗体(scfv)，通过流式细胞分析仪检测scfv与gprc5d高表达细胞系的结合情况。通过结合活性分析，优选了hts0370、hts0372、hts0373、hts0374和hts0375 scfv单链抗体进行后续的研究。经序列测定后，该5种抗体vh和vl序列及其cdr序列如下。
[0087][0088][0089]
no:47)、4-1bb共刺激信号传导区(seq id no:48)以及cd3ζ信号传导结构域(seq id no:49)。将上述序列依次连接得到嵌合抗原受体表达盒，分别命名为：0370嵌合抗原受体表达盒、0372嵌合抗原受体表达盒、0373嵌合抗原受体表达盒、0374嵌合抗原受体表达盒、0375嵌合抗原受体表达盒、0370z22嵌合抗原受体表达盒、0370z23嵌合抗原受体表达盒和0375z56嵌合抗原受体表达盒,表达盒结构如图1所示。在各表达盒最前端引入kozac序列(序列为gccacc)，全基因合成嵌合抗原受体表达盒的序列后，通过xbai/sali酶切位点连入空载体pcdh-ef1-msc-copgfp(购自长沙优宝生物科技有限公司)上，得到嵌合抗原受体表达载体,经测序验证正确后。使用质粒抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司无内毒素质粒抽提试剂盒)抽提质粒，分别获得质粒pcdh-ef1-car-gprc5d-0370-copgfp、
[0097]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0372-copgfp、pcdh-ef1-car-gprc5d-0373-copgfp、
[0098]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0374-copgfp、pcdh-ef1-car-gprc5d-0375-copgfp、
[0099]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0370z22-copgfp、
[0100]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0370z23-copgfp、
[0101]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0375z56-copgfp，以备感染使用。质粒抽提方法按说明书进行即可。
[0102]
实施例5.靶向gprc5d靶标的嵌合抗原受体的病毒的制备和浓缩
[0103]
pei法转染细胞。转染前24小时胰酶消化293t细胞，4e6的293t细胞铺在一个10cm细胞培养皿中，细胞在含有10％fbs的dmem培养基中培养，不超过24小时，当细胞达到60-80％密度时可转染。
[0104]
具体步骤如下：
[0105]
(1)将质粒，pei，dmem培养基置于室温5min；
[0106]
(2)取dmem 450μl于1.5ml ep管中，再加入50μl pei(1μg/μl)混匀，室温静置5min；
[0107]
(3)取10μg目的质粒(pcdh-ef1-car-gprc5d-0370-copgfp、
[0108]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0372-copgfp、
[0109]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0373-copgfp、
[0110]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0374-copgfp、
[0111]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0375-copgfp、
[0112]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0370z22-copgfp、
[0113]
pcdh-ef1-car-gprc5d-0370z23-copgfp、
[0114]
或pcdh-ef1-car-gprc5d-0375z56-copgfp)，10μg pspax2，5μg pmd2.g，加入dmem至500μl，混匀，室温静置5min；
[0115]
(4)将配好的步骤(2)的pei-dmem溶液加入到步骤(3)得到的含质粒的dmem中，混匀，室温静置20min；得到dna/pei混合物；
[0116]
(5)将1ml dna/pei混合物慢慢滴入293t细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育6-8h小时；
[0117]
(6)弃去原有培养基，更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育；
[0118]
(7)更换培养基48小时后，收集培养基，之后每皿各添加10ml新鲜培养基继续培养，24h后再次收集上清，与48小时收集的上清混合；
[0119]
(8)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
[0120]
(9)以0.45μm滤器过滤得到的上清；
[0121]
(10)将过滤后的上清进行切向流过滤；
[0122]
(11)将切向流过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000rpm离心2小时，用无血清培养基对超离后得到的病毒沉淀进行重悬，轻轻吹打直至完全溶解，得到病毒液；
[0123]
(12)将各病毒液分装，置于-80℃冰箱保存。
[0124]
消化并计数293t细胞，用含10％fbs的dmem培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4e5/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液。细胞贴壁培养8小时后，感染稀释100倍的病毒液1μl、10μl、20μl、30μl和50μl，24小时后换液，48小时后流式细胞分析仪检测293t细胞阳性率。经计算，病毒滴度在1e8 tu。
[0125]
实施例6.靶向gprc5d靶标的嵌合抗原受体t细胞制备
[0126]
使用抗凝管采集外周血约25ml，按照1：1的体积比加入到淋巴细胞分离液中，梯度离心25min，离心后取白膜层细胞，用dpbs洗两遍，得到人外周血单核细胞pbmc。重悬pbmc，调整密度为1e5/μl，按照50μl细胞悬液中加入cd4/cd8磁珠各10μl，通过磁极分离得到cd4
+
cd8
+
t细胞，加入含有10％fbs的aim-v完全培养基(购自gibco)培养，用抗人cd3/cd28抗体(购自美天旎生物科技公司)活化pbmc，il-2浓度为200iu/ml。活化24小时后换液，使用完全培养基继续培养。培养48小时后，调节t细胞密度为1e6/ml，按moi＝10病毒液感染，24小时后换液，得到可表达靶向人gprc5d抗原的嵌合抗原受体的t细胞。
[0127]
实施例7.靶向gprc5d靶标的嵌合抗原受体t细胞car表达阳性率检测
[0128]
在培养过程中，取病毒感染后72小时的t细胞，离心、重悬并调节细胞密度为1e6/ml，按1:100的比例稀释anti-fab抗体，冰上孵育30min后，dpbs清洗一次，重悬后流式细胞分析仪检测car-gprc5d的阳性率。结果显示，car高效表达在t细胞表面，结果见图2。
[0129]
实施例8.靶向gprc5d靶标的鼠源嵌合抗原受体t体外抗肿瘤效果
[0130]
取感染后72小时表达鼠源gprc5d嵌合抗原受体的t细胞及gprc5d阳性的骨髓瘤细胞nci-h929，计数并调节细胞密度为1e6/ml，按照效靶比5:1共培养，即：t细胞1x106，nci-h929 2x105，对照细胞为未经病毒感染处理的cd4
+
cd8
+
t细胞，记为ctrl细胞。分别在0小时、24小时和48小时(0h、24h和48h)使用抗体apc-conjugated human bcma antibody标记混合培养的细胞，流式分析细胞仪检测nci-h929细胞在总细胞中的比例，48小时，靶细胞在hts0370、hts0372、hts0373、hts0374和hts0375实验组分别降到4.00％、1.64％、2.93％、5.56％和4.40％，鼠源嵌合抗原受体t细胞体外抗肿瘤效果显著，结果见图3。
[0131]
实施例9.靶向gprc5d靶标的人源化嵌合抗原受体t体外抗肿瘤效果
[0132]
取感染后72小时表达人源化gprc5d嵌合抗原受体的t细胞及gprc5d阳性的骨髓瘤细胞nci-h929，计数并调节细胞密度为1e6/ml，按照效靶比1:2共培养，即：t细胞1x106，nci-h929 2x106，对照细胞为未经病毒感染处理的cd4
+
cd8
+
t细胞，记为ctrl细胞。分别在0小时、24小时、48小时和72小时使用抗体apc-conjugated human bcma antibody标记混合培养的细胞，流式分析细胞仪检测nci-h929细胞在总细胞中的比例，72小时，靶细胞在hts0370、hts0370z22、hts0370z23、和hts0375z56实验组分别降到5.33％、6.95％、9.85％和6.89％，人源化嵌合抗原受体t细胞体外抗肿瘤效果显著，其中效果最优的为人源化序列hts0370z22和hts0375z56,结果见图4。
[0133]
实施例10.非病毒pd1定点整合靶向gprc5d嵌合抗原受体t细胞制备和功能评价
[0134]
本实施例通过电转的方式，制备了靶向gprc5d非病毒pd1定点整合嵌合抗原受体t细胞(pd1-gprc5d-cart(z22)使用了本发明实施例3中提供的单链抗体序列hts0370z22，pd1-gprc5d-cart(bmk)使用了us20210393689a1专利中的抗体序列(vl氨基酸序列seq id no:66；vh氨基酸序列seq id no:67)作为阳性对照)。参照lonza电转试剂盒(v4xp-3024)说明书配制缓冲液并重悬t细胞，将靶向pd1的sgrna(sgrna的靶向序列seq id no:68)、cas9蛋白和含靶向gprc5d嵌合抗原受体元件的dna模板共孵育后加入进行电转。电转后，将细胞放入培养箱继续培养。电转后第1天、第3天、第5天、第7天检测pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)的体外扩增速率和存活率(图5)。在电转后第7天收集细胞，流式分析仪检测pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)的car阳性率(图6)。图6结果显示pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)中car元件整合率分别为5.08％、7.09％。取电转后第7天的pd1-gprc5d-cart(bmk)、pd1-gprc5d-cart(z22)和未处理t细胞(untreated t)按效靶比1:9、1:3、1:1与过表达gprc5d的肿瘤靶细胞k562-gpcr5d共培养，按照ldh杀伤检测试剂盒(cytotox non-radioactive cytotoxicity assay,promega,g1780)说明书操作并计算细胞杀伤率(图7)。图7结果显示相比于未处理的t细胞，pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)均表现出显著的杀伤效果，pd1-gprc5d-cart(z22)的抗肿瘤效果要优于阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)。取电转后第7天的pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)与过表达gprc5d的肿瘤靶细胞k562-gpcr5d按效靶比1:9、1:3共培养，按照luciferase杀伤检测试剂盒(bright-glo
tm luciferase assay system,promega,e2620)说明书操作并计算细胞杀伤率(图8)。图8结果显示pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)均表现出显著的杀伤效果，pd1-gprc5d-cart(z22)的抗肿瘤效果要优于阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)。取电转后第7天的pd1-gprc5d-cart(bmk)、pd1-gprc5d-cart(z22)和未处理t细胞(untreated t)按效靶比1:1与过表达gprc5d的肿瘤靶细胞k562-gpcr5d共培养，收集细胞上清液后分别按照人源il-2elisa检测试剂盒(elisa maxtm deluxe set human il-2,biolegend,431804)、人源tnf-αelisa检测试剂盒(elisa maxtm deluxe set human tnf-α,biolegend,430204)、人源ifn-γelisa检测试剂盒(elisa maxtm deluxe set human ifn-γ,biolegend,430104)说明书操作并计算各细胞因子的释放量(图9)。图9结果显示相比于未处理的t细胞，pd1-gprc5d-cart(bmk)和pd1-gprc5d-cart(z22)均能显著地分泌相关细胞因子。pd1-gprc5d-cart(z22)相对于pd1-gprc5d-cart(bmk)在细胞因子il-2、tnf-α、ifn-γ上均表现出更高的释放量。因此，从上述实施例结果显示pd1-gprc5d-cart(z22)较目前阳性对照pd1-gprc5d-cart(bmk)具有更好的杀伤效果。
技术特征：
1.一种嵌合抗原受体，其包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含gprc5d抗体轻链可变区与gprc5d抗体重链可变区，其中，所述gprc5d抗体轻链可变区包含下组序列中的任意一个：seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:39、seq id no:41和seq id no:43；所述gprc5d抗体重链可变区包含下组序列中的任意一个：seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:38、seq id no:40和seq id no:42。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:3且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:4，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:5且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:6，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:7且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:8，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:9且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:10，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:11且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:12，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:38且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:39，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:40且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:41，或所述gprc5d抗体重链可变区序列为seq id no:42且所述gprc5d抗体轻链可变区序列为seq id no:43。3.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和细胞内结构域。4.如权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，所述细胞外抗原结合结构域还包含前导肽和铰链区。5.如权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含seq id no:44所示的前导肽、gprc5d抗体轻链可变区、seq id no:45所示的连接肽、gprc5d抗体重链可变区、seq id no:46所示的铰链区、seq id no:47所示的cd8α跨膜结构域、seq id no:48所示的4-1bb共刺激信号传导区以及seq id no:49所示的cd3ζ信号传导结构域。6.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体用于制备药物或药物组合物的用途，优选地，所述药物或药物组合物用于肿瘤，更优选地，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤。7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体。8.一种载体，其包含如权利要求7所述的多核苷酸。9.一种免疫效应细胞，其包含权利要求7所述的多核苷酸或权利要求8所述的载体，优选地，所述免疫效应细胞为t细胞。10.如权利要求9所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞为pd1基因敲除的细胞。11.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞。
技术总结
本发明涉及细胞领域，进一步地，本发明涉及靶向G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)的嵌合抗原受体及其制备方法和应用，特别是其作为抗癌药物的用途。靶向G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)的嵌合抗原受体，其包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含GPRC5D抗体轻链可变区与GPRC5D抗体重链可变区。本发明将识别肿瘤表面抗原GPRC5D的单链抗体(scFv)与T细胞激活结构域相结合，使T细胞表达嵌合抗原受体，从而识别并结合肿瘤表面抗原，诱导T细胞活化、分泌细胞因子进而杀伤肿瘤细胞。在B淋巴细胞瘤与急性淋巴细胞白血病的中疗效显著。细胞白血病的中疗效显著。
