一种微藻细胞的破碎方法
1.本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种微藻细胞的破碎方法。
背景技术：
2.微藻是地球上广泛分布的一种能高效进行光合作用的微生物，具有体积小、繁殖快、环境适应性强和生物质产率高等特点，微藻体内含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、天然素、多糖等高附加值的物质，在食品、化妆品、生物能源、医疗等领域具有广阔的发展前景。然而微藻通常具有结构坚固的细胞壁，细胞壁主要由纤维素、果胶、木聚糖等物质构成，很难破除，作为细胞的保护层，细胞壁能有效阻止胞内物质释放，进而阻碍微藻胞内活性物质的提取研究，因此有效破碎细胞是微藻研究领域的关键。
3.目前微生物细胞壁破碎方法包括物理方法、化学方法和生物方法。其中物理方法包括珠磨法、超声波破碎法、脉冲电场、反复冻融法、液氮研磨等，对粒径大的藻类破碎率一般可达70％以上，但是对粒径小且细胞壁厚的微藻细胞破碎往往不理想。化学方法包括酸热法、离子液体破壁法等，破碎率大约在60％左右，但是化学方法破碎微生物细胞的同时会产生热量，会影响细胞内物质活性，同时化学试剂也会对细胞内物质成分造成污染，影响其应用。生物方法包括酶溶法，条件温和，但耗时长，效率低。
技术实现要素：
4.针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的就在于提供一种微藻细胞的破碎方法，该破碎方法能高效破碎微藻细胞，且不会影响细胞内的活性物质。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种微藻细胞的破碎方法，先对含有微藻的藻液进行液氮研磨，研磨9～12min后再经过4～6次冻融，即获得破碎后的微藻细胞。
7.进一步地，具体步骤如下：
8.(1)含有微藻的藻液离心后去掉上清液，再加入0.01m的pbs磷酸缓冲溶液进行悬浮，然后转移至研钵；
9.(2)在研钵中加入液氮以使藻液冰冻，再使用经液氮冷却过的研磨棒研磨9～12min；
10.(3)将研磨后的藻液移至离心管中，并用pbs磷酸缓冲溶液定容后进行4～6次冻融，最后将冻融后藻液保存至-20℃的冰箱，黑暗下冷藏24h，取出后自然冷却，即得破碎后的微藻细胞。
11.进一步地，藻液中微藻细胞粒径为3～7μm，细胞密度约为45.1
×
105cells/ml。
12.进一步地，藻液为采用bg11培养基培养的铜绿微囊藻。
13.进一步地，步骤(2)中研磨的时间为10min。
14.进一步地，步骤(3)冻融次数为5次。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
16.1、微藻细胞壁较厚，虽然液氮研磨法可以破碎细胞壁，但是液氮研磨时间太久会破坏胞内物质，本发明先采用液氮研磨法破碎细胞壁，并通过控制研磨时间至9～12min，在保证破碎率的同时能有效避免微藻胞内物质被破坏，然后采用反复冻融的方法进一步裂解细胞，使得胞内物质自动溶出，进而能有效保证胞内物质结构的完整性。
17.2、本发明能有效提高微藻细胞的破碎率，其破碎率可达60％，并能有效缩短破碎时间，提高效率，且不会影响细胞内的活性物质。
附图说明
18.图1-实施例1和微藻细胞在显微镜下的细胞结构对比图
19.图2-实施例2～8以及对比实施例1～6在显微镜下的细胞结构对比图。
20.图3-实施例1以及对比实施例1～6藻胆蛋白含量测定结果。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
22.以下实施例和对比实施例均使用的铜绿微囊藻(fachb-905)，铜绿微囊藻购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，bg11培养基购自海博生物技术有限公司。将藻种按比例接种至bg11培养基中，于智能培养箱(宁波东南仪器有限公司，gxz+pgx)25℃进行培养，光照条件为2500lx，光暗比12h：12h，待藻类生长到对数增长期时进行实验。
23.实施例1
24.一种微藻细胞的破碎方法，具体包括下列步骤：
25.(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液，加入1ml的0.01m pbs磷酸缓冲溶液进行重悬；
26.(2)随后转移至研钵中进行液氮研磨10min；
27.(3)将研磨后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至4ml，随即放入液氮中进行冻融，待约30s后，取出藻液于流水中进行融化，反复进行5次；
28.(4)将冻融处理后的藻液放置-20℃冰箱黑暗冷藏24h；
29.(5)对破碎处理的细胞进行破碎率测定，取0.1ml的藻液于浮游植物计数框中，在20
×
10倍电子显微镜(bx53f，olymplus)下观察，使用万深algaec浮游生物鉴定计数软件进行拍照，对完整的细胞进行计数。细胞破碎率采用以下公式：
[0030][0031]
式中：ni—破碎前的细胞个数；
[0032]
nf—破碎后的细胞个数。
[0033]
实验设置三个平行样，结果取平均值。
[0034]
实施例2
[0035]
同实施例1，不同之处在于，本实施例研磨时间为5min。
[0036]
实施例3
[0037]
同实施例1，不同之处在于，本实施例研磨时间为8min。
[0038]
实施例4
[0039]
同实施例1，不同之处在于，本实施例研磨时间为9min。
[0040]
实施例5
[0041]
同实施例1，不同之处在于，本实施例研磨时间为11min。
[0042]
实施例6
[0043]
同实施例1，不同之处在于，本实施例反复冻融次数为3次。
[0044]
实施例7
[0045]
同实施例1，不同之处在于，本实施例反复冻融次数为4次。
[0046]
实施例8
[0047]
同实施例1，不同之处在于，本实施例反复冻融次数为6次。
[0048]
对比实施例1
[0049]
利用超声波破碎仪对微藻细胞进行破碎，具体步骤包括以下：
[0050]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，将离心管放入装有冰块的烧杯中冰浴；
[0051]
(2)将藻液放入超声破破碎仪中破碎，破碎条件为：200w，超声3s，间歇2s，共持续20min；
[0052]
(3)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0053]
对比实施例2
[0054]
利用反复冻融法对微藻细胞进行破碎，具体步骤包括以下：
[0055]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液；
[0056]
(2)将离心后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至4ml，随即放入液氮中进行冻融，待约30s后，取出藻液至流水中进行融化，反复进行5次；
[0057]
(3)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0058]
对比实施例3
[0059]
利用反复冻融法和超声波破碎法联合对微藻细胞进行破碎，具体步骤包括以下：
[0060]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液；
[0061]
(2)将离心后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至4ml，随即放入液氮中进行冻融，待约30s后，取出藻液至流水中进行融化，反复进行5次；
[0062]
(3)再将藻液进行超声波破碎，破碎条件为：200w，超声3s，间歇2s，共持续20min；
[0063]
(4)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0064]
对比实施例4
[0065]
利用液氮研磨法对微藻细胞进行破碎，具体步骤包括以下：
[0066]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液；
[0067]
(2)将离心后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至1ml重悬细胞，随即放入研钵中进行研磨，研磨前在藻液中加入适量液氮防止温度过高破坏藻细胞物质变性，研磨时间为10min，研磨后转移至离心管中，最后用pbs磷酸缓冲液洗涤容器并定容藻液至4ml；
[0068]
(3)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0069]
对比实施例5
[0070]
利用反复冻融联合研磨对微藻进行破碎，具体步骤包括以下：
[0071]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液；
[0072]
(2)将离心后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至4ml，随即放入液氮中进行冻融，待约30s后，取出藻液至流水中进行融化，反复进行5次；
[0073]
(3)将(2)中的藻液解冻后随即放入研钵中进行研磨，研磨时间为10min，研磨后转移至离心管中，最后用pbs磷酸缓冲液洗涤容器并定容藻液至4ml；
[0074]
(4)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0075]
对比实施例6
[0076]
利用研磨和超声波破碎法联合对微藻细胞进行破碎，具体步骤包括以下：
[0077]
(1)取对数增长期4ml藻液于10ml离心管中，在4℃，10000rpm进行10min离心，去掉上清液；
[0078]
(2)将离心后的藻液用pbs磷酸缓冲溶液定容至1ml重悬细胞，随即放入研钵中进行研磨，研磨前在藻液中加入适量液氮防止温度过高破坏藻细胞物质变性，研磨时间为10min，研磨后转移至离心管中，最后用pbs磷酸缓冲液洗涤容器并定容藻液至4ml；
[0079]
(3)再将藻液进行超声波破碎，破碎条件为：200w，超声3s，间歇2s，共持续20min；
[0080]
(4)得到后的细胞进行破碎率检测，步骤同实施例1中的步骤(5)。
[0081]
1、实施例1和微藻细胞在显微镜下的细胞结构对比图如图1所示，图1中(a)为未破碎前的细胞结构图，图1(b)为实施例1破碎后的细胞结构图。实施例2～8以及对比实施例1～6在显微镜下的对比图如图2所示，；图2(c)～(o)分别为实施例2～8以及对比实施例1～6破碎后的细胞结构图。
[0082]
2、实施例1～8以及对比实施例1～6微藻细胞破碎率的检测结果见表1。
[0083]
表1微藻细胞破碎率
[0084][0085]
由表1可知：(1)超声波破碎法、反复冻融法、液氮研磨法的破碎率分别为37.0
±
3.1、27.8
±
2.2和18.6
±
2.8％。液氮研磨和反复冻融结合法的破碎率可达60.5
±
1.1％，相对于超声波破碎法、反复冻融法和液氮研磨法，实施例1的破碎率分别提高了23.5％、32.7％以及41.9％。超声和反复冻融法结合可以提升破碎率至48.1
±
3.1％，但破碎率仍低于研磨和反复冻融结合法。
[0086]
(2)由实施例1～实施例5可见，随着研磨时间的增加，破碎率的增加弧度开始缓慢增加，到研磨时间为10min时，增幅较大，随后又缓慢增加，当研磨时间为10min时，能保证较高的破碎率和工作效率。
[0087]
(3)由实施例1、实施例6～8可知，随着反复冻融次数的增加，破碎率的增加弧度开始缓慢增加，到反复冻融次数为5次时，增幅较大，随后又缓慢增加，当反复冻融次数为5次时，能保证较高的破碎率和工作效率。
[0088]
3、藻胆蛋白是微藻细胞内中一种重要的光合素，由藻胆素和脱辅基蛋白共同构成，作为天然素可用于化妆品、染料、医疗等工业。藻胆蛋白的提取量可从侧面反映细胞破碎率的高低，因此对以上方法破碎的微藻细胞进行藻胆蛋白含量的测定。具体步骤包括以下：分别移取实施例1和对比实施例1～对比实施例6破碎的微藻细胞4ml于10ml离心管中，于4℃，10000rpm进行10min离心，用紫外可见分光光度计(tu-1950，北京普析)分别检测上清液在562nm、620nm、652nm处吸光度，计算藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)的浓度，计算公式如下：
[0089][0090][0091][0092]
不同破碎方法破碎藻细胞后，对藻胆蛋白含量测定结果如图3，超声组(对比实施例1)、冻融+超声组(对比实施例3)和超声+研磨组(对比实施例6)的测定结果较低，其次是冻融+研磨组(对比实施例5)，研磨+冻融组(实施例1)的含量最高，其pe、pc、apc的浓度分别为14.9
±
0.3、23.1
±
0.5和27
±
0.6μg/l。相比超声组(对比实施例1)、冻融组(对比实施例2)、冻融+超声组(对比实施例3)、研磨组(对比实施例4)和冻融+研磨组(对比实施例5)，本发明采用的研磨+冻融组提取的藻胆蛋白总含量分别提升了39.7、13.8、39.7、18.1和20.1μg/l，显著提升了藻胆蛋白的提取量。
[0093]
综上，对藻细胞破碎率和破碎后藻胆蛋白含量测定的结果显示，单独使用研磨和反复冻融方法破碎微藻细胞，破碎率较低，进而影响到胞内物质的提取；超声波以及超声波和冻融结合法虽然有较高的破碎率，但由于超声波破碎时会产生大量能量，导致胞内物质结构遭到破坏，影响物质的提取分析。虽然先反复冻融再研磨，也会有相对较高的破碎率，但是从藻胆蛋白的提取量相对较低，可能是反复冻融已经将细胞部分裂解，再研磨时会破坏细胞内的物质，进而影响了胞内物质的提取。本发明的研磨+反复冻融结合法能达到微藻细胞较高的破碎率，并且较其他几种传统方法，对胞内物质的提取率高。
[0094]
最后需要说明的是，本发明的上述实施例仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
技术特征：
1.一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，先对含有微藻的藻液进行液氮研磨，研磨9~12 min后再经过4~6次冻融，即获得破碎后的微藻细胞。2.根据权利要求1所述的一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）含有微藻的藻液离心后去掉上清液，再加入0.01 m的pbs磷酸缓冲溶液进行悬浮，然后转移至研钵；（2）在研钵中加入液氮以使藻液冰冻，再使用经液氮冷却过的研磨棒研磨9~12 min；（3）将研磨后的藻液移至离心管中，并用pbs磷酸缓冲溶液定容后进行4~6 次冻融，最后将冻融后藻液保存至-20 ℃的冰箱，黑暗下冷藏24 h，取出后自然冷却，即得破碎后的微藻细胞。3.根据权利要求2所述的一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，藻液中微藻细胞粒径为3~7 μm，细胞密度约为45.1
×
10
5 cells/ml。4.根据权利要求1或2所述的一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，藻液为采用bg11培养基培养的铜绿微囊藻。5.根据权利要求2所述的一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，步骤（2）中研磨的时间为10 min。6.根据权利要求2所述的一种微藻细胞的破碎方法，其特征在于，步骤（3）冻融次数为5 次。
技术总结
本发明公开了一种微藻细胞的破碎方法，该破碎方法是先对含有微藻的藻液进行液氮研磨，研磨9~12 min后再经过4~6次冻融，即获得破碎后的微藻细胞。具体步骤如下：（1）含有微藻的藻液离心后去掉上清液，再加入0.01 M的PBS磷酸缓冲溶液进行悬浮，然后转移至研钵；（2）在研钵中加入液氮以使藻液冰冻，再使用经液氮冷却过的研磨棒研磨9~12 min；（3）将研磨后的藻液移至离心管中，并用PBS磷酸缓冲溶液定容后进行4~6次冻融，最后将冻融后藻液保存至-20℃的冰箱，黑暗下冷藏24 h，取出后自然冷却，即得破碎后的微藻细胞。该破碎方法能高效破碎微藻细胞，且不会影响细胞内的活性物质。且不会影响细胞内的活性物质。且不会影响细胞内的活性物质。
