一种泌尿生殖系统疾病的治疗系统

本发明所属技术领域

本发明用于泌尿生殖系统疾病的。

与本发明相关的背景技术

泌尿生殖系统疾病通常累及男女两性，包括泌尿系统和生殖系 统的感染和/或炎症。例如，根据美国国家少儿健康和发育研究所 (ICHD)的统计，“大多数女性一生中至少患过一种类型的阴道 炎。”《阴道炎》(Vaginitis)，发表于《美国国家儿少健康和发育研 究所-在线刊物》(ational Institute of Child Health and Human Development-Publications On-line)，2000年1月12日修定， ＜http：//www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vag 1.html＞)。导致阴道 炎的原因包括从细菌、真菌或病毒感染到乳液、喷雾或者贴身衣物 所含的化学物质的刺激。同样地，对于有细菌和真菌感染的女性， 这些感染因素经常来自肛门区，从此处经过会阴到达阴道或尿道。

常见的一类阴道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白念珠菌 感染引起。念珠菌属于人体正常菌，存在于皮肤、口腔和消化道 (Robbins，《疾病的病理学基础》第五版(pathologic Basis of Disease 5th ed)，Saunders公司，费城(1994)p.354)，女性阴道也 可有少量存在。它们最适合的生长环境是诸如阴道或口腔的温暖潮 湿环境。念珠菌通常不致病，但当环境改变时，例如女性绝经后、 怀孕期、或应激时发生体内激素水平的改变，会过度繁殖造成酵母 菌感染。此情况也可见于免疫抑制或身体机能受损的个体，如接受 化疗、服用免疫抑制剂的病人，或艾滋病患者。

目前对于念珠菌感染的包括非处方药物，其活性成分如布 康唑硝酸盐(Femstat)、克霉唑(Gyne-Lotrimin及其它)、咪康唑 (Monistat及其它)和噻康唑(Vagistat)。这些药物作为阴道感染 的局部用药，可以裂解念珠菌的细胞壁。其它类似的包括处方 药物，其活性成分来自与氟康唑(Diflucan)、三康唑(Terazol) 和酮康唑(izoral)等同一系列。

虽然通常的观点认为阴道炎与念珠菌有关，但据ICHD的调 查(《阴道炎》(Vaginitis))，实际上细菌性阴道炎是育龄妇女最常 见的阴道感染疾病。阴道内的细菌过度繁殖会导致与念珠菌性阴道 炎相似地细菌性阴道炎，其药物不同。

另一方面，男性阴茎也可以感染念珠菌，累及阴茎头和包皮。 阴茎头包皮炎是阴茎头和包皮的非特异性感染，由多种微生物引 起，包括真菌(如念珠菌)和化脓性细菌(如葡萄球菌)(Robbins， 《疾病的病理学基础》第五版(Pathologic Basis of Disease 5th ed).， Saunders公司，费城(1994)p.1008)。

葡萄球菌为革兰氏染阳性细菌，通常存在于人体的皮肤和其 它粘膜。特别值得一提的是金黄葡萄球菌，为毒性致病源，可以 引起皮肤损伤、心内膜炎、呼吸系统感染、食物中毒、甚至中毒性 休克综合征等多种病症。对于采用高吸收性月经棉条的女性而言， 金黄葡萄球菌可以在阴道内形成菌落，并分泌一种称为中毒性休 克综合征毒素(TSST-1)的毒素。据FDA的统计，目前报导的大 约半数中毒性休克综合征病例与月经期棉条关，多为年轻女性(《月 经棉条与石棉、二恶英以及中毒性休克综合征》(Tampons and Asbestos，Dioxin，&Toxic Shock Syndrome)，FDA设备与放射健康中 心(July 23，1999)，＜http：//www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html＞)。

金黄葡萄球菌感染一般用甲氧西林(methicillin)。此药 虽然很有效，但金黄葡萄球菌的一些菌株已经产生抗药性，只有 少数抗生素能有效耐甲氧西林的金黄葡萄球菌(MRSA)。常 用于MRSA的抗生素之一是万古霉素(vancomycin)。但是， 现已发现对万古霉素敏感性下降的金黄葡萄球菌菌株(Khuishid， M.A.等，《对万古霉素敏感性下降的金黄葡萄球菌》 (Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin)， 发表于伊利诺斯1999《发病率与死亡率周报》(Morbidity and Mortality Weekly Report)，48(51)：1165-1167 (2000)，＜http：//www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm485 1al.htm＞)。抗药性菌株的出现使应用其他方法用于细菌感染成 为必要。

除真菌和细菌感染外，病毒性阴道炎也比较常见。此类感染大 多通过性交传播，包括单纯疱疹病毒(HSV)或人类乳头状病毒 (HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系统的入口处复制， 也感染支配生殖器的神经。为了躲避机体免疫系统，HSV病毒潜伏 在这些神经元中，在某些环境条件下活化，如应激、免疫抑制、放 射或病毒感染等。目前HSV感染的药物包括阿昔洛韦 (acyclovir)、法昔洛韦(famciclovir)、或伐昔洛韦(valacyclovir) 等。

对于泌尿系统，根据美国医药协会的调查数据，泌尿道感染 (UTIs)是促使就医的最常见疾患之一(《女性健康》－《尿道感 染：的患者指导》(Women’s Health，Urinary Tract infections：A Patient’s Guide to Treatment)，《在线健康信息-AMA健康透视》 (AMA Health Insight，On-line Health Information for Everyone)， 1998年10月30日更新，＜http：//www.ama-assn.org/insight/h_focus/ wom_hlth/uti/uti.html＞。此类感染性疾患主要是由埃希氏大肠杆菌 (E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有参与。同样地，这些感 染始于尿道，向膀胱发展引起膀胱炎。最后，病菌可沿输尿管上行 至双肾，导致肾盂肾炎。男性和女性均可感染。

既然泌尿-生殖系统疾病不局限于单一病因，那么目前的 就需要针对特定病因采用不同的药物。当然，要先确定病因。检测 病源需要时间，但更重要的是对女性要进行妇科检查以确定是否有 特异感染因素存在。

随着抗生素和其它药物应用的增加，耐甲氧西林金黄葡萄球 菌这类的微生物就越容易对目前所用药物产生抗药性。这样，就持 续需要新的广谱抗菌药物。

发明简述

本发明用于泌尿生殖系统疾病，它的一个方面涉及的由单 一或多种肽组成的用于泌尿生殖系统疾病的体系，其中多肽的 氨基酸序列有KPV(序列号1号)，MEHFRWG(序列号2号)， HFRWGK(序列号3号)，SYSMEHFRWGLPV(序列号4号)。单 个或多个多肽也可以通过上述氨基酸序列形成二聚体。泌尿生殖系 统疾病包括感染、炎症，或者二者兼有。在本发明的一个优选实施 例中，泌尿-生殖系统疾病包括阴道、外阴、尿道、阴茎和/或直肠 的感染和/或炎症。在另一个优选实施例中，单一或多种多肽溶于载 体内。在第三个优选实例中，一种或多种多肽与棉条结合，以避免 中毒性休克综合征。在第四个优选实施例中，一种或多种多肽与避 孕工具相结合，以防止性传播疾病或感染。在第五个实施例中，一 种或多种多肽与栓剂结合，以便于插入阴道或肛门。在本发明的第 六个实施例中，一种或多种多肽溶于液体载体中，以用于阴道灌注。

附图简要描述

图1：α-MSH和/或其衍生物对金黄葡萄球菌生长的抑制效 应。

图2：α-MSH和/或其衍生物对尿激酶(UK)诱导的金黄葡 萄球菌生长的影响。

图3：α-MSH和/或其衍生物对白念珠菌(C.albicans)生长 的抑制效应。

图4：α-MSH和/或其衍生物与氟康唑抗真菌活性的比较。

图5A-5D：α-MSH和/或其衍生物对白念珠菌芽管形成的 抑制效应。

图6：α-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的强化中性粒细胞杀伤 力的效应。

图7、8、9：α-MSH和/或其衍生物抑制白念珠菌生长的机 制。

图10-13：α-MSH和/或其衍生物对慢性感染细胞内病毒复制 和表达的抑制效应。

图14：α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制、表达和活化的机 制。

图15：α-MSH和/或其衍生物对急性感染细胞内病毒复制和表 达的抑制效应。

图16：用于本发明一方面的一种KPV二聚体形式的化学结构 示例。

发明详述

以下所引用的文献在此作为参考文献。本发明是关于采用α- 黑素细胞刺激素(α-MSH)和/或其衍生物泌尿生殖系统疾病 的一种方法和系统。α-MSH是经典的由13个氨基酸组成的肽(序 列号4号)，由较大的前体分子－－前黑阿皮素原经翻译后修饰产 生。它与同是来自前黑阿皮素原的促肾上腺皮质激素(ACTH)的 1-13氨基酸序列相同。许多种细胞均可分泌α-MSH，包括垂体细 胞、单核细胞、黑素细胞和角化细胞。α-MSH可见于大鼠皮肤、 人体表皮以及正常和垂体切除术大鼠消化道的粘膜屏障(可参阅： Eberie，A..，《促黑激素》(The Melanotrophins)，瑞士巴塞尔Karger (1998)；Lipton，J.m.等，《α-MSH神经免疫调质的抗炎影响》 (Anti-inflammatory influence of the euroimmunomodulatot α -MSH)，《今日免疫学》(Immunol.Today)18，140-145(1997)； Thody，A.J.等，《α-MSH的免疫反应性，在正常和垂体切除大鼠消 化道的分布》(Immunoreactiveα-Melanocyte Stimulating Hormone， Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact and Hypophysectomized Rats)，《生命科学》(Life.Sci.)18,2127-2132 (1981))。

现已知道α-MSH及其衍生物具有很强的解热和抗炎特性，而 且毒性极低。它可以降低宿主细胞的离体前炎症介质的产生，并且 可以降低动物炎症模型的局部和全身反应。例如，α-MSH的核心 序列(4-10)(序列号2号)具有学习和记忆行为效应，但解热和 抗炎活性很低。相反，解热和抗炎活性的活化信息序列位于α-MSH 的C-末端氨基酸序列，即赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(“Lys-Pro-Val” 或“KPV”)(序列号1号)。此三肽在体和离体情况下与母体分子 有相同的活性。α-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述两项专利 有阐述，并包括在所列的参考中：美国专利第5,028,592号，1991 年7月2日提交于Lipton，J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分 及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro Val Compositions and Method of Use)；美国专利第5,157,023号，1992 年10月20日提交于Lipton，J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分 及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro Val Compositions and Method of Use)。(参阅Catania，A.等，《α-MSH 对宿主机体反应的调节》(α-Melanocyte Stimulating Hormone in the Modulation of Host Reactions)，《内分泌综述》(endocr.Rev.) 14,564-576(1993)；Lipton，J.M.等，《α-MSH神经免疫调质的抗 炎影响》(Anti-inflammatory influence of the euroimmunomodulator α-MSH)，《今日免疫学》(Immunol.Today)18,140-145(1997)； Rajora，.等，《α-MSH产生受体及其对新喋呤的影响，在人单核/ 巨噬细胞系》(α-MSH Production Receptors and Influence on eopterin in a human Monocyte/macrophage Cell Line)，《白血病生 物学杂志》(J.Leukoc.Biol.)59,248-253(1996)；Star，R.A.等，《α -MSH对巨噬细胞一氧化氮合成酶自分泌调节的证明》(Evidence of Autocrine Modulation of Macrophage itric Oxide Synthase by α -MSH)，Proc.at’l.Acad.Sci.(USA).92,8015-8020(1995)；Lipton，J. M.等，《神经肽α-MSH在急慢性全身性炎症的抗炎作用》 (Anti-inflammatory Effects of the europtide α-MSH in Acute Chronic and systemic inflammation)，Ann..Y.Acad.Sci.741，137-148 (1994)；Fajora，.等，《α-MSH调节大脑炎症实验模型的局部和 循环肿瘤坏死因子-α》(α-MSH Modulation Local and Circulating Tumor ecrosis Factor αin Experimental Brain Inflammation)，《神 经科学杂志》(J.eurosci.)17,2181-2186(1995)；Richards，D.B. 等，《α-MSH(11-13)(lys-pro-val)对兔发热的作用》(Effects of α-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)on Fever in the Rabbit)，《肽 物质》5,815-817(1984)；Hiltz，M.E.等，《神经肽α-MSH COOH 末端片断的抗炎活性》(Anti-inflammatory of a COOH-teminal Fragment of the europtide α-MSH)，FASEB杂志3,2282-2284 (1989)。

除了抗炎和解热功能外，本发明的另一方面涉及α-MSH和/或 其衍生物的抗微生物和抗感染活性。如下所述，α-MSH和/或其衍 生物有重要的抗感染用途，包括如下的应用：降低微生物生存力， 降低酵母菌长芽，在不损害中性粒细胞对微生物的杀伤能力的情况 下杀伤微生物，与微生物感染有关的炎症而不降低微生物的杀 伤力，增加微生物细胞内cAMP的积累，抑制病毒性致病源的复制 与表达。

在本发明的首选实施例中，这些抗微生物或抗感染活性最主要 与C-末端氨基酸序列-KPV有关。此三肽与α-MSH及其衍生物在 很大浓度范围内均有效，包括通常存在于人体浆液的皮摩尔浓度。

正如在技术背景部分中所讨论的，泌尿生殖系统疾病并不局限 于单一病因。从细菌、真菌到病毒在内的多种微生物和感染因素可 以单独或联合引起多种病症，包括阴道炎、外阴炎、尿道炎、阴茎 头包皮炎、念珠菌病、行传播疾病以及中毒性休克综合征。α-MSH 和/或其衍生物可局部用于上述疾病状态的感染和/或炎症部位以达 到目的，可利用现有技术的施药方法。例如，α-MSH及其衍 生物可以溶于一些溶液中，诸如磷酸盐缓冲液、透明质酸、甲基纤 维素、羧甲基纤维素或乙醇。还可以用一般的载体，如油膏、油脂、 胶体、可溶性弹丸、气溶胶喷雾、栓剂、灌注所用液体溶剂或者具 吸收性的物质，携带α-MSH和/或其衍生物作为活性成分泌尿 生殖系统疾病。这些载体可用敷料器施用于感染或炎症部位，敷料 器可以是注射器或类注射器式的器具、绷带、导管、带活塞的管子、 涂药用抹刀或其它类型的平面敷料器、避孕套、海绵、棉签、或手 指。

更明确地说，本发明的一个优选实施例是将α-MSH和/或其衍 生物溶于以液体基底的载体。然后将溶有α-MSH和/或其衍生物的 载体储存于密封加压箱内。打开释放阀门或通过其它方式将载体从 密封加压箱内释放时，会形成气溶胶泡沫并被装进注射器和注射器 类的器具。接着，注射器部分插入阴道，其内容物也就释放入阴道 腔内。注射器或注射器类的器具及其开口也可以有不同的大小、形 状和长度，以插入不同的泌尿生殖区，如尿道或肛门。

本发明的另一个优选实施例为包含载体的栓剂。此载体如胶体 或甘油在常温下为固体或半固体，但是插入阴道或肛门后在体温下 便融化。载体融化后，携带所溶的α-MSH和/或其衍生物至泌尿生 殖系统疾病的发病部位。

我们采用油脂、油膏、胶体、喷雾、泡沫材料或止痛香膏等形 式将α-MSH和/或其衍生物涂于外阴、阴茎头和阴茎包皮等外生殖 器部分。其组分为本技术领域所熟知。

在本发明的另一方面，还可以在棉条的生产加工过程中用α -MSH和/或其衍生物进行处理。这样棉条中存在α-MSH和/或其衍 生物，可以抑制分泌中毒性休克综合征(TSST-1)的微生物的生长， 如金黄葡萄球菌。此种棉条的加工处理技术为本领域现有技术所 熟知。采用α-MSH和/或其衍生物处理的棉条吸收性材料进行治 疗，一种方法是将棉条的吸收性材料浸泡于含有α-MSH和/或其衍 生物的溶液，然后予以干燥。可供选择的另一种方法，是将α-MSH 以干燥粉末形式喷洒到棉条的吸收性材料上。

在本发明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可通过避孕工具 转运至感染部位，这些避孕工具包括避孕套、隔膜、海绵或其它用 于防止怀孕或性传播疾病的屏障型工具。α-MSH和/或其衍生物可 溶于避孕套所用的润滑剂以及与隔膜共同使用的胶质或泡沫材料， 或者溶于与避孕套、隔膜或海绵共用的任何类型的杀精子溶液。

在本发明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可溶于灌注用的 液体。这些液体可以通过灌注被转运至阴道以感染和/或炎症。

下述实施例阐明了α-MSH和/或其衍生物抗感染的效力及其应 用。实施例中所用的微生物学、分子生物学以及细胞培养的方法没 有在文中详细说明，但在科研文献中有大量的报导。本领域技术人 员熟知这些方法。

下述实施例中所用的肽类包括：α-MSH(1-13)(序列号4 号)、(4-10)(序列号002号)、(6-13)(序列号003号)、和(11 -13)(序列号1号)，均有乙酰化的末端和酰胺化的C末端，以 及促肾上腺皮质激素ACTH(1-39)和(18-39)(CLIP)。这些 肽类由固相肽合成方法制备，经保留相的高效液相普法纯化。部 分实施例还包括氨基酸序列CKPV(序列号8号)的二聚体(KPV 二聚体)，此二聚体同样也有乙酰化的末端和酰胺化的C末端。 图16显示了KPV二聚体的化学结构。在上述任意一种多肽的末 端加半胱氨酸，并使两个多肽的半胱氨酸形成二硫键，即可得到二 聚体。同源二聚体和异源二聚体均可由此方法获得。

下述实施例中所阐述的统计学意义采用方差的单因素分析和斯 氏t检验。概率大于0.05被认为是有显著性差异的。 实施例I

本实施例目的在于阐明α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特 性，这里选取金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为例。

金黄葡萄球菌培养物(ATCC 29213)由Ospedale Maggiore di Milano微生物学系提供。金黄葡萄球菌(于Hank平衡盐溶液中 1×106/毫升)在α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11- 13)(序列号1号)或KPV二聚体存在或缺如的情况下，37℃培养 2小时，肽的浓度为10-15-10-4M。随后细胞在冷蒸馏水中冲洗， 并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。将一微升的等分试样涂于血 浆琼脂板，37℃培养24小时。然后根据所形成的菌落评估微生物 的生存力。另一实验中是在细菌浓度为105/100毫升的培养液中加 入不同的肽段和500单位的尿激酶(金黄葡萄球菌的生长促进 剂)，并且在37℃水浴中振荡培养4小时。

图1表明α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13) (序列号1号)和KPV二聚体均抑制金黄葡萄球菌菌落的形成。 此抑制效应在很大浓度范围内均可发生，并在10-12-10-4M的浓度 范围内有显著性差异(p＞0.01)。图2说明了浓度为10-6摩尔/升的 α-MSH(1-13)(序列号4号)和α-MSH(11-13)(序列号1 号)明显抑制尿激酶的生长促进作用。这样，α-MSH或其衍生物 可以抑制金黄葡萄球菌的生长，此细菌会引起中毒性休克综合 症，该病征与月经棉条使用、阴道炎、泌尿道感染、以及阴茎头包 皮炎有关。

实施例II

本实施例的目的在于阐明α-MSH和/或其衍生物的抗真菌特 性，这里选取的实验菌株是白念珠菌(Candida albicans)。

白念珠菌的临床隔离株由Ospedale Maggiore di Milano微生 物学系提供。白念珠菌的培养在沙氏琼脂斜面板上进行，并周期 性地转移到沙氏琼脂板上，28℃培养48小时。为了制备静止期酵 母菌，从琼脂板上挑取菌落，将其转移到30毫升沙氏葡糖液体培 养基中，32℃培养72小时。将所得细胞以1000xg离心10分钟， 用蒸馏水冲洗沉积细胞两次。然后计数细胞个数，并悬浮于Hank 平衡盐溶液(HBSS)中至需要的浓度。通过0.01％的甲基蓝外排 实验，以此确定细菌的生存力。结果显示其生存能力大于98％。

在HBSS中密度为1×106/毫升时，这些真菌在α-MSH(1-13) (序列号4号)、α-MSH(11-13)(序列号1号)或KPV二聚体 存在或缺如的情况下，37℃培养2小时，肽的浓度为10-15-10-4M。 随后用冷蒸馏水冲洗细胞，并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。 将一毫升的等分样品涂于血浆琼脂板上，37℃培养48小时。微生 物的生存力根据所形成的菌落估计。

图3表明α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13) (序列号1号)和KPV二聚体在10-12-10-4M浓度范围内均抑制 白念珠菌菌落形成的能力(与对照相比p＜0.01)。此结果说明， α-MSH或其衍生物能够抑制白念珠菌的生长，此真菌是已知导 致念珠菌病、阴道炎、尿道炎和阴茎头包皮炎的因素。

实施例III

本实施例的目的在于比较α-MSH和/或其衍生物与氟康唑 (fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承认的抗真菌药物。

检测α-MSH(1-13)(序列号4号)、(4-10)(序列号2号)、 (6-13)(序列号3号)、(11-13)(序列号1号)和ACTH(1- 39)、(18-39)以及氟康唑在10-6-10-4M浓度下的抗白念珠菌 的能力，方法同实施例II。图4表明，与氟康唑相比，α-MSH(11 -13)(序列号1号)、(4-10)(序列号2号)、(6-13)(序列号3 号)和(1-13)(序列号4号)抗白念珠菌是非常有效的，其抑 制活性与等摩尔浓度的氟康唑是类似的。相比之下，具有行为效应 但极少抗炎活性的核心α-MSH序列(4-10)(序列号2号)产生 了近50％的对菌落形成单位抑制效应。虽然此抑制效应具有显著性 (与对照相比p＜0.01)，但是明显弱于含有KPV信号序列的α-MSH 片断，这些KPV信号序列包括α-MSH(6-13)(序列号3号)、(11 -13)(序列号1号)(p＜0.01)，或者母体分子α-MSH(1-13) (p＜0.05)。图4也表明ACTH(1-39)及其片断(18-39)不能 降低白念珠菌的生存力。甚至在10-4M浓度下(图中未显示)， ACTH肽段也同样无效。

由此本实施例说明α-MSH或其衍生物在抑制白念珠菌生长 方面与氟康唑同样有效。

实施例IV

本实施例的目的在于阐明α-MSH及其衍生物对白念珠菌出 芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白念珠菌感染发病机理的 重要方面，包括粘附于宿主上皮和内皮细胞的过程，从椭圆形的芽 生孢子到各种丝状体的形态转变，如芽管、假菌丝、菌丝。(Gow， .A.，《白念珠菌芽管的生长》(Germ Tube Growth of Candida albicans)，《当代医学真菌话题》(Curr.Topics Med.Myco.)8,43-55 (1997))。

蒸馏水冲洗培养所得的静止期白念珠菌两次，然后将菌体悬 浮于HBSS中，密度为2×106/毫升。于此菌液中加入10％的灭活 马血清(由英国Paisley GIBCO/BRL提供)，37℃振荡培养45分钟， 可以诱导白念珠菌菌丝的生长。HBSS冲洗菌体两次以去除马血 清，然后在浓度为10-6M的α-MSH(1-13)(序列号4号)、(6 -13)(序列号3号)或(11-13)(序列号1号)存在的条件下， 37℃继续培养60分钟，并不断振荡。采用血细胞计数器在光学显 微镜下计算出丝状菌体的百分比。此实验以重复三次，至少计数了 200个细胞。采用装配在Axioskop Zeiss显微镜上的MC100相机拍 摄显微照片。

图5A至5D表明α-MSH(1-13)(序列号4号)或(11-13) (序列号1号)可以抑制由马血清诱导的白念珠菌芽管形成。α -MSH(1-13)(序列号4号)使丝状菌体数目降低28-32％，α -MSH(11-13)(序列号1号)导致丝状菌体数目降低54-58％。 虽然图中未显示，α-MSH(6-13)(序列号3号)同样可以引起 丝状菌体数目降低近50％。由此说明α-MSH或其衍生物通过抑制 芽管形成可以抑制念珠菌发病机理的一种模式。

实施例V

对病原体杀伤力的降低是感染期间应用皮质类固醇和其它非甾 体类消炎药物的负面作用(Stevens，D.L，《非甾体类消炎药物 (SAIDs)是否能促进细菌性感染发展为中毒性休克综合征》 (Could onsteriodal Anti-inflammatory Drugs(SAIDs)Enhance Progression of Bacterial Infections to Toxic Shoc Syndrome？)，《临床 感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)21,977-80(1997)；Capsoni，F.等， 《皮质类固醇对中性粒细胞功能的影响：抑制抗体依赖的细胞介导 的细胞毒性(ADCC)》(Effect of Corticosteriods on eutrophil Function：Inhibition of Antibody-dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC))，《免疫药理学杂志》(J.Immunopharmacol.) 5,217-30(1983))。本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物抑制感染 源的生长，而且不降低中性粒细胞抗感染的能力。本实施例进一步 表明α-MSH和/或其衍生物确实可以增强中性粒细胞杀伤感染源 的能力。

来自健康志愿者的静脉血(20毫升)肝素抗凝处理后，加入右 旋糖苷沉淀剂并采用Ficoll-Hypaque(购于美国密苏里州圣路易斯 的Sigma化学制剂公司)离心机离心分离中性粒细胞。低渗休克下 红细胞溶解，中性粒细胞则至少占细胞悬浮液的97％。由胎盘兰排 除法得到的细胞生存力大于98％。中性粒细胞再悬浮于HBSS中， 以用于实验。

将白念珠菌(1×106)与AB型血清置于37℃振荡水浴中调理 30分钟。随后，在单纯培养基上或含有浓度为10-15-10-4M的α-MSH (1-13)(序列号4号)或α-MSH(11-13)(序列号1号)培养 基上与中性粒细胞一起培养，于振荡水浴中37℃培养2小时。2小 时后，将培养管置于冰上以中断生长，冲洗细胞外生物体两次，并 4℃离心(1000xg)。于悬浮液中加入2.5％的脱氧胆酸钠溶液，振 荡试管5分钟。然后加入冷蒸馏水得到密度为106个细胞/毫升的菌 液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀释两次，从而得到密度为 100个细胞/毫升的菌液。从此菌液中取一毫升的等分样品涂于血琼 脂板，37℃培养48小时。48小时后选取三分之一计数菌落形成单 位，并采用五个不同个体来源的血浆重复计数。

图6表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)在10-12-10-4M浓度范围内(p＜0.01)确实能够增强中性 粒细胞对白念珠菌的杀伤力。同时图6表明它们在很大的浓度范 围内都可以促进中性粒细胞的杀伤力，即使是在相当于人血浆α -MSH浓度的皮摩尔浓度条件下。

由此本实施例说明α-MSH或其衍生物可以同时抗感染和炎 症，此特性也适用于念珠菌病、阴道炎、尿道炎、阴茎头包皮炎或 痔疮。 实施例VI

本实施例提示α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性的一般细 胞机制，以及抗真菌特性的特殊机制。

经甲苯/乙醇渗透作用的白念珠菌(106/毫升)，在10-6M浓 度的α-MSH(1-13)(序列号4号)、(11-13)(序列号1号)或 毛喉萜(forskolin)(已知能够增加细胞内cAMP)存在或缺失的条 件下，37℃下振荡培养。三分钟后加入用冰冷却的乙醇以中止反应。 cAMP水平由市售酶免疫试剂盒(购于英国Amersham)测定两次， 在测定之前根据产品说明通过液相方法对反应体系进行抽提。在另 一个相关实验中，白念珠菌暴露于浓度为25、50和1×10-5M的 双脱氧腺苷(ddAdo，Sigma)2小时，再与α-MSH或其衍生物作 用2小时。双脱氧腺苷是蛋白抑制剂，抑制腺苷酸环化酶。采用与 实施例II相同的方法测定毛喉萜和双脱氧腺苷对白念珠菌菌落 形成的影响。

图7表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)可提高白念珠菌内cAMP含量，其cAMP的增加量与等 摩尔毛喉萜诱导的增加量的数量级相同。图8显示与α-MSH(1- 13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)一样，毛喉萜也明 显抑制白念珠菌生长(与对照相比p＜0.01)。图9表明双脱氧腺 苷能过扭转α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号 1号)对白念珠菌生长的影响。

本实施例说明α-MSH及其衍生物抑制白念珠菌和其它微生 物生长的作用最可能是通过增加cAMP水平实现的，cAMP含量的 提高抑制mRA和蛋白合成(参阅Bhattacharya A.等，《cAMP对 白念珠菌RA和蛋白合成的作用》(Effect of Cyclic AMP on RA and Protein Synthesis in Candida albicans)，《生化与生理研究通讯》 (Biochem.Biophysics.Res.Commun.)77：1483-44(1997))。 实施例VII

本实施例阐明α-MSH或其衍生物抑制人体细胞内病毒复制的 能力，或者更确切地说，阐明α-MSH抑制慢性感染的人单核细胞 内HIV-1病毒的复制和表达。

HIV-1慢性感染的幼单核细胞U1细胞系是潜伏型单核细胞 HIV感染的体外模型。这些细胞携带两套整合的HIV原病毒拷贝， HIV的基本表达较低。但是，根据RA转录、p24抗原或逆转录酶 释放等测定的病毒复制可以被不同的刺激活化，如TF-α、IL-6、 IL-10、PMA或细胞拥挤状态。

上述细胞置于由完全培养基(含有10毫摩尔Hepes的RPMI 1640培养基)、包含2毫摩尔L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、10％热灭 活的FCS(美国犹他州Logan的Hyclone实验室提供)、100单位/ 毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素(纽约，Grand Island，Gibco 实验室提供)，组成的培养基中维持对数期生长，以观察α-MSH和 /或其衍生物对HIV复制的影响。首次的试验性实验用来确定上述 培养条件下的最佳细胞密度、刺激物浓度HIV-1p24抗原生成的动 力学。在使用前，用HBSS冲洗细胞三次以去除细胞外病毒。然后 在浓度为10-15-10-4摩尔范围的α-MSH(1-13)(序列号4号) 或(11-13)(序列号1号)存在或缺乏的条件下，将细胞以2×105/ 毫升的密度(1毫升的最终体积)铺于24孔的平底培养皿，培养皿 中只有培养基或加入TF-α(10毫微克/毫升)(英国英格兰牛津 R&D系统提供)。

在进一步的实验中，U1细胞中单独加入浓度为10-5M的α -MSH(11-13)(序列号1号)，这些细胞是经过TF-α(10毫微 克/毫升)、IL-6(20毫微克/毫升)、IL-10(20毫微克/毫升)(英国 英格兰牛津的R&D系统提供)、PMA(1毫微克/毫升) (Sigma-Aldrich)或细胞拥挤刺激的。将密度为2×105/毫升的U1 细胞在37℃、5％CO2的条件下不更换培养基培养7天，细胞即可 达到拥挤状态。由细胞因子或PMA激活的培养只能持续48小时。 然后离心以分离上清液，采用市售ELISA试剂盒(美国纽约Buffalo 的细胞实验产品有限公司生产)检测p24抗原，采用市售逆转录酶 ELISA反向分析试剂盒(瑞典Lund Innovagen生产)检测逆转录酶 的释放。对于所有这些实验，在第一天加入α-MSH(11-13)(序 列号1号)，每一种条件下的结果的测定均重复三次。

图10表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)在较大浓度范围内明显抑制TF-α刺激的U1细胞的p24 抗原释放。对于上述二种肽最有效的浓度均是10-5M，分别产生52.7 ％和56.0％的抑制效应。图11表明α-MSH(11-13)(序列号1 号)也抑制IL-6、IL-10、PMA或细胞拥挤状态诱导的U1细胞的 p24抗原和逆转录酶释放。此外，图12表明，根据orthern印记分 析的测定结果，α-MSH(11-13)(序列号1号)还可以抑制PMA 刺激的U1细胞的剪切和未剪切HIV-1 RA的转录。

由此本实施例说明α-MSH或其衍生物能够抑制由TF-α、 IL-6和IL-10途径诱导的病毒基因的转录。

实施例VII

本实施例进一步阐明了α-MSH抑制病毒复制和活化的能力， 或者更确切地说，阐明了向U1细胞中加入α-MSH的中和性抗体 明显增加p24抗原的释放。

U1细胞的培养方法与实施例VII中所述的类似。采用亲和纯化的 兔抗α-MSH抗体(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻断U1 细胞内源性α-MSH的产生，此抗体对介质以1∶250稀释。对照抗 体选用同等稀释度的兔IgG。抗α-MSH抗体和对照抗体处理的细 胞(2×105/毫升)在培养基或PMA(1毫微克/毫升)中共同培养。 37℃培养48小时后，分离上清液并检测p24抗原的释放。在拥挤 状态实验中，U1细胞的培养同上述方法，抗α-MSH抗体和对照IgG 在第一天加入，第七天收集上清液。

图13表明在静止状态、PMA诱导状态、或U1细胞拥挤状态， 阻断α-MSH会明显增加p24抗原的释放。本实施例强有力地提示 病毒复制受α-MSH的影响。

实施例IX

本实施例阐明了α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制和表达的 机制，或者更确切地说，阐明了α-MSH或其衍生物抑制TF-α诱 导的F-κB活化和结合的机制。

取20×106个U1细胞(在完整培养基中密度为2×105/毫升) 制备核提取物，以测定F-κB活性水平，其中U1细胞先在浓度 为10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)存在或缺失的条件下 用TF-α(20毫微克/毫升)刺激4小时。用冷PBS冲洗细胞一次， 缓冲液A(10毫摩尔Hepes(pH7.9)，1.5毫摩尔MgCl2，10毫摩 尔KCl，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)冲洗两次，离心， 置于冰上，在加入0.1％P-40的缓冲液A中培养10分钟。随后， 弃去上清液，核碎片悬浮于15微升的缓冲液C(20毫摩尔Hepes (pH7.9)，1.5毫摩尔MgCl2，0.42摩尔KCl，0.2毫摩尔EDTA， 25％甘油，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)中，冰上培养15 分钟，混匀，离心。用75微升标定的缓冲液D(20毫摩尔Hepes (pH7.9)，0.05毫摩尔KCl，0.2毫摩尔EDTA，20％甘油，0.5毫 摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)稀释上清液，-80℃保存。结合反 应于室温下进行10分钟，反应体系中含有10微克核提取蛋白和0.5 毫微克32P标记的F-κB(30,000cpm/微升)或者AP1混合于缓 冲液A(12毫摩尔Tris-HCl(pH7.8)，60毫摩尔KCl，0.2毫摩尔 EDTA和0.3毫摩尔DTT)，再加入10％甘油、2微克/毫升牛血清 白蛋白和1微克/毫升单链DA(Pharmacia Biotech)。此研究中用 于F-κB的寡核苷酸有：+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCT GGG GAC TTT CCA TG，和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC CCT TG。每一个寡核苷酸退火与其互补结合，并 且用多聚核苷酸酶在末端标记32P-γ-ATP。为了确定特定链，在与 标记探针温浴之前，核提取物先与100倍过量的未标记探针温浴五 分钟。然后，混合物在1x TBE条件下，于5％(30∶1)聚丙烯酰胺 凝胶上进行电泳，再将凝胶干燥，进行放射自显影。

图14表明TF-α明显增强F-κB的结合活性，但是与浓度 为10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)共同培养明显降低 F-κB的活化。但是α-MSH(11-13)(序列号1号)并不改变 静止细胞F-κB的活化。此现象说明α-MSH和/或其衍生物通过 调控F-κB的结合而抑制病毒复制和表达。

病毒物质的复制通常依赖被感染细胞的活化状态，受病毒和宿 主的相互作用调控。这些宿主因素可能包括TF-α和其它细胞因 子，如白介素。与HIV-1感染和活化类似，单纯疱疹病毒(HSV) 在宿主细胞因子作用下也可以从潜伏状态活化。例如，TF-α和 IL-6，但不包括IL-1和IL-3，已经确定可以活化HSV感染。用抗 IL-6抗体中和IL-6可明显抑制HSV的活化，相比之下中和α或β 干扰素却没有影响。(参阅Baker，M.等，《白介素-6和单纯疱疹病 毒1型的关系：对行为和免疫病理的提示》(The Relationship between Interleukin-6 and Herpes Simple virus Type-1：Implications for Behavior and Immunopathology)，《大脑行为免疫》(Brain Behav.Immunol.)13(3)：201-11(1999)；oisakran S.等，《体外 移植的潜伏感染的三叉神经节中HSV-1活化过程中淋巴细胞延迟 动力学》(Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation from in vitro Explanes of Latent Infected Trigeminal Ganglia)，《神经免疫 学杂志》(J.euroimmunol.)95(1-2)：126-35(1999)；Walev，I. 等，《TF-α对小鼠三叉神经节内潜伏单纯疱疹病毒的复活和复制 的增强作用》(Enhancement by TF-α of Reactivation and Replication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigeminal Ganglia of Mice)，《病毒学文献》(Arch.Virol.)140(6)：987-92(1995)； Domk-Optize，I.等，《内源性毒素刺激巨噬细胞导致持续单纯疱疹病 毒感染的复活》(Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results in the Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection)，《斯 堪的纳维亚免疫杂志》(Scand.J.Immunol.)32(2)：69-75(1990)； Fauci，A.S.，《HIV所致疾病发病机理中宿主因子的作用》(Host Factors in the Pathogenesis of HIV-induced Disease)，《自然》 (ature)384：529(1996))。

TF-α或包括HSV在内的病毒感染可以导致IκB的靶向损 害，后者又可活化F-κB的核转位。核转位促进F-κB与DA 操纵子的结合，从而促进大量炎症因子的转录，包括TF-α、IL-6 和其它细胞因子。这些细胞因子的表达又进一步复活其它HSV感 染的细胞以产生HSV病毒(参阅Patel，A.等，《单纯疱疹病毒I型 对持续F-κB核转位的诱导提高病毒复制的效率》(Herpes Simplex Virus Type-1 Induction of Persistent F-κB uclear Tranlocation Increases the Efficiency of Virus Replication)，《病毒学》 (Virology)247(2)：212-22(1998))。

因此，α-MSH和/或其衍生物通过阻断F-κB的结合抑制更 多活化HSV的炎症性细胞因子的表达。本实施例以及实施例VII- VIII表明α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制、表达和复活，此作用 是通过抑制机体细胞因子或其它病毒感染诱发的F-κB的结合而 实现的。 实施例X

本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物抑制急性感染人体细胞内 病毒复制的能力，或者更确切地说，阐明α-MSH抑制实际感染的 人外周血单核细胞(PBMCs)内HIV-1复制和表达的能力。

采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离来自正常个体的PBMCs。 单核细胞由Percoll梯度分离，然后选取24孔组织培养板，在加入 20％FCS的RPMI完全培养基内使其分化7天，成为巨噬细胞 (MDM)，细胞密度为106/毫升。用嗜单核细胞的HIVB α-1株 (1∶10)感染MDM，过夜。未稀释的病毒包含107个感染单位/ 毫升。24小时后，冲洗MDM并将其重新悬浮于完整介质中。一周 更换三次，连续三周。采用市售ELISA Retrosys RT试剂盒(瑞典 lund Innovagen生产)，感染后每周测定反转录酶的释放量。HIV感 染时及其后的每一天加入10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1 号)，直到最后采样。

图15表明α-MSH明显抑制急性感染的MDM中逆转录酶的释 放。此抑制效应在第6天更显著，但第21天仍有统计学意义。

由此本实施例说明感染部位的病毒复制可以被α-MSH和/或其 衍生物抑制。所以，通常性传播疾病，尤其是HIV，可以通过α-MSH 和/或其衍生物与避孕工具的结合运用而被抑制，避孕工具如用于性 交的避孕套、隔膜、海绵和/或性交后所用的含α-MSH和/或其衍生 物的栓剂、油脂、油膏、凝胶或气溶胶泡沫。 实施例XI

本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物的生物学功能相当物。

虽然这里所述特定氨基酸序列是有效的，但对于熟悉本专业的 技术人员来说，很容易做到替换或去除氨基酸而不改变肽类的有效 性。进一步来说，α-MSH序列的稳定可以大幅度提高肽类活性， 替换D-氨基酸构型为L型可以提高或降低肽类活性。例如，α-MSH 的稳定类似物，[le4，D-Phe7]-α-MSH，其解热作用是母体肽分子大 约10倍有余。此物质已知对黑素细胞和黑素瘤细胞有明显的生物 学活性。确切地说，在α-MSH(11-13)(序列号1号)的C-末端 加入氨基酸能够降低或加强解热效应。加入甘氨酸形成10-13序 列(序列号5号)，可以略微减弱其效应；形成9-13序列(序列 号6号)，几乎无解热作用；而8-13序列(序列号7号)的解热 效应强于11-13序列(序列号1号)。已知Ac-[D-K11]-α-MSH 11-13-H2具有和α-MSH(11-13)(序列号1号)的L型三肽相 同的总体效应。但是在三肽的12位以D-脯氨酸替换将导致其活性 的丧失(参阅Holdeman，M.等，《一种有效α-MSH类似物的解热活 性》(Antipyretic Activity of a Potent α-MSH Analog)，《肽物质》 (Peptides)6,273-5(1985)；Deeter，L.B.等，《兔中枢给予α-MSH 片断的解热特性》(Antipyretic Properties of centrally Administered α -MSH Fragments in the Rabbit)，《肽物质》(Peptides)9,1285-8 (1989)；Hiltz，M.E.，《α-MSH(11-13)类似物的抗炎活性：立 体化学改变的影响》(Anti-inflammatory Activity of α-MSH(11-13) Analogs：Influences of Alterations in Stereochemistry)，《肽物质》 (Peptides)12,767-71(1991))。

生物学功能相当物也可通过替换具有近似亲水值的氨基酸来获 得。例如，异亮氨酸和亮氨酸(亲水指数分别是+4.5和+3.8)可以 用来替换缬氨酸(亲水指数为+4.2)，这样仍可得到具有相似生物学 功能的蛋白。可供选择的另一种方法针对亲水指数为负值的氨基 酸，如赖氨酸(-3.9)可用精氨酸(-4.5)替换，等等。一般而言， 和被替换氨基酸亲水指数差别在单位+/-1范围内的氨基酸能够成 功地进行替换。

此外，这些经修饰的α-MSH和/或其衍生物的类似物也能够象 图16中所描述的KPV二聚体一样形成二聚体。

实施例XII

女性经受着阴道、外阴和/或尿道的不适。医生的检查包括上述 部位取材的培养。确定了包括任何感染和炎症在内的不适之后，医 生可以开处方，如适当的抗生素、抗真菌药、抗病毒药或消炎药。 此外，也可以包括剂量达到药理学效应的α-MSH和/或其衍生 物的局部应用，α-MSH和/或其衍生物由药膏、油脂、胶体、可溶 丸、喷雾、栓剂、用于灌注的溶液、或者棉条吸收材料携带到 达局部。根据医生的判断，局部可一次或多次使用，直到疾病 治愈。

本实施例在医生的判断下适用，也可应用于有阴茎、睾丸和/ 或尿道不适的男性病人。此外，α-MSH和/或其衍生物的局部 也可不在医生的指导下进行，而以非处方药物形式使用。

上述实施例I-XII阐明了α-MSH和/或其衍生物的抗感染活性 和应用。其中引用数据的目的只是便于说明实施例，并不是把本发 明局限于这些实施例范围内。应该明了的是，对上述实施例的修改 并不偏离本发明的精神。而且，这些实施例可单独或联合进行。