一种贝类抗菌肽B1-α及其应用
一种贝类抗菌肽b1-α
及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物肽技术领域，具体涉及一种贝类抗菌肽b1-α及其应用。
背景技术：
2.抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是一类广泛存在于自然界生物体内的小分子多肽物质，对多种细菌、真菌、病毒和寄生虫均具有较好的抑制或者杀伤作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性、不易产生耐药性、无残留等特点，是一种潜在的优质抗生素替代品。
3.贻贝在全球有着广泛的分布，是一类具有重要经济价值的双壳贝类。贝类因其滤食性特征导致其在生存过程中会富集水体中大量的微生物，同时贝类作为无脊椎动物仅具有先天免疫系统，在当前贝类养殖业发展过程中，因高密度养殖以及水体污染等导致养殖贝类大规模病害甚至死亡的事件时有发生。但同样是双壳贝类，贻贝在养殖过程中却表现出较强的疾病耐受性，迄今为止，尚无贻贝属(mytilus)在养殖过程中大规模病害的报道。在贻贝、牡蛎以及蛤类混养海域中，高密度的弧菌、病毒以及寄生虫等往往造成牡蛎及蛤类的大量死亡，但并未对同海域生存的贻贝产生明显危害。上述研究结果表明，相较于其他贝类，贻贝具有独特而强大的免疫系统。因此，贻贝已成为海洋无脊椎动物免疫相关研究的重要对象。目前，已知贻贝的免疫系统对病原微生物表现出极强的耐受性，表明贻贝独特的免疫防御机制能有效抵御水体中各种微生物的侵袭。因此，通过贻贝的免疫系统及其分子机制研究具有重要的科学意义；通过对贻贝基因组和多肽组测序，结合大规模筛选技术，可以获得结构新颖的抗菌肽，对于抗菌剂和抗菌药物等领域有广阔的应用前景。
技术实现要素：
4.针对现有技术存在的问题，本发明的第一个目的在于提供一种具有较强的抑菌活性、溶血活性低、无细胞毒性的贝类抗菌肽b1-α。
5.一种贝类抗菌肽b1-α，该贝类抗菌肽b1-α含有seq id no.1所示的氨基酸序列。
6.具体的，所述贝类抗菌肽b1-α的分子量为1248.49da，等电点为9.02。
7.本发明的第二个目的在于提供上述贝类抗菌肽b1-α在制备抗细菌类药物中的应用。
8.具体的，所述细菌包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌包括巨大芽孢杆菌、金黃葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
9.本发明的第三个目的在于提供上述贝类抗菌肽b1-α作为水产饲料添加剂的应用。
10.本发明的第四个目的在于提供一种抗细菌药物，含有上述的贝类抗菌肽b1-α作为活性成分。
11.与现有技术相比，本发明有以下优点：经实施例验证，本发明的贝类抗菌肽b1-α具有较强的抑菌活性，同时溶血活性低，无细胞毒性，稳定性高，具有较好的优势和运用前景；本发明贝类抗菌肽b1-α对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抗菌效果；贝类抗菌肽
b1-α对正常哺乳动物红细胞不具有细胞毒性作用，与许多已知的海洋动物抗菌肽相比，贝类抗菌肽b1-α抗菌效果好，抗菌谱广，具有极大的使用价值，在开发制备抗菌剂方面具有较好的应用；本发明依据厚壳贻贝氨基酸序列，人工合成一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽b1-α，该抗菌肽来源于水产双壳贝类，既可以应用于水产作为饲料添加剂，也可以研制成为抗菌剂和抗菌药物等，因此具有广泛的应用前景。
附图说明
12.图1为本发明贝类抗菌肽b1-α的结构图；图2为本发明固相化学合成贝类抗菌肽b1-α粗品的hplc纯化与分子量质谱鉴定图像；图3为本发明贝类抗菌肽b1-α抑菌活性表；图4为本发明贝类抗菌肽b1-α对绵羊红细胞的溶血活性测试值；图5为本发明通过mtt法测定贝类抗菌肽b1-α对hek293t的细胞毒性值。
具体实施方式
13.为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合具体实施例以及附图，对本发明一种贝类抗菌肽b1-α及其应用做进一步详细的描述。
14.实施例一：贝类抗菌肽b1-α的获取s1.从厚壳贻贝基因组中筛选具有防御素结构特征的序列，通过生物信息学技术对其序列进行结构与功能预测，在此基础上筛选其结构中与抗菌活性相关的功能肽段，通过结构比较，获得最优化的肽段序列；s2.根据所获得的肽段序列，采用固相化学合成手段获得多肽片段的样品，利用生长曲线抑制法开展肽段的功能分析，判断肽段的抑菌谱，并深入研究其抗菌活性机理。
15.如图1所示，本发明的贝类抗菌肽b1-α有9个氨基酸残基，其含有seq id no.1所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具体为：leu-arg-cys-his-phe-trp-cys-arg-ser，核苷酸序列为：cttagatgtcatttttggtgtcgatcc，氨基酸序列的单字母缩写的序列为lrchfwcrs，贝类抗菌肽b1-α的分子量为1248.49da，等电点为9.02。
16.实施例二：贝类抗菌肽b1-α的固相合成根据设计的氨基酸序列：leu-arg-cys-his-phe-trp-cys-arg-ser，用固相合成法得到粗多肽，合成方向为从羧基端向氨基端；将合成后的线性多肽粗品以高效液相谱仪进行分离纯化，鉴定其纯度。
17.具体的检测条件为：（1）谱条件为：谱柱为 c8 反相柱 (4.6
×
250 mm， 5 μm)，洗脱液分别为a液：含0.1%tfa的纯水，b液：含0.1%tfa的乙腈，洗脱梯度为20 min内b液比例由30%上升到65%，20.1min时，流动相a的比例变为100％，流动相b的比例变为0％，以1ml/min的流速进行30min的分离，采用紫外检测器进行检测，检测波长为220 nm，收集洗脱目标峰开展质谱分析；采用质谱对合成后的多肽纯品进行分子量鉴定。（2）质谱检测条件为:气动辅助电喷雾离子化(esi)，毛细管电压为 2.5 kv，检测器电压为 1.5 kv，离子源温
度为450 ℃；离子检测方式为选择性离子检测，离子极性为正离子。
18.采用固相多肽合成策略，完成对贝类抗菌肽b1-α的化学合成，合成产物的纯化与鉴定结果分别见图。由图2可见，贝类抗菌肽b1-α合成后经高效液相谱纯化，其纯度达到90%以上；质谱鉴定结果表明，合成的贝类抗菌肽b1-α分子量为1248.49d，与理论分子量(1248.6d)一致。
19.实施例三：贝类抗菌肽b1-α的抗菌活性检测本实施例中所涉及到的菌株有：大肠杆菌（escherichia coli）、哈维氏弧菌（vibrio harveyi）、溶藻弧菌（vibrio alginolytica）、副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）、河流弧菌（vibrio fluvialis）、铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）、巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）、金黃葡萄球菌（staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（sarcina lutea）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（bacillus cereus）和地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）。
20.试验采用二倍梯度稀释的方法，测定最小抑菌浓度即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。
21.mic值测定：准备好新鲜菌液，使用紫外分光光度计检测菌液的od600，按照1od600＝1
×
109cfu/ml，用新鲜lb液体培养基将上述菌液浓度稀释调整至2
×
10
5 cfu/ml。之后预先在无菌的96孔板中加入100μl生理盐水，在第一孔内加入待测样品，依次对待测样品进行二倍梯度稀释，再在每孔内加入100μl浓度为2
×
105cfu/ml的菌液，用移液将其吹打混匀，混匀后置于37℃恒温培养箱中过夜培养，最后用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为最小抑菌浓度，即mic值。
22.经验证贝类抗菌肽b1-α的抑菌活性如图3所示，其mic值在3.9-125μm之间。
23.实施例四：贝类抗菌肽b1-α溶血率测定抑制细菌繁殖性能测定：s1.取绵羊血，离心 (1000
ꢀ×
g, 10min, 4℃)收集红细胞，以pbs缓冲液 (ph 7.4)洗涤3次，之后以pbs缓冲液 (ph 7.4)重悬细胞制备成1% 红细胞悬浮液；s2.合成贝类抗菌肽b1-α以pbs缓冲液(ph 7.4)配置成1 mm浓度，按照1:9比例分别加入抗菌肽溶液和红细胞悬浮液，抗菌肽终浓度分别为100、 50、 25、 12.50、 6.25、 3.13、 1.56 及0.78 μμ浓度梯度，以 pbs缓冲液(含0 μm抗菌肽)为阴性对照，以 triton x-100为阳性对照；s3.37 ℃培养4 h后取出，经离心 (1000
ꢀ×
g, 10 min, 4℃)后，上清液转移至96孔板，以酶标仪于波长405 nm处测定吸光度；s4.抗菌肽溶血率按照（检测孔od
405
－阴性孔od
405
）/（阳性孔od
405
－阴性孔od
405
）
×
100%进行计算。
24.如图4所示，抗菌肽溶液与绵羊红细胞悬浮液经孵育， od
405
检测结果表明，与对照组相比，不同浓度的贝类抗菌肽b1-α均未能导致红细胞发生明显溶血现象， 不同浓度的贝类抗菌肽b1-α其溶血率均小于5%。
25.实施例五：
贝类抗菌肽b1-α细胞毒性测定使用人胚肾细胞株hek293t测定细胞毒性，具体包括：s1.待细胞生长状态良好且密度长至瓶底的80%时，弃去培养基，用无菌的pbs洗涤3次，随后用胰酶对贴壁细胞进行消化，终止后加入新鲜的含10%fbs的dmem培养基吹吸混匀，并将细胞悬液浓度调整至5
×
105个ml，实验采用无菌96孔板，在各孔内加入上述细胞悬液200μl，放入细胞培养箱中过夜培养；s2.次日，加入不同浓度的待测样品，浓度涕度设置为500μm、250μm、125μm、62.5μm、31.3μm、15.6μm、7.8μm、3.9μm，每个浓度3个重复，对照组使用相同体积的无菌pbs，随后放入37℃、5%co2的恒温培养箱中继续培养24小时；s3.在每个子孔内加入5mg/ml的mtt溶液10μl，在避光条件下放入培养箱中继续培养4小时；s4.最后，小心吸取并弃去孔中液体，加入dmso(dimethylsulfoxide)100μl，将96孔板放在摇床上缓慢摇晃10分钟待结晶溶解，用酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。结果如图5所示，贝类抗菌肽b1-α无细胞毒性。
26.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
技术特征：
1. 一种贝类抗菌肽b1-α，其特征在于，该贝类抗菌肽b1-α含有seq id no.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的一种贝类抗菌肽b1-α，其特征在于，所述贝类抗菌肽b1-α的分子量为1248.49da，等电点为9.02。3.根据权利要求1或2所述的贝类抗菌肽b1-α在制备抗菌剂和/或抗细菌类药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌包括巨大芽孢杆菌、金黃葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。5.根据权利要求1或2所述的贝类抗菌肽b1-α作为水产饲料添加剂的应用。6.一种抗细菌药物，其特征在于，含有权利要求1或2所述的贝类抗菌肽b1-α作为活性成分。
技术总结
本发明公开一种贝类抗菌肽B1-α，该贝类抗菌肽B1-α含有SEQ ID O.1所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具体为：Leu-Arg-Cys-His-Phe-Trp-Cys-Arg-Ser，贝类抗菌肽B1-α的分子量为1248.49Da，等电点为9.02。本发明贝类抗菌肽B1-α对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抗菌效果；贝类抗菌肽B1-α对正常哺乳动物红细胞不具有细胞毒性作用，与许多已知的海洋动物抗菌肽相比，贝类抗菌肽B1-α抗菌效果好，抗菌谱广，具有极大的使用价值，在开发制备抗菌剂方面具有较好的应用；依据厚壳贻贝氨基酸序列，本发明人工合成了一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽；该抗菌肽来源于水产双壳贝类，既可以应用于水产作为饲料添加剂，也可以研制成为抗菌剂和抗菌药物等，因此具有广泛的应用前景。景。景。
