一种鹿血肽的制备方法及其医用用途
1.本发明属于医药领域，涉及鹿血肽的制备方法及其新的医疗用途。
背景技术：
2.鹿茸血(vb)是采割马鹿或梅花鹿茸时得来的血液，药用历史悠久，在《神农本草经》、《名医别录》、《本草纲目》和《神农本草经百种录》等诸多本草中均有记载，具有补肾壮阳，强健筋骨，生精益髓的功效，被誉为“人间仙品”。vb中含有大量的蛋白质、多肽和氨基酸类成分，中医认为其与鹿茸的药理活性相似，可以抗疲劳、抗氧化、提高免疫力、抗衰老、降血压、抗肿瘤和缓解骨质疏松。目前，包括鹿茸肽在内的多肽成份在抗氧化、抗炎方面表现出优异的活性，然而鹿血肽(vbps)在以上领域报道较少。
3.皮肤是人体最大、最暴露、最敏感且最易受伤的组织，在防脱水、抵御有害物质和病原体、启动维生素d合成、排泄和体温调节等不同过程中均发挥着至关重要的作用。由于病因多样，皮肤创伤已经成为一个亟需解决的重要医疗问题。在现代皮肤敷料中，水凝胶因其良好的亲水性、类似细胞外基质(ecm)的结构、良好的生物降解性、生物相容性、粘附性和透气性等特点，成为伤口敷料的理想候选产品。研究发现，在水凝胶中添加生物活性肽可以从抗炎、抑菌、促进细胞增殖和诱导血管生成等多个方面提高水凝胶的皮肤修复能力。
4.传统的敷料，如纱布，可能会附着在新生的肉芽组织上，当被移除时会引发疼痛和影响组织完整性，而且不具备抑菌、抗氧化或其他活性功能。在包括薄膜、纳米纤维、水凝胶和海绵等形式的现代伤口敷料中，水凝胶因其具有三维网络结构、良好的生物降解性、生物相容性、粘附性和透气性，并可保持细胞迁移所需的湿润环境，现已成为伤口敷料的理想候选产品。
技术实现要素：
5.本发明利用鹿茸血通过酶解和膜分离技术制备鹿血肽，获得鹿血肽粉末，并分析了鹿血肽中的氨基酸和肽的组成，具体步骤为：（1）酶解：采用两步酶解法模拟鹿血的体外胃肠消化制备鹿血肽。配制20 mg/ml的鹿血溶液，用1-2 m hcl调节ph至1.5-2.5。37℃预热10-30min后，按酶底比1:10-50加入胃蛋白酶。溶液于恒温振荡器中以120 rpm的速度37℃消化2-4 h后，用1-2 m naoh调节ph值至7.5-8.0，加入胰酶，酶/底物=1:15-25，w/w，进一步反应 4 h，模拟肠道消化。在酶解过程中，使用1-2 m hcl或1-2 m naoh维持ph稳定。消化结束后，通过在沸水浴中加热15-30min使酶失活。反应物冷却至室温，8000 rpm离心30 min获得酶解液上清。随后上清液以双层慢速滤纸过滤2次获得鹿血肽，冷冻干燥置于-20℃保存备用；（2）分离、冻干：配置50 mg/ml的鹿血肽溶液，依次经过分子截留量为10 kda和3 kda的超滤膜进行分级处理，获得组分f1、f2和f3，并分别将3个组分通过150 da的纳滤膜进行脱盐处理，冻干后储存在-20℃备用。并对f3组分进行成分分析。因此，本发明的第一个目的在于，提供一种富含lkeccdkpv、fph、lfp、ehf和vgyp等组分的鹿血肽的制备方法。
6.另外，本发明对鹿血肽水凝胶通过调节pi3k/akt/mtor信号通路促进创伤皮肤的修复进程进行研究，确定鹿血肽水凝胶是通过上调p-pi3k/pi3k、p-akt/ akt、p-mtor/mtor等与细胞增殖相关蛋白的表达以及调节了sirt1、nf-κb、tnf-α和il-1β等炎症相关蛋白的表达水平，激活pi3k/akt/mtor信号通路而促进创伤皮肤修复。因此，本发明的第二个目的在于，提供一种pi3k/akt /mtor信号通路信号通路激活剂，该激活剂包括负载鹿血肽的水凝胶。
7.本发明通过鹿血肽水凝胶对小鼠皮肤创面伤口愈合的影响进行研究，确定含有鹿血肽的水凝胶有利于创伤修复；另外，通过对小鼠皮肤伤口愈合的组织病理学分析，发现鹿血肽水凝胶处理后，皮肤创伤部位血管数量、皮肤附属物形成、纤维细胞增殖和胶原沉积增加，皮肤创伤部位炎性细胞明显被抑制，皮肤组织中中cd31、pcna和α-sma的表达升高，cd68的表达降低，进一步证实，鹿血肽水凝胶处理可加速伤口创面表皮生成，在皮肤修复过程中表现出良好的促进作用。因此，本发明的第三个目的在于，提供一种促进皮肤伤口修复的方法，该方法为，在皮肤伤口处涂敷含有鹿血肽水凝胶的药物。
8.本发明第四个目的在于：提供一种负载鹿血肽的水凝胶的制备方法，该方法具体为：将200 mg的壳聚糖（cs）加入0.1m的10ml冰醋酸溶液中充分溶解，并在冰水浴搅拌的条件下逐滴加入2.5ml 55%(w/v)的β-gp溶液，得到cs/β-gp溶液。随后向制备的溶液中加入100 mg 海藻酸钠（sa）粉末不断搅拌使其溶解，然后滴入0.2 ml0.5% cacl2溶液(w/v)，连续搅拌，得到cah溶胶，随后将权利要求5中步骤二得到的鹿血肽f3粉末添加到空白水凝胶（cah）体系中混合均匀使其浓度为0.1%，得到鹿血肽水凝胶，本发明的优点和有益效果：（1）本发明提供一种含lkeccdkpv、fph、lfp、ehf和vgyp等成分的鹿血肽的制备方法，该方法制备的鹿血肽具有较强的抗氧化、抑制络氨酸酶的活性。
9.（2）本发明提供了一种全新的pi3k/akt/mtor信号通路激活剂，其为pi3k/ akt/mtor信号通路参与皮肤疾病的提供了新的方法。
10.（3）本发明提供了一种鹿血肽水凝胶的制备方法，方法操作简便、生产成本低、收率高。
附图说明
11.图1 酶解对vb体外活性的影响。其中，(a) tca-ysp；(b) sds-page分析；(c) dpph自由基清除活性；(d) abts自由基清除能力；(e) 羟基自由基清除活性；(f) fe
2+
螯合活性；(g) lox抑制活性；(h) xod体外抑制活性；(i) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异显著(p《0.05)。各样品浓度均为1 mg/ml。
12.图2 超滤组分的生物活性评价。其中，(a) dpph自由基清除活性；(b) abts自由基清除能力；(c) 羟基自由基清除活性；(d) fe
2+
螯合活性；(e) lox体外抑制活性；(f) xod抑制活性；(g) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异显著(p《0.05)。各样品浓度均为1 mg/ml。
13.图3 单肽的体外活性分析。其中，(a) 肽的溶血率；(b) dpph自由基清除活性；(c) abts自由基清除活性；(d) 羟基自由基的清除活性；(e) fe
2+
螯合活性；(f) lox抑制活性；(g) xod抑制活性；(h) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异的显著性
(p
ꢁ
《
ꢁ
0.05)。各样品的浓度均为1mg/ml。
14.图4鹿血肽水凝胶的制备以及促进伤口修复的潜在机制。
15.图5鹿血肽水凝胶的表征。其中cah和capbph的sem(a)，ftir(b)，ph(c)，粘度(d)，保水性(e)，溶胀(f)和生物降解性分析(g)以及cavbph中vbps的累积释放(h)。比例尺=50μm。
16.图6水凝胶样品的体外活性分析。(a)dpph自由基清除活性，(b)abts自由基清除率，(c)溶血性分析，(d-f)水凝胶对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌分析，(g)cah和cavbph的细胞活力。
17.图7不同处理组伤后第0、3、7、10、14天皮肤创面(a)和创面面积(b)的观察分析。与对照组相比，*p《0.001，**p《0.01，***p《0.001；与cah比较，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001。
18.图8皮肤创面在第7天和第14天的组织学分析。其中(a)h&e和masson染，白箭头表示炎症细胞，黑箭头代表毛细血管，蓝箭头表示新的上皮组织(比例尺=100μm)；(b)第14天创面上皮组织厚度；(c)皮肤创面胶原沉积。与对照组相比，
*
p《0.001，
**
p《0.01，
***
p《0.001；与cah比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001。
19.图9皮肤样本的ihc染。其中，(a)cd31、pcna、α-sma和cd68的免疫组化(比例尺=100μm)。(b)cd31、(c)pcna、(d)α-sma和(e)cd68蛋白的定量表达。与对照组相比，
*
p《0.001，
**
p《0.01，
***
p《0.001；与cah比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001。
20.图10不同处理对pi3k/akt/mtor信号通路相关蛋白的影响。其中，(a)p-pi3k/pi3k；(b)p-akt/akt；(c)p-mtor/mtor。与对照组相比，
*
p《0.001，
**
p《0.01，
***
p《0.001；与cah相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001。
21.图11不同对sirt1/nf-κb信号通路相关蛋白的影响。其中，(a)sirt1/β-actin，(b)nf-κb/β-actin，(c)tnf-α/β-actin，(d)il-1β/β-actin。与对照相比，
*
p《0.001，
**
p《0.01，
***
p《0.001；与cah相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
23.实施例1鹿血肽提取、鉴定及其护肤作用的研究1.1材料与仪器1.1.1实验材料梅花鹿(cervusnippontemminck)vb于2020年采购于吉林省金鹿药业有限公司。
24.1.1.2实验仪器表1实验仪器及厂家
1.1.3 实验试剂表2 实验试剂和厂家1.2 实验方法1.2.1 鹿血肽(vbh)的制备
采用两步酶解法模拟vb的体外胃肠消化制备vbh。配制20 mg/ml的vb溶液，用1 m hcl调节ph至1.5。37℃预热10min后，按酶底比1:50加入胃蛋白酶。溶液于恒温振荡器中以120 rpm的速度37℃消化2 h后，用1 m naoh调节ph值至7.5，加入胰酶(酶/底物=1:25，w/w)进一步反应 4 h，模拟肠道消化。在酶解过程中，使用1 m hcl或1 m naoh维持ph稳定。消化结束后，通过在沸水浴中加热15 min使酶失活。反应物冷却至室温，8000 rpm离心30 min获得酶解液上清。随后上清液以双层慢速滤纸过滤2次获得vbh，冷冻干燥置于-20℃保存备用。
25.1.2.2三-可溶性肽产量(tca-ysp)tca-ysp表示为样品上清液中三-可溶性肽含量占vb总蛋白含量的百分比，用以评价蛋白质的水解过程。1 ml样品与1 ml 10%(w/v)三混合，25℃静置30 min，然后8000
ꢀ×
g离心10 min，使用bca试剂盒测定上清液中的多肽含量，并根据以下公式计算tca-ysp：tca-ysp (%) = (a/b)
×
100%其中：a是上清液中三-可溶性肽的含量，b为消化前样品总蛋白的含量。
26.1.2.3 sds-page配置5%的浓缩胶和12%的分离胶，对鹿血及其水解组分进行sds-page分析。
27.1.2.4 鹿血肽(vbh)的超滤分离配置50 mg/ml的vbh溶液，依次经过分子截留量(mw)为10 kda和3 kda的超滤膜进行分级处理，获得组分f1(》10 kda)、f2(3-10 kda)和f3(《3 kda)，并分别将3个组分通过150 da的纳滤膜进行脱盐处理，冻干后储存在-20℃备用。
28.1.2.5 蛋白含量和氨基酸组成分析蛋白含量：以bsa为标准蛋白，采用bca蛋白试剂盒测定样品的蛋白含量。
29.氨基酸组成：样品以6 m hcl在110℃下水解22 h，用l-8900型氨基酸自动分析仪测定样品中每种氨基酸的含量。
30.1.2.6 nano lc-ms/ms鉴定肽序列利用nano lc-ms/ms分析具备最优生物活性组分的肽序列。首先在样品中加入dtt使其终浓度10 mm还原1 h，加入iaa溶液使其终浓度为50 mm，室温避光烷基化反应40 min。随后使用自填脱盐柱脱盐，于45℃挥干溶剂。将多肽样品重新悬浮在20 μl的0.1% fa中，利用配备有电喷雾-组合型离子阱orbitrap 质谱仪的ultimate 3000 高效液相谱系统进行分析。
31.谱条件如下：1)预柱：300 μm i.d.
ꢀ×ꢀ
5 mm, packed with acclaim pepmap rplc c18, 5 μm, 100
å
,2)分析柱：150 μm i.d.
ꢀ×ꢀ
150 mm, packed with acclaim pepmap rplc c18, 1.9 μm, 100
å
3)进样量5 μl，柱温20℃。
32.4)流动相a：0.1% fa；5)流动相b：0.1% fa，80% acn；6)流速：600 nl/min；
梯度洗脱条件见表3。
33.表3 液相洗脱条件质谱条件：1)一级质谱参数：resolution：70,000；agctarget：3e6；maximumit：40 msscanrange：100 to 1800 m/z2)二级质谱参数：resolution：17500；agctarget：1e5；maximumit：60 mstopn：20；nce/steppednce：27利用xcalibur软件和byonic软件对原始ms/ms文件进行分析，并与uniprot数据库所属物种蛋白组进行比对鉴定多肽序列。
34.1.2.7 单肽的制备利用葡聚糖凝胶柱谱分离制备鹿血肽中的单肽，利用waters zq 2000单四极杆质谱仪和waters alliance 2695高效液相谱系统被分别用来分析制备的单肽的mw和纯度(》95%)。
35.1.2.8 抗氧化活性测定配制1 mg/ml的蛋白肽溶液和阳性对照溶液，以评价肽的抗氧化能力。其中，dpph、abts和羟基自由基清除能力以gsh为阳性对照，亚铁离子(fe
2+
)螯合能力以edta-2na为阳性对照。
36.1.2.8.1 dpph自由基清除活力将样品与等体积的0.2 mm的dpph乙醇溶液加入96孔板中，室温暗反应30 min，酶标仪读取517 nm处的吸光度。dpph自由基清除率的计算公式如下：dpph自由基清除率(%)=[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品
代表肽和dpph溶液的吸光度，a
对照
是dpph和蒸馏水的混合吸光度，a
样品空白
代表样品和乙醇的吸光度。
[0037]
1.2.8.2 abts自由基清除活力分别制备浓度为7.4 mm和2.45 mm的abts和过硫酸钾溶液，1:1 (v/v)混合后低温暗反应12 h，使用前用蒸馏水进一步稀释溶液至734 nm处的吸光度为0.7
±
0.02。将受试样品与abts工作液1:2 (v/v)混合，室温避光孵育10min，测定734 nm处的吸光度。计算公式如下：abts自由基清除能力(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品
是样品溶液和abts工作液的混合吸光度，a
对照
代表蒸馏水和abts工作液
的吸光度，a
样品空白
表示样品和蒸馏水的吸光度。
[0038]
1.2.8.3 羟基自由基清除能力样品中依次加入等体积的10 mm水杨酸乙醇溶液、10 mm硫酸亚铁溶液和8.8 mm h2o2溶液。混合物在37℃暗反应30 min，3000
ꢀ×
g离心5 min，然后在510 nm处测定上清液的吸光度(a
样品
)。羟基自由基清除能力的计算公式如下：羟基自由基清除率(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品空白
包括样品、水杨酸、硫酸亚铁和蒸馏水，a
对照
包含蒸馏水、水杨酸、硫酸亚铁和h2o2。
[0039]
1.2.8.4 fe
2+
螯合能力将100 μl样品与20 μl的fecl2溶液(2 mm)混合，室温下反应30 min。然后加入100 μl菲洛嗪(5 mm)，继续反应10 min，在562 nm处测定吸光度。fe
2+
螯合能力的计算公式如下：fe
2+
螯合能力(%)=[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%其中，a
样品
代表样品、fecl2和菲洛嗪的混合吸光度，a
对照
包括蒸馏水、fecl2和菲洛嗪，a
样品空白
是样品、fecl2和蒸馏水混合物的吸光度。
[0040]
1.2.9 lox抑制活性首先将20 μl样品、200 μl pbs (0.01 m, ph=7.0)和20
ꢀµ
l的lox溶液(~100u)混匀，室温预孵育5 min，随后加入20
ꢀµ
l亚油酸的硼酸盐缓冲溶液(3.2 mm, ph=9.0)引发反应3 min，读取234 nm处的吸光度(a
样品
)。以双氯芬酸钠为阳性对照并按照以下公式计算：lox抑制活力(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品空白
用硼酸盐缓冲液代替lox，a
对照
用蒸馏水代替样品。
[0041]
1.2.10 xod抑制活力测定50
ꢁ
μl样品和50
ꢁ
μl xod(0.02 u)混合均匀在室温下预孵育5
ꢁ
min，随后加入120 μl黄嘌呤(0.48
ꢁ
mm)于37℃反应20 min，最后加入80 μl 盐酸(1 m)终止反应。以别嘌醇为阳性对照。利用下式计算xod抑制活性：xod抑制活力(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%其中，a
样品
、a
样品空白
和a
对照
分别代表(样品+xod+黄嘌呤+盐酸)、(样品+pbs+黄嘌呤+盐酸)和(蒸馏水+xod+黄嘌呤+盐酸)的吸光度。
[0042]
1.2.11 抗酪氨酸酶活性评估将100μl样品和等体积的酪氨酸酶(125u/ml)混合，室温预孵育15
ꢁ
min，加入100μl l-dopa(10mm)反应10
ꢁ
min后于492nm处测定吸光度(a
样品
)，曲酸被作为阳性对照，抑制活力的计算公式如下：酪氨酸酶抑制活性(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品空白
以pbs代替酪氨酸酶，a
对照
以蒸馏水代替体系中的样品溶液。
[0043]
1.2.12 溶血率首先制备了2%的人红细胞混悬液(hrbc)。将500
ꢀµ
l hrbc与样品溶液在37℃下孵育1 h，离心后在540 nm处测定上清液的吸光度。以hrbc和tritonx-100 (1% v/v)为阳性对照，hrbc和生理盐水为阴性对照。
[0044]
1.2.13 统计分析所有实验一式三份，采用ibm spss statistics 23.0软件对数据进行duncan单因
素方差分析(anova)。p《0.05表示两组间存在显著差异，用graphpad prism 5等软件作图。
[0045]
1.3实验结果1.3.1 vbh的制备和活性分析如图1a所示，vbh的tca-ysp为33.07%，比消化前升高了31.81%。sds-page结果表明，酶解后vb中原有蛋白，包括~70 kda、~55 kda、~25 kda和~12 kda的条带减弱或消失(图1b)。因此，这些蛋白被成功水解。随后，主要以dpph、abts和羟基自由基清除以及fe
2+
螯合能力为指标分析了多肽的抗氧化活性，结果详见图1c-f。浓度1 mg/ml时，gsh和vbh对dpph自由基的清除率分别为94.18%和55.29%，显著高于vb(21.28%, p《0.05)。vb、vbh和gsh的abts自由基清除能力分别为74.16%，95.77%，99.93%，而它们的羟基自由基清除能力依次为28.48%，32.99%和34.80%(图1d和e)。图1f所示，vbh的fe
2+
螯合能力较vb升高了21.37%。浓度1 mg/ml时，vbh的lox、xod和酪氨酸酶抑制活性分别为21.13%，35.37%和45.64%，显著高于酶解前(p《0.05，图1g-i)。
[0046]
1.3.2 vbh的分离sds-page表明，f1在~55 kda处蛋白条带的强度高于vbh，并且f2和f3在10-180 kda的范围内未出现明显的蛋白条带(图1b)。3组分的dpph自由基清除活性排序为f2》f3》f1 (p《0.05，图2a)。如图2b所示，除f1外，其余组分的abts清除率都超过95%。另外，f3的羟基自由基清除和fe
2+
螯合能力均显著高于其亲本水解物和其余组分(p《0.05，图2c和d)。如图2e-g所示，f3对lox、xod和酪氨酸酶抑制活性分别为22.36%、37.23%和83.58%。
[0047]
表4展示了f3中水解氨基酸的类型和含量，其中8种为必需氨基酸(65.92%)，9种为非必需氨基酸(34.08%)。4种高含量的氨基酸依次为赖氨酸(19.51%)、缬氨酸(13.41%)、亮氨酸(13.25%)和谷氨酸(10.15%)，占总氨基酸的56.73%。
[0048]
表4 f3组分的氨基酸组成1.3.3 肽序列鉴定和活性分析f3中共鉴定出372种肽，主要来源于adult beta-globin、toll-like receptor 8、tyrosine-protein kinase receptor、mhc class ii antigen和serum albumin等亲本蛋
白。其中，97.78%的肽拥有《1kda的mw，其余肽的mw介于1 kda和3 kda之间。选择score》200，intensity》107的序列(27个)进行进一步分析。这些肽的生物活性、抗氧化、抗炎和抑菌性能利用在线工具进行预测，结果如表5所示。
[0049]
表5 鉴定肽活性的计算机预测鉴定肽活性的计算机预测因此，根据在线预测结果，选择了ehf、fph、lfp、fsal、vgyp、lsqkfpk、hhggeftpv和lkeccdkpv以观察它们的体外生物特性。
[0050]
1.3.4 肽的生物活性分析在体外溶血实验中，所有肽在1 mg/ml浓度时的溶血率均低于1%(图3a)。lkeccdkpv在所有肽中表现出最高的dpph(89.55%)和abts(89.55%)清除能力，活性与gsh相当(p》0.05，图3b和c)。如图3d所示，这些肽的羟基自由基清除能力依次为fph (52.50%)、lfp (51.66%)、gsh (32.35%)、ehf (25.99%)、hhggeftpv (25.53%)和lkeccdkpv (22.94%)。然而所有肽的fe
2+
螯合能力均低于15%(图3e)。
[0051]
随后对这些肽的酶抑制活力进行了检测(图3f-h)。肽fsal和lfp分别展现出11.61%和10.22%的lox酶抑制活性，而其余的肽均低于10%(图3f)。如图3g所示，在1 mg/ml时对xod具有较强抑制活性的前4个肽分别为ehf(82.19%)、vgyp(73.26%)、lkeccdkpv(64.69%)和fsal(51.82%)，另外，lkeccdkpv的酪氨酸酶抑制活性显著高于其余的肽(p《0.05，图3h)。
[0052]
本发明首次从vb中分离出多生物活性肽，模拟了vb的体外消化，发现vbh具有很高的抗氧化活性，lox、xod和酪氨酸酶抑制活性，而且它的必需氨基酸含量高，满足人体需要，表明vb作为一种宝贵的蛋白质资源，经口服后可以被吸收并有助于调控生物系统平衡。另
外，我们从f3中鉴定出27种具有高置信度的肽，结合在线预测、固相合成和活性分析证明了部分肽的生物功能。这些结果为vb及其衍生肽在医疗健康领域的应用提供了科学数据。
[0053]
实施例2 鹿血肽水凝胶（cavbph）的制备表征及其促进皮肤修复的研究1.1仪器与材料1.1.1 实验仪器表6实验仪器及厂家1.1.2 实验试剂表7实验仪器及厂家
1.2 实验方法1.2.1 vbps的制备利用实施例1中酶解和超滤技术制备mw《3 kda的组分f3，即vbps，冻干后于-20℃备用。
[0054]
1.2.2 cavbph的制备将200 mg的cs加入10ml冰醋酸溶液(0.1m)中充分溶解，并在冰水浴搅拌的条件下逐滴加入55%(w/v)的β-gp溶液(2.5 ml)得到cs/β-gp溶液。随后向制备的溶液中加入100 mg sa粉末不断搅拌使其溶解，然后滴入0.2 ml cacl2溶液(0.5%, w/v)，连续搅拌，得到cah溶胶。为制备cavbph，将vbps粉末添加到cah体系中混合均匀使其浓度为0.1%(w/v)。
[0055]
利用倒置离心管的方法测定了cah和cavbph在37℃下的凝胶时间。结果显示，在37℃时，空白水凝胶在5min时发生凝胶化，而鹿血肽水凝胶2min时发生凝胶化，说明所制备的水凝胶具有温敏性。所有溶液均新鲜配制并储存在4℃以备使用。
[0056]
1.2.3 水凝胶的表征1.2.3.1 微观特征采用扫描电子显微镜(sem)在15 kv下观测表面喷金的凝胶断面微观形貌。
[0057]
1.2.3.2 红外分析分别将cs、β-gp、sa、vbps、cah和cavbph的粉末与kbr按1:100的质量比混合，采用ftir光谱仪在4000cm-500cm-1
的波数范围内扫描以检测它们的特征官能团。
[0058]
1.2.3.3 ph和粘度测定用ph计测定了cah和cavbph在37℃时的ph值。同样地，使用ndj-8s数字粘度计，3号转子设置转速1.5 rpm，在37℃下测量了样品的粘度。
[0059]
1.2.3.4 保水性测试
将初始重量为w0的水凝胶样品放置于37℃恒温烘箱中48 h，每隔一段时间称重记为w
t
。重量保持率(wrr)由以下公式计算：wrr=w
t /w0×
100%1.2.3.5 溶胀测试参将一定质量的冻干水凝胶(w0)浸入pbs (ph=7.4)中37℃放置48 h，期间按照固定时间间隔取出样品，除去表面多余水分后称重，记为w1。溶胀率(sr)的计算公式如下所示：sr= (w
1-w0)/w0×
100%1.2.3.6 体外酶促生物降解将水凝胶样品(w0)放入含1 mg/ml溶菌酶的pbs中，37℃、100 rpm孵育14天。期间按照设置的时间间隔取出水凝胶并用滤纸除去表面多余水分，快速称重(w
t
)。每隔48 h更换一次新鲜配置的溶剂以保证溶菌酶的活力。利用下式计算水凝胶的残余重量(wr)：wr = w
t
/w0×
100%1.2.3.7 vbps的体外释放为了评估vbps在cavbph中的释放行为，将一定质量样品完全浸入20 ml pbs中，37℃以100 rpm的速度连续振荡10天。在不同的时间点取出1 ml上清液，同时添加1 ml新鲜pbs保证体积不变。利用bca法测定vbps的释放。
[0060]
1.2.4 水凝胶的体外活性1.2.4.1 体外抗氧化首先，将冻干水凝胶浸入pbs中24 h制备不同浓度(1和5 mg/l)的溶液，同时制备1 mg/ml vbps以及gsh溶液作为阳性对照。如实施例1所示，采用dpph和abts自由基清除方法对抗氧化活性进行评价。
[0061]
1.2.4.2 体外溶血水凝胶的溶血率测定按实施例1进行。
[0062]
1.2.4.3 抑菌活性根据时间依赖性共培养评估了水凝胶对大肠杆菌(e. coil, 革兰氏阴性菌)和金黄葡萄球菌(s. aureus, 革兰氏阳性菌)的抑制活性。首先，将所有受试菌株在luria-bertani (lb)液体培养基中37℃振荡培养至对数生长期，用生理盐水稀释菌液至浓度约为10
5-6 cfu/ml。将0.5 ml菌液与20 ml含有0.4 g紫外灭菌水凝胶的lb液体培养基混合，于37℃，100 rpm培养，定期测定培养液在600 nm处的吸光度。对照组不存在水凝胶样品。随后将各组细菌培养液用生理盐水适当稀释后接种在lb固体培养基上37℃孵育12 h，观察平板菌落数以评价cah和cavbph的抑菌活性。
[0063]
1.2.4.4 细胞毒性将紫外灭菌的水凝胶浸入培养基中，在37℃下孵育24 h，以获得水凝胶提取液。hacat细胞以0.5
ꢀ×ꢀ
104细胞/孔的密度接种在96孔板中。细胞贴壁24 h后，将培养基更换为水凝胶提取液继续培养24 h。利用mtt法测定hacat细胞的存活率来确定水凝胶是否存在细胞毒性。
[0064]
1.2.5 体内伤口愈合实验1.2.5.1 小鼠皮肤伤口模型的建立
45只健康雄性icr小鼠，体重18-20 g，购自长春亿斯实验动物科技有限公司(证书编号：scxk-2020-0001)。适应性饲养一周后(22
±
2℃，60
±
5%湿度，昼夜交替光照)，腹腔注射相应比例的5%水合氯醛溶液(0.1 ml/10 g体重)麻醉小鼠，用电动剃须刀剃除背部毛发，并于背部诱导直径为1 cm的圆形全层切除创面。随后，将其随机分为pbs组、cah组和cavbph组(n=15)，给药剂量为0.2 ml/wound。分别于术后第0、3、7、10、14天拍摄创面照片，用image j软件统计创面大小。创面面积(wound area)计算公式为：wound area = unhealed area/ initial area
×
100%1.2.5.2 普通病理学分析第7天(n=7)和第14天(n=8)分别给予小鼠安乐死处理，取皮肤创面组织用10%福尔马林溶液固定。固定后的组织进行苏木精-伊红(h&e)和masson染处理，利用尼康显微镜观察和拍摄。image j软件被用来测量表皮厚度和胶原面积。创面胶原纤维的计算公式为：胶原沉积(%)=a0(胶原面积)/a1(视野组织总面积)
×
100%1.2.5.3 免疫组织化学(ihc)染组织切片利用cd31(ab182981，abcam)、pcna (bm0104，boster)、α-sma (bm0002，boster)和cd68 (ba3638，boster)染检测蛋白表达。使用尼康显微镜观察，image-pro plus 6软件计算蛋白的阳性表达量。
[0065]
1.2.5.4 蛋白免疫印迹(western blot)分析加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解缓冲液(冰水浴预冷)裂解皮肤创伤组织提取总蛋白，并利用bca试剂盒测量裂解上清的蛋白浓度。各裂解上清中加入1/4体积的5
×
loading buffer，沸水浴10 min使样品变性。通过10% sds-page电泳分离样品蛋白并转移到pvdf膜上，5% bsa封闭2 h后将膜与一抗pi3k、akt、mtor、p-pi3k、p-akt、p-mtor、sirt1、nf-κb、il-1β、tnf-α和β-actin在4℃孵育过夜，tbst冲洗，然后置于二抗溶液中室温孵育1 h，利用增强化学发光法(ecl)检测蛋白条带，并用image j软件进行定量分析。
[0066]
1.2.6 统计分析实验一式三份，数据以平均值
±
标准差(sd)表示。采用ibm spss statistics 23.0软件进行anova, p《0.05被认为具有统计学意义。graphpad prism 5和adobe illustrator cs6软件被用来绘制图形。
[0067]
1.3 实验结果1.3.1 水凝胶的表征温敏型复合水凝胶制备方案如图4所示。在cs的结构中，c3和c6的-oh以及c2位连接的部分可质子化的-nh
3+
基团容易与水分子产生氢键，提高聚合物的水溶性。将β-gp引入cs溶液后，37℃加热，促使β-gp结构中的-po
43-与 cs分子中的-nh
3+
通过静电作用相结合，另外，cs、β-gp和h2o之间更容易相互形成稳定的氢键，进而形成cs基温敏水凝胶网络。同时体系中引入的ca
2+
可以与sa分子结构中2个古洛糖醛酸片段的-coo
‑ 和-oh形成4个配位键，进而实现sa/ca
2+
网络，增强凝胶体系的粘度和凝胶化的效果。
[0068]
利用sem观察了cah和cavbph的微观形貌，如图5a所示。cah和cavbph都具有多孔的网络互联结构。在相同放大倍数下比较cah和cavbph的图像，发现vbps的引入增加了水凝胶中的孔隙数量。水凝胶的多孔结构不仅有利于锁湿和营造潮湿环境，而且还为伤口床提供
了更多的氧气。此外，cavbph的空隙也有利于vbps的释放，尽快与伤口作用。温敏型试验结果显示，在37℃时，空白水凝胶在5min时发生凝胶化，而鹿血肽水凝胶2min时发生凝胶化，说明所制备的水凝胶具有温敏性。
[0069]
cs、β-gp、sa、vbps、cah和cavbph的ir光谱如图5b所示。对于cs，1655、1597、1383 cm-1
处的吸收峰分别代表酰胺i (c-o伸缩振动)、伯胺(n-h弯曲振动)和c-h弯曲振动。对于β-gp，po
43-的对称和不对称伸缩振动峰分别出现在978 cm-1
和1080 cm-1
附近。po
43-基团的面内弯曲振动位于800-500 cm-1
。在sa的ir光谱中，1634和1420 cm-1
的特征吸收峰归属于羧基(c=o)的对称和不对称伸缩振动，c-o的伸缩振动峰位于1032 cm-1
。在vbps的红外光谱中，1629和1583 cm-1
的吸收峰归属于酰胺ⅰ和ⅱ的特征吸收带，c-h和o-h的弯曲振动分别出现在1456和1404 cm-1
，1111 cm-1
的吸收峰是由c-o的伸缩振动引起的。对于cah和cavbph，po
43-的对称和不对称伸缩振动峰(973和1081 cm-1
)以及n-h振动吸收峰(1568 cm-1
)减弱，表明cs的部分-nh
3+
与β-gp的po
43-之间发生了静电作用。经ca
2+
交联后，水凝胶中与sa相关的o-h变形振动、c=o和c-o的伸缩振动明显减弱。cs的n-h变形振动(1634 cm-1
)以及sa的c=o伸缩振动(1597 cm-1
)峰强度减少或消失，这可能是sa结构中的-coo-和cs分子的-nh
3+
之间的相互作用所致。
[0070]
伤口的ph值一般介于弱酸性和中性范围内(5.4-7.4)，直接或间接地在伤口愈合中起重要作用。如图5c所示，cah和cavbph的ph值约为6.8。cah和cavbph的粘度分别为73.49
±
0.51 pa
·
s和76.75
±
0.01 pa
·
s (图5d)。
[0071]
适当潮湿的环境可以促进皮肤伤口愈合。图5e显示了水凝胶的重量随时间变化的曲线。在前6 h，cah和cavbph的重量迅速下降，10~48 h略有下降并至恒定。总体而言，水凝胶的初始含水量在85%以上，能较好地保持创面周围的湿润环境。良好的吸湿性相当于皮肤敷料吸收伤口分泌物的能力，与cah相比，cavbph具有更快的吸水能力，由于其丰富的多孔结构，在前1 h内就达到了最大的sr(图5f)，说明水凝胶支架可以迅速吸收渗出液，防止其在创面过度堆集。
[0072]
生物聚合物材料的可降解性是影响其医学应用的最重要特征之一。cah和cavbph的重量随着孵育时间的延长而逐渐降低(图5g)。前12 h的快速降解是由β-gp引起的，水凝胶在浸泡过程中，β-gp从中游离出来，使交联度降低。培养14天后，cah和cavbph的重量分别从100%下降到56.85
±
8.42%和59.26
±
2.70%，具有一定的生物降解性和抗水解性。
[0073]
vbps从cavbph中的累积释放行为如图5h所示。vbps在最初的48 h内迅速释放，前24 h约有50%的vbps被释放。水凝胶在培养液中孵育10天后，共释放82.04
±
1.10%的vbps。因此，cavbph水凝胶可以满足持续释放vbps的要求。
[0074]
1.3.2 体外生物活性皮肤破损处会产生大量自由基，导致dna断裂、脂质过氧化和相关酶失活。越来越多的研究表明，具有抗氧化活性的皮肤敷料提高了组织修复的效果。1 mg/ml和5 mg/ml的cavbph对dpph和abts自由基的清除能力显著高于cah组(p《0.05)，表明水凝胶的抗氧化能力与vbps的引入有关(图6a和b)。
[0075]
在本研究中，水凝胶和vbps处理组上清均呈无透明状，阳性对照组为鲜红(图6c)。定量结果表明，cah、cavbph和vbps的溶血率均低于5%，几乎不会引起溶血。因此，这些材料是生物安全的，可以用于皮肤护理。
[0076]
cah和cavbph对s. aureus (32 h)和e. coli (24 h)的抑菌活性如图6d-f所示。与对照组相比，cah和cavbph对s. aureus和e. coli的生长和增殖都有明显的抑制作用，一部分来源于cs固有的抑菌作用，而vbps的加入进一步增强了cs水凝胶的长效抑菌性能，从而减少了细菌入侵皮肤创面的机会。
[0077]
细胞毒性是水凝胶敷料临床应用的重要指标。如图6g所示，当水凝胶浓度从10 μg/ml增加到100 μg/ml时，细胞活力几乎保持不变。当浓度达到1000 μg/ml时，cah和cavbph处理的hacat细胞活力分别为81.29%和86.74%。根据gb/t 16886.5-2003 (iso 10993-5: 1999)，细胞存活率超过75%的样本通常被认为是无细胞毒性的。基于以上结果，cah和cavbph的毒性可忽略不计。
[0078]
1.3.3 体内伤口愈合效果为了探索cavbph作为皮肤敷料的潜在修复性能，对小鼠进行了全层皮肤修复实验(图7）。cavbph组愈合速度最快，与其他两组相比具有显著性差异(p《0.05)。第14天，cavbph组创面基本愈合，无结痂，多数出现毛发覆盖，优于cah组(p《0.001)，而对照组仍为未保留有未愈合的小创面。vbps表现出优异的抗氧化和缓释能力。因此，cah和vbps联合应用在抗感染和皮肤再生方面具有优势。
[0079]
1.3.4 组织学评估通过h&e染分析炎症细胞浸润、毛细血管形成和表皮厚度来评价伤口愈合的情况(图8a)。伤后7天，三组均可见浸润性淋巴细胞(白箭头)，提示有炎症反应，cavbph组的情况优于cah组和对照组。而且对照和cah组的创面缺少上皮层，cavbph组伤口处的表皮已基本恢复(蓝箭头)。另外，cavbph组的毛细血管(黑箭头)数量明显多于cah组和对照组。第14天时，各组皮肤再生相对完整，成纤维细胞大量增殖，淋巴细胞可忽略不计。微观结构方面，cavbph组纤维细胞排列致密、规则，且新生组织表皮较其他组更完整(图8b)。
[0080]
在创面愈合过程中，各组胶原纤维逐渐增多，且cavbph组的创面胶原含量最高，随着时间的推移，创面纤维结构更加成熟、致密、有序(p《0.05，图8a和c)。以上表明cavbph通过促进ecm的产生，表现优异的创面愈合能力。vbps具有较强的抗氧化能力和较低的mw，cavbph体系中引入vbps能更好地促进皮肤修复。
[0081]
1.3.5 ihc分析第7天，cd31、pcna和α-sma蛋白在水凝胶组中的表达高于对照组(p《0.01)，尤其是在cavbph组中的表达量最高(p《0.01，图9a-d)。cd68属于炎症的标志物，在巨噬细胞和其他单核细胞中普遍存在。7天时，cd68在对照组、cah组和cavbph组的表达水平依次降低(p《0.05，图9e)。第14天，上述四种蛋白的表达趋势与第7天相似，但α-sma在对照组和cavbph组之间差异不显著(p》0.05)。上述发现与h&e以及masson染的结果一致，表明cavbph可通过调节cd31、pcna、α-sma和cd68的表达，即增加血管生成、细胞增殖、ecm合成和减轻炎症，从而比cah更显著地促进伤口愈合。
[0082]
1.3.6 western blot分析敷料或药剂通常通过影响相关蛋白的表达而在伤口愈合中发挥作用。为进一步了解cavbph有效促进创面愈合的生物学机制，利用western blot分析了不同处理对pi3k/akt/mtor和sirt1/nf-κb通路相关蛋白的影响。如图10所示，第7天cavbp组创面组织中p-pi3k/pi3k、p-akt/akt和p-mtor/mtor的表达均显著高于对照组(p《0.05)。伤后2周，
cavbph组在调节pi3k/akt/mtor通路方面的效果仍优于cah组。
[0083]
伤后第7天，cavbph组sirt1的表达明显上调，nf-κb的表达受到抑制，与对照组相比有显著性差异(p《0.05，图11a和b)。此外，与对照组和cah组相比，cavbph还下调了促炎因子tnf-α和il-1β的表达(p《0.05，图11c和d)。14天后，相比于对照组，cavbph对sirt1/nf-κb信号通路及相关细胞因子仍具有显著影响(p《0.05)。与cah相比，添加vbps后cavbph可通过激活sirt1/nf-κb通路更有效的预防创面的急性炎症。
技术特征：
1.鹿血肽的制备及其在促进皮肤修复的药物或者化妆品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鹿血肽使用时是负载在水凝胶内，之后通过涂敷的方式涂在创伤的皮肤上。3.一种pi3k/akt/mtor信号通路的激活剂，其特征在于，该激活剂包括负载鹿血肽的水凝胶。4.一种促进皮肤伤口修复的方法，其特征在于：该方法为：在皮肤伤口处涂敷含有鹿血肽水凝胶的药物。5.一种鹿血肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）酶解：采用两步酶解法模拟鹿血的体外胃肠消化制备鹿血肽，配制20 mg/ml的鹿血溶液，用1-2 m hcl调节ph至1.5-2.5，37℃预热10-30min后，按酶底比1:10-50加入胃蛋白酶，溶液于恒温振荡器中以120 rpm的速度37℃消化2-4 h后，用1-2 m naoh调节ph值至7.5-8.0，加入胰酶，酶/底物=1:15-25，进一步反应 4 h，模拟肠道消化，在酶解过程中，使用1-2 m hcl或1-2 m naoh维持ph稳定，消化结束后，通过在沸水浴中加热15-30min使酶失活，反应物冷却至室温，8000 rpm离心30 min获得酶解液上清。随后上清液以双层慢速滤纸过滤2次获得鹿血肽，冷冻干燥置于-20℃保存备用；（2）分离、冻干：配置50 mg/ml的鹿血肽溶液，依次经过分子截留量为10 kda和3 kda的超滤膜进行分级处理，获得组分f1、f2和f3，并分别将3个组分通过150 da的纳滤膜进行脱盐处理，冻干后储存在-20℃备用。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，鹿血肽的原料为鹿茸血或者鹿血，f1组分的分子量大于10 kda，f2的分子量为3-10kda，f3的分子量为小于3kda，f3中赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸和谷氨酸占总氨基酸的56.73%，f3中共鉴定出372种肽。
技术总结
本发明涉及一种鹿血肽的制备方法及其医用用途。制备方法为：（1）酶解：采用两步酶解法模拟鹿血的体外胃肠消化制备鹿血肽。配制鹿血溶液，用HCl调节pH，预热后，加入胃蛋白酶。溶液于恒温振荡器消化，用aOH调节pH值，加入胰酶，进一步反应4 h，模拟肠道消化。在酶解过程中，维持pH稳定。消化结束后，加热使酶失活。离心得酶解液上清。过滤得鹿血肽，冷冻干燥备用；（2）分离、冻干：配置鹿血肽溶液，依次经过分子截留进行分级处理，获得相应组分，并进行脱盐处理，冻干得到不同组分的鹿血肽，制备得到的多肽可以用于皮肤感染性疾病的。以用于皮肤感染性疾病的。
