化合物(4S)-α,β-dehydrocurvularin的制备方法及应用
化合物(4s)-α
,
β-dehydrocurvularin的制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及抗肿瘤化合物制备领域，特别涉及化合物 (4s)-α,β-dehydrocurvularin的制备方法及应用。
背景技术：
2.化合物(s)-curvularin和(4s)-α,β-dehydrocurvularin具有抗癌活性， 其结构为12元环聚酮结构，在市场上价格昂贵，因其具有抗癌活性， 因此极具价值。是从弯孢菌(curvularia)菌株中首次分离得到。本发明 专利通过对p.meleagrinum sh-h-15菌株发酵工艺的优化，使用诱导 剂通过诱导作用获取化合物(s)-curvularin和 (4s)-α,β-dehydrocurvularin高产量发酵条件和工艺，并优化了其分离 制备方法，可以高效率制备化合物(s)-curvularin和 (4s)-α,β-dehydrocurvularin。
3.
技术实现要素：
4.为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种化 合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin的制备方法及应用。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案为：
6.本发明的第一个目的是提供化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin的 高效制备方法；包括如下步骤：
7.发酵：
8.(1)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加300μm cuso4、100μm nacl，培养温度为28℃，180rpm， 培养7d。
9.(2)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加zn(no3)2、fecl3、fe2(so4)3、nacl、kcl、mnso4。
10.(3)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加500μm nacl，培养温度为28℃，180rpm，培养7d。
11.分离工艺
12.将发酵2l样品得到的代谢产物进行分离纯化。发酵液经乙酸乙 酯萃取3次，菌丝经丙酮超声提取3次，分别减压浓缩回收有机溶剂， 获得提取物ex1和ex2。合并提取物ex1和ex2，获得总浸膏，总 浸膏利用硅胶柱正向柱谱分离，依次使用石油醚、二氯甲烷、二氯 甲烷：甲醇＝20:1、二氯甲烷：甲醇＝10:1、二氯甲烷：甲醇＝5:1醇的 顺序洗脱，得到馏份fr1-fr7，将fr2段样品经凝胶柱，用氯仿、甲 醇1:1洗脱后，再经硅胶柱洗脱依次用石油醚、
二氯甲烷洗脱获得化 合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin(重约210mg)，化合物(s)-curvularin(重 约189mg)。
13.本法明的第二个目的是提供一种野生菌株sh-h-15，其保藏编号 为：cctcc m 2022317，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心， 2022年3月25日。从石斛中分离得到。菌株为：penicillium meleagrinum sh-h-15。
14.本发明的第三个目的是提供一种上述化合物 (4s)-α,β-dehydrocurvularin的高效制备方法，化合物是从菌株sh-h-15 的pdb改良培养基中分离得到的。
15.使用sh-h-15菌株制备具有抗癌活性的化合物 (4s)-α,β-dehydrocurvularin和(s)-curvularin。
16.体外培养的人肺癌细胞(a-549)、乳腺癌(4t1)、结肠癌(hct116)。 体外培养的人肺癌细胞(a-549)、乳腺癌(4t1)、结肠癌(hct116)， 分别按照5.0
×
104个/ml的细胞密度接种于不同的96孔细胞培养 板，孵育24小时后，加入本发明药物，继续孵育肺癌细胞4小时后， 用mtt法测定活细胞的数目，检测以培美曲塞、奥沙利铂和他莫昔 芬作为阳性对照。化合物的ic
50
值通过浓度效应生长曲线计算确定。 权利要求2,使用本发明专利中所述无机盐离子用于增加sh-h-15菌 株发酵时增加化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin和(s)-curvularin的产 量。
17.进一步的，使用(4s)-α,β-dehydrocurvularin和(s)-curvularin作为 制备抗癌或其他活性化合物的原料药物。
18.进一步的，菌株p.meleagrinum sh-h-15的发酵培养方法为：将 菌株接入pdb培养基中，28℃，180rpm，培养3d制备得到种子液， 将种子液以10％(v/v)的接种量分别接入含有cuso4、zn(no3)2、 fecl3、fe2(so4)3、nacl、kcl、ca(no3)2、caso4、cacl2、nacl等 无机盐的培养基中，28℃，180rpm，培养7-10d后得到含 (4s)-α,β-dehydrocurvularin的发酵培养物。
19.进一步的，每升pdb培养基：土豆200g，葡萄糖20g，加纯 水1l，自然ph值；
20.进一步的，所述改性pdb培养基：土豆200g，葡萄糖20g， 加纯水1l，上述无机盐中的1中或2种，浓度在100-500μm之间， 自然ph值。
21.相对于现有技术，本发明的有益效果为：
22.本发明的工艺方法，能高效、高纯度制备具有抗肿瘤活性化合物 (4s)-α,β-dehydrocurvularin，且降低生产成本。
23.本方法可以大量制备化合物(s)-curvularin和 (4s)-α,β-dehydrocurvularin，纯度高，操作步骤少，易于纯化，绿环 保；
附图说明
24.图1为本发明化合物对乳腺癌细胞的作用图；
25.图2为本发明化合物对结肠癌细胞的作用图；
26.图3为本发明化合物对肺癌细胞的作用图；
27.图4为化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin的核磁检测数据图。
28.图5为化合物(s)-crvularin的核磁检测数据图。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细 描述：
30.如图1-5所示，
31.应用实例：
32.1、发酵条件工艺
33.(1)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加300μm cuso4、100μm nacl，培养温度为28℃，180rpm， 培养7d。
34.(2)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加zn(no3)2、fecl3、fe2(so4)3、nacl、kcl、mnso4。
35.(3)本专利所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中 添加500μm nacl，培养温度为28℃，180rpm，培养7d。
36.2、分离工艺
37.将发酵2l样品得到的代谢产物进行分离纯化。发酵液经乙酸乙 酯萃取3次，菌丝经丙酮超声提取3次，分别减压浓缩回收有机溶剂， 获得提取物ex1和ex2。合并提取物ex1和ex2，获得总浸膏，总 浸膏利用硅胶柱正向柱谱分离，依次使用石油醚、二氯甲烷、二氯 甲烷：甲醇＝20:1、二氯甲烷：甲醇＝10:1、二氯甲烷：甲醇＝5:1醇的 顺序洗脱，得到馏份fr1-fr7，将fr2段样品经凝胶柱，用氯仿、甲 醇1:1洗脱后，再经硅胶柱洗脱依次用石油醚、二氯甲烷洗脱获得化 合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin(重约210mg)，化合物(s)-curvularin(重 约189mg)。
38.化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin的核磁检测数据如图4所示:
39.h nmr(400mhz,meod)δ6.62,6.61,6.60,6.58,6.57,6.56,6.55, 6.52,6.49,6.29,6.29,6.25,6.25,4.85,3.76,3.71,3.47,3.43,3.37,3.34, 3.33,3.31,3.31,3.31,3.30,3.30,2.44,2.43,2.42,2.40,2.38,2.37,2.34, 2.33,2.32,2.31,2.31,2.29,2.29,2.28,2.26,2.25,1.99,1.97,1.96,1.96, 1.88,1.88,1.87,1.85,1.85,1.84,1.82,1.82,1.63,1.63,1.61,1.61,1.59, 1.58,1.58,1.56,1.54,1.53,1.53,1.20,1.18.
40.13
c nmr(101mhz,meod)δ200.04,173.03,162.30,162.11,154.29, 137.07,133.36,117.85,112.23,102.85,74.24,49.64,49.42,49.21,49.00, 48.79,48.57,48.36,42.47,35.17,34.22,25.48,20.36.
41.化合物(s)-crvularin的核磁检测数据如图5:
42.13
c nmr(101mhz,meod)δ209.76,172.83,161.23,159.51,137.23, 120.92,112.23,102.72,73.80,49.64,49.43,49.21,49.00,48.79,48.57, 48.36,44.66,40.51,33.01,27.75,24.94,23.86,20.48.
[0043]1h nmr(400mhz,meod)δ6.26,6.25,6.22,6.22,4.94,4.93,4.93, 4.92,4.91,4.90,4.90,4.88,4.85,3.88,3.84,3.64,3.60,3.35,3.31,3.31, 3.31,3.30,3.25,3.24,3.22,3.22,3.21,3.20,3.18,3.18,2.78,2.77,2.75, 2.75,2.74,2.73,2.71,2.71,1.77,1.76,1.76,1.74,1.73,1.72,1.62,1.61, 1.59,1.59,1.58,1.57,1.56,1.55,1.52,1.51,1.50,1.49,1.48,1.47,1.46, 1.46,1.44,1.43,1.43,1.42,1.40,1.39,1.38,1.37,1.35,1.34,1.33,1.32, 1.31,1.30,1.29,1.28,1.27,1.27,1.25,1.24,1.13,1.12。
[0044]
实施案例：
[0045]
体外培养的人肺癌细胞(a-549)、乳腺癌(4t1)、结肠癌(hct116)。 体外培养的人肺癌细胞(a-549)、乳腺癌(4t1)、结肠癌(hct116)， 分别按照5.0
×
104个/ml的细胞密度接种于不同的96孔细胞培养 板，孵育24小时后，加入本发明药物，继续孵育肺癌细胞4小时后， 用mtt法测定活细胞的数目，检测以培美曲塞、奥沙利铂和他莫昔 芬作为阳性对照。化合物的ic
50
值通过浓度效应生长曲线计算确定。 效果参见图1-3。
[0046]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。
技术特征：
1.一种野生菌株sh-h-15，其特征在于，其保藏编号为：cctcc m 2022317，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏时间2022年4月1日；从石斛中分离得到；菌株为：penicillium meleagrinum sh-h-15。2.化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin的制备方法；其特征在于：包括如下步骤：发酵：使用培养基培养权利要求1所述菌种：其中(1)所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中添加300μm cuso4、100μm nacl，培养温度为28℃，180rpm，培养7d。(2)所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中添加zn(no3)2、fecl3、fe2(so4)3、nacl、kcl、mnso4。(3)所述培养基成分为pdb培养基为基础培养基，其中添加500μmnacl，培养温度为28℃，180rpm，培养7d；分离将发酵样品得到的代谢产物进行分离纯化；发酵液经乙酸乙酯萃取3次，菌丝经丙酮超声提取3次，分别减压浓缩回收有机溶剂，获得提取物ex1和ex2；合并提取物ex1和ex2，获得总浸膏，总浸膏利用硅胶柱正向柱谱分离，依次使用石油醚、二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇＝20:1、二氯甲烷：甲醇＝10:1、二氯甲烷：甲醇＝5:1醇的顺序洗脱，得到馏份fr1-fr7，将fr2段样品经凝胶柱，用氯仿、甲醇1:1洗脱后，再经硅胶柱洗脱依次用石油醚、二氯甲烷洗脱获得化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin，化合物(s)-curvularin。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，使用所述无机盐离子用于增加sh-h-15菌株发酵时增加化合物(4s)-α,β-dehydrocurvularin和(s)-curvularin的产量。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，菌株p.meleagrinum sh-h-15的发酵培养方法为：将菌株接入pdb培养基中，28℃，180rpm，培养3d制备得到种子液，将种子液以10％(v/v)的接种量分别接入含有cuso4、zn(no3)2、fecl3、fe2(so4)3、nacl、kcl、ca(no3)2、caso4、cacl2、nacl等无机盐的培养基中，28℃，180rpm，培养7-10d后得到含(4s)-α,β-dehydrocurvularin的发酵培养物。5.根据权利要4所述方法，其特征在于：每升pdb培养基：土豆200g，葡萄糖20g，加纯水1l，自然ph值。6.根据权利要5所述方法，其特征在于：所述改性pdb培养基：土豆200g，葡萄糖20g，加纯水1l，上述无机盐中的1中或2种，浓度在100-500μm之间，自然ph值。
技术总结
本发明公开了化合物(S(4S)-α,β-dehydrocurvularin的制备方法及应用，该方法包括如下步骤：发酵条件的选择，分离条件的优化。本发明的工艺方法，能高效、高纯度制备具有抗肿瘤活性化合物(4S)-α,β-dehydrocurvularin，且降低生产成本。且降低生产成本。且降低生产成本。
