保藏

一、石蜡油低温保藏法

本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌

体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水

分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在

-4

～

4

℃下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。具体操作是：菌种

为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶

中经过

121

℃高压蒸汽灭菌

1

～

2h

，将其放烘箱中

(160

℃左右

)

干热处

理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入

斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约

1cm

为

宜。

二、甘油管冷冻保藏法

1

．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到

抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将

80%

的甘油高压蒸汽灭菌待

用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液

(108

～

1010/ml)

。取

1ml

灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为

10%-30%

，于

-70

℃下冻存。

-20

℃保存时间较短。或采用体积比为

8

：

2

的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至

-20

℃冰箱保存。

2

．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、

弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果

好，无变异现象发生。甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，

其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培

养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

三、真空冷冻干燥法

1

．试验原理

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏

的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、

酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物

不到

2%

。冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件

下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华

过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和

脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产

生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态

下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。

干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。

2．试验步骤

1

）安瓿管准备选取规格约直径为

8mm

，高

100mm

的中性玻

璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏

水涮洗

2

～

3

次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面

朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。

2

）保护剂的选择及制备冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很

多，效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用

效果更好。在配制时注意比例、浓度、

pH

和灭菌方法。一些对热敏

感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌

温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等要控制灭菌温度。一

般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。

3

）菌种准备及分装菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于

稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加

2

～

3ml

保护剂，用

接种环将菌苔轻轻刮起

(

注意勿刮起培养基

)

，制成菌悬液。如用液体

培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌

体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到

108

～

1010cfu/ml

为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用

灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥机效能而定。

4

）预冻分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在

-30

～

-40

℃下冻

结20～60min，也可以用干冰和无水乙醇冻5～10min。

5

）冷冻干燥经预冻的安瓿放入干燥箱中开始抽真空干燥。此

时干燥箱温度控制在-30℃以下，并尽快使真度达到66Pa以下。此后

可还渐升温以加速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。

干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而定，以样品最终水分含

量达到

1%

～

3%

为准。具体操作时是根据冻干样品呈酥块工松散片

状；真空度接近空载时最高真空；样品温度与管外温度接近。

干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频真空检测

真空度。

6

）保藏及冻干管的启用密封好的冻干管在

4

℃或

-18

℃下保藏。

当需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条

件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷的无菌水，

使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎管口，加入

0.3

～

0.5ml

液体培养基

溶解冻干菌块成为悬液，用无菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基

进行培养。

7

）影响菌株生长因素

①菌的质量：保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下，使

之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处，作为冷冻干

燥的菌悬液细胞浓度要高不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果

保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受

到影响。

②保护剂：不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的，如

个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达

99.99%

，而采用葡

聚糖等混和保护剂时死亡率大大减少。一般情况下，那些容易保存的

菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却

很苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。

③干燥速度：实验表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉

菌

6h

干燥存活率为

67.3%

，而

3h

为

59%

。

④空气的影响：冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细

胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保

存。

⑤温度的影响在干燥和真空状况下温度的影响远没有上述几项

因素重要，因此可以在室温下保存，但许多微生物在

4

℃保存的存活

率要比在室温下高

1

倍。⑥含水量的影响：水分含量过高对菌存活

不利，完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在

3%以下(1%～3%)。⑦复苏培养：打开安瓿管后加入无菌水使冻干

菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。

菌种能否适宜于冻干保存，需经过实验来证明，一般是在保存1

个月进行复苏培养，如果菌的成活率高于

10%

，即认为可用冻干保存

法保存，以后6个月、2年、5年、10年再进行检查存活情况，以确

定保存期的上限。

冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌＞放线菌＞真菌＞藻

类，而菌丝体不宜用此法保存。

3．试验效果冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌

种可保存

5

年以上，有的可保藏

15

年以上不发生变异。还具有体积

小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方

法。

4．试验仪器及试剂冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个

部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制

温度范围为

-40

～

40

℃。

四、液氮超低温保存

1

．试验原理本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数

微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各

种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，

都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液

氮保存的原理是微生物在-130℃以下温度时，它的新陈代谢作用停

止，化学反应也消失，而液氮温度可达

-196

℃，在这种情况下可以长

期保存。

2

．试验步骤

1)

安瓿管准备一般要求用

95%

料或

GG17

的玻管制作，以能

承受巨大的温差变化而不破损，大小根据需要而定。用印同在管壁上

书写菌号，160℃烘干，加棉塞灭菌备用。

2)

菌种准备在最适培养基斜面上培养得到健壮菌种，制成

悬浮液，如为不产孢子的真菌，则采用斜面或液体振荡培养，制成菌

丝片段。将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中，每管

0.2

～

0.5ml

，然后用火

焰将安瓿熔封。

3)

冻结将熔封后的安瓿管入大慢速冻结器上，以每分钟下

降1℃的速度冷冻，当安瓿管温度下降至-35℃时，即可把安瓿管移入

液氮内作长期保藏。

4)菌种的复苏培养直至全部溶化为止，当溶化后即开启安

瓿移至培养基内培养，扣作时应特别注意安全，防止爆炸或冻伤，不

宜戴线手套，要戴皮手套操作

3

．试验仪器及试剂

1

）保护剂与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要有保护

物质，可以用

10%

的甘油，使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感，

效果不佳，可选用其他保护剂，常用的有

5%

～

10%(V/V)

二甲基亚砜；

20%

二甲亚砜加

1%

蛋白陈；吐温

80

及

0.4mmol

聚乙烯氮戊环等，糖

类也可作为一种保护剂，但浓度适当加以控制。

2

）液氮罐