实验目的

微生物学实验目的与要求

实验五病原性球菌

目的

(一)掌握致病性葡萄球菌的特征；抗链

球菌溶血素“O”试验；甲型链球菌与肺炎

链球菌区别。

(二)熟悉三种链球菌在血平板上的区

分；肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌的形态特征。

(三)了解病原性球菌的形态、染色性。

内容

(一)病原性球菌的形态及染色性(示

教)。

(二)葡萄球菌培养及生化特性(示教)。

(三)致病性葡萄球菌的鉴定(操作)。

(四)链球菌的培养与抗链球菌溶血素

“O”试验(示教与操作)小学生春节日记 。

(五)肺炎链球菌与甲型链球菌的区别

(示教)。

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(六)脓汁或咽拭子分离培养(操作)。

一、病原性球菌的形态及染色性(示教)

1．葡萄球菌的形态及染色性tanx定义域 (示教)

【材料】

金黄色葡萄短发美女图片 球菌革兰染色示教片。

【方法】

油镜观察细菌的形态、排列及染色性。

2．链球菌的形态及染色性(示教)

【材料】

乙型链球菌血清肉汤培养物制作的革

兰染色示教片。

【方法】

油镜观察链球菌的形火影忍者白图片 态、大小、排列及

染色性。

3．肺炎链球菌的形态结构及染色性(示

教)

【材料】

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肺炎链球菌革兰染色示教片、肺炎链球

菌荚膜示教片。

【方法】

油镜观察二张示教片中肺炎链球菌的

形态结构特点及其染色性。

4．脑膜炎奈瑟菌的形态及染色性(示教)

【材料】

脑膜炎奈瑟菌革兰染色示教片。

【方法】

油镜观察注意形态、大小、排列以及染

色性。

5．淋病奈瑟菌的形态及染色性．

【材料】

淋病性尿道、阴道脓汁涂片（革兰染

色）。

【方法】

油镜观察细菌形态、排列、在细胞内或

外及染色性。

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二、葡萄球菌培养及生化特性(示教)

【材料】

1．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血

琼脂平板培养物

2．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌甘

露醇管

【方法】

1．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌

的血琼脂平板培养物，观察二种葡萄球菌单

个菌落的形态、大小、表面、边缘、透明度、

颜色及溶血性(如颜色不易区别时，可用滤纸

片揩抹菌落观察)。

2．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌

的甘露醇发酵管，观察二者对甘露醇的分解

情况。

三、致病性葡萄球菌的鉴定

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致病性葡萄球菌的鉴定，一般实验室都

根据以下特征，其中尤以血浆凝固酶试验意

义最大。

1．产生金黄色色素。

2．对家兔或羊红细胞有溶血作用。

3．分解甘露醇，产酸不产气。

4．血浆凝固酶试验阳性。

5．耐热DNA酶试验阳性。

血浆疑固酶试验：试管法(示教)

【材料】

见实验四。

【方法】

见实验四

耐热DNA酶试验(示教)

【原理】

致病性葡萄球菌能产生DNA酶，它可

特异地分解DNA的磷酸戊糖联结的磷酸二

酯键；且有明显耐热性，经180℃15分钟或

60℃2小时也不灭活。此酶最适pH9.0，在

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含DNA基质的琼脂一Tris缓冲液中

(PH9.0)，随DNA被分解指示剂甲苯胺蓝从

蓝色变粉红色。

【材料】

经100℃煮沸15分钟后的金黄色葡萄球

菌，表皮葡萄球菌24小时液体培养物；甲

苯胺蓝-DNA-琼脂(PH9.0)。

【方法】

1．取装有3ml甲苯胺蓝-DNA-琼脂培

养基的小试管置沸水浴中溶化，浇小玻片一

块(琼脂全部用完)，待琼脂冷却凝固后，以

3mm直径打孔器打2个孔。

2．用无菌滴管吸取加热冷却后的金黄

色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌液，加人不同

的小孔中，置37℃培养2~3小时后观察结果。

3．凡小孔周围出现透明粉红色小圈者

为阳性，小孔周围仍为蓝色不透明者为阴

性。

注：指示剂甲苯胺蓝在酸性中呈红色，在

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中性或弱碱性溶液中呈蓝色。

四、链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验

(一)培养特性(示教)

【材料】

甲、乙、丙三型链球菌血琼脂平板及乙

型链球菌10％兔血清肉汤培养物。

【方法】竹芋的养殖方法和注意事项

1．观察三种链球菌在血琼脂平板上的

菌落形态，注意其大小、表面、透明度及溶

血情况。

2．观察链球菌在10％兔血清肉汤中生

长情况(混浊、沉淀、表面生长)。

(二)抗链球菌溶血素“O”(ASO)试验(操

作)

【原理】

链球菌侵人体内可释放溶血素“O”

(SO)，它刺激机体产生相应抗体(ASO)。试

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验时先以溶血素“O”与病人血清混匀产生

中和反应，再加入SO乳胶试剂，若病人血

清中ASO量很多，未被中和掉的抗体则与

乳胶试剂反应，产生清晰凝集，是为阳性；

反之为阴性，故本试验属体外中和反应，观

察到的现象为间接凝集。

【材料】

8单位/毫升链球菌溶血素“O”，l:15病人

血清，链球菌溶血素“O”乳胶试剂，黑底

玻片，滴管，对照（正常）血清。

【方法】

1．取已稀释的病人血清与正常血清各一

滴，分别滴于玻片的两侧，然后于两侧各加

一滴8单位/毫升链球菌溶血素“O”，晃摇

或用牙签混匀2分钟，使其充分混匀。

2．于上述混合液中各加一滴乳胶试剂，

晃摇或用牙签混匀3分钟，使其充分混匀。

3．立即观察结果：

(1)有清晰凝集者为阳性，血清滴度>500

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单位/毫升。

(2)无凝集者为阴性。

“注”：若需进一步测定其血清滴度，

用生理盐水将锡纸哪一面放食物 阳性血清再作对倍稀释，再按

第2项进行实验，若仍呈清晰凝集时，则血

清滴度>800单位/毫升。

五、肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)

(一)培养特性(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌血琼脂平板培

养物

【方法】

观察并比较两种细菌菌落的大小、形态及

溶血性等。

(二)菊糖发酵试验(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌菌落，公文写作基础知识 菊糖发酵

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管。

【方法】

1．挑取肺炎链球菌及甲型链球菌菌落分

别接种于菊糖发酵管中，37℃培养10~24小

时。

2．观察两种细菌在葡糖管中生长后的情

况，以溴甲酚紫变色与否作为是否发酵菊糖

的判断依据。

(三)胆汁溶菌试验(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌血清肉汤培养

液18小时生长物，去氧胆酸钠溶液，干燥

小试管，1毫升无菌吸管、试管架、生理盐

水、37℃水浴。

【方法】

1．取洁净小试管4支，标明1、2、3、4。

于第一及第二管内各加入0.2毫升牛胆汁或

10%胆盐溶液，第三及第四管中各置0.2毫

升生理盐水。

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2．用一吸管取0.8亳升肺炎链球菌血清肉

汤培养液置于第一管，再吸取0.8毫升至第

三管。用另一吸管吸取0.8毫升甲型链球菌

血清肉汤培养物于第二管；又0.8毫升于第

四管，混匀后置37℃水浴箱中15分钟到一

小时，取出观察，若液体变清即为胆汁溶菌

阳性，否则为阴性。

六、脓汁或喉拭子分离培养(操作)

【材料】

1．标本：脓汁或喉拭子。

2．培养基：血琼脂平扳、甘露醇发酵管、

菊糖发酵管。

3．兔血浆、生理盐水、毛细滴管、吸管、

小试管、试管架、革兰染液、玻片。

【方法】

1．将脓汁或喉拭子作涂片(注意先分离

培养，后作涂片，避免污染)，革兰染色后镜

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检，观察细菌形态、排列及染问卷分析报告 色性。

2．将脓汁或喉拭子材料接种血琼脂平

板，置37℃培养18~24小时。

3．根据菌落特点及涂片检查结果，作

出初步判断，必要时再作进一步鉴定。

（1）若菌落中等大小、完全溶血、不

透明、产生金黄色色素、涂片革兰染色阳性，

葡萄状排列，可能是金黄色葡萄球菌，可进

一步做血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验，

确定其致病力。

脓

涂片、革兰染

血琼

观察菌

生化反应、致病力

接

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（2）若菌落较小、半透明、完全溶血、

涂片革兰染色阳性、大都呈链状排列，为

乙型链球菌。

（3）若菌落较小、半透明、绿色不完全

溶血环，涂片革兰染色阳性、呈短链状排

列，为甲型链球菌或肺炎链球菌，需要进一

步鉴别，可作胆汁溶菌和菊糖发酵试验。

学生通过判别做进一步的实验（甘露醇

发酵和菊糖发酵试验）。将接种后的甘露醇

发酵管和菊糖发酵管放入37℃孵箱。

附录：

血琼脂平板培养基：加热融化pH7.6的肉

汤琼脂培养基100毫升，冷至45℃~50℃时，

以无菌操作加入脱纤维的兔血或羊血5~10

毫升。摇匀后倾注平板，冷凝后即成。37℃

孵誉24小时，无菌生长，即可使用。血琼

脂平板是营养培养基，因血液内含多种营养

物质，可促进营养要求较高的细菌的生长。

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血琼脂平板也可用来检测细菌的溶血性。血

液不耐热，故需待琼脂稍冷后才能加入。