TNFRSF13B基因rs34562254 SNP的应用

TFRSF13B基因rs34562254 SP的应用

本发明涉及生物医药领域，特别是一种人基因组中肿瘤坏死因子受体超家族成员13B（tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B, TFRSF13B）基因rs34562254单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SP）在制备检测中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品中的应用。

背景技术

SP是在基因组中的特定位置发生的单个核苷酸变异，包括转换（transition）、颠换（transversion）。碱基转换指的是嘌呤（腺嘌呤A、鸟嘌呤G）之间、或嘧啶（胞嘧啶C、胸腺嘧啶T）之间的替代，颠换指的则是嘌呤与嘧啶之间的替代。基因的编码区和非编码区均可能存在SP。编码区的SP有两种类型：同义突变（synonymous）和非同义突变（nonsynonymous）。同义突变的SP不影响蛋白质的氨基酸序列。非同义SP有两种类型：错义突变（missense）和无意义突变（nonsense）。错义突变的SP可以改变蛋白质的氨基酸序列，但由于密码子的简并性（即同一种氨基酸对应两个或更多密码子的现象），编码区内的SP不一定改变蛋白质的氨基酸序列。无意义突变。无意义突变的SP则可导致转录终止密码子，或转录mRA中的无义密码子，以及截短的、不完整的、通常是非功能性蛋白质产物。无意义突变的效应取决于终止密码子在编码DA中的位置。非编码区的SP尽管不影响蛋白质的氨基酸序列改变，但可能影响基因的剪接、转录因子结合、信使RA（messenger RA,mRA）降解或非编码RA的序列（noncoding RA, ncRA）。SP在体内中的变异频率＞1%，其形成的第三代遗传标志数量众多，人类许多的表型差异、对疾病的易感性、对药物的反应都与SP有关，常用于研究宿主遗传背景与疾病的相关性。

丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus, HCV）感染引起的病毒性肝炎，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌（HCC）。丙型肝炎呈全球性流行，根据世界卫生组织（WHO）报告，每年全球新发丙型肝炎病例约3.5万例，估计有7100万人患有慢性丙型肝炎，每年约有399000人死于丙型肝炎，主要来自肝硬化和HCC [http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c]。未来20年内与HCV感染相关的死亡率（肝衰竭及肝细胞癌导致的死亡）将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，是严重的社会和公共卫生问题。HCV传播途径主要包括血液透析、输血、注射、器官移植。少数未经的急性感染者可凭机体免疫反应清除HCV，称为自限性清除者，这部分人HCV RA阴性，HCV抗体阳性；大多数未经的急性HCV感染可进展为慢性感染/持续性感染，患者HCV RA阳性，HCV抗体阳性，这些持续感染者最终可发展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。我国人口老龄化日趋严重，而感染人口的老龄化必将增加我国丙型肝炎的卫生负担[PMID: 29527256]，在这期间，HCV相关的肝硬化和HCC病例也将大幅增加[PMID: 26513446]，除此之外，发病率日益增高的代谢综合征也会加剧这一效应效应[PMID: 25317237]。

疾病预后是一种可能性。预后分为自然预后和干预预后，疾病预后与患者的病因、体质、遗传背景、时机、疾病或疾病的发生程度、医学水平、合并的疾病、医生的个人能力、体质、年龄、患者是否正视疾病或对疾病的认知能力、是否继续等诸多因素有关，所以疾病预后有些是不可抗拒的，例如年龄体质等。有些是需要通过早期干预才可以降低患病或致死致瘫风险，或通过早期干预改善症状的。干预预后就是医生根据临床症状或影像、化验等途径获取患者病情信息，掌握病因、病理和病情程度等方面之外，重要的是要根据时机和方法结合操作中所发现的新情况，结合当前临床医学干预水平、临床经验来预测判断疾病的近期和远期疗效、转归或进展恢复的程度，后续所需要的时间和程序。包括如何康复，干预后遗留的症状、体征和并发症等其它异常的发生或消失及死亡。也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种疾病的可能性。HCV感染的预后也常称为感染的转归。

病毒因素、宿主免疫和遗传背景均可影响HCV感染的转归。近年来，出现了直接抗病毒药物（directly acting antiviral, DAA），DAAs通过直接抑制HCV蛋白酶、RA聚合酶或病毒的其他位点来清除HCV，减轻或清除肝损害，有利于阻止病情进展到肝硬化、失代偿、肝癌。适应症扩大、疗程显著缩短，且将丙型肝炎的治愈率从不到50%上升到超过90%，已成为替代聚乙二醇干扰素+利巴韦林的一线方案。但是，在DAA中出现了病毒学耐药问题。HCV是高度异质性的单股正链RA病毒，因其聚合酶缺乏“校读”功能，病毒基因组具有高度变异性，可形成大量的病毒亚型和准种。因此，耐药相关突变（resistanceassociated variants, RAVs）可能预先存在于患者感染的HCV病毒体中，并在DAAs期间作为优势种出现，因而导致DAAs的失败。目前已知的、与DAAs靶点（S3/4A、S5A和S5B）相关的有几十个RAVs位点。除此之外，HCV还存在DAAs治愈后再感染、DAAs乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）/HCV合并感染者激活HBV等新问题。HBV是引起乙型肝炎（简称乙肝）的病原体，属嗜肝DA病毒科，该科病毒包含正嗜肝DA病毒属和禽嗜肝DA病毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝DA病毒属。鉴于HCV感染的危害和防控的复杂性，筛查、识别遗传易感人是阻止HCV传播的首要问题，因此，进行中国人宿主遗传背景与HCV感染相关性的研究，有助于探索遗传基因在HCV感染进展的作用机制，早期防控丙肝流行。

肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily, TFSF）是在感染，损伤或侵袭过程中产生的多肽细胞因子，包括至少20个结构上相关的蛋白质，这些蛋白质作为配体，可与一个或多个受体分子发生特异性结合，这些受体分子称为TF受体超家族（TF receptor superfamily, TFRSF），TFRSF至少有28个成员。TFSF分子具有抗肿瘤、抗病毒和诱导细胞凋亡等多种生物学功能，这些功能是通过与TFRSF的相应成员结合，发生共刺激作用使信号转导入胞内而实现的，能启动多项生理功能，在调节人体免疫系统、神经系统、骨骼和外胚层器官的发育和稳态中起重要作用。这两个超家族成员以及相关的信号分子和蛋白质构成了一个具有特定结构和功能的生物网络。

TFSF/TFRSF在病毒感染免疫中具有双向调节作用，一方面可以诱导免疫细胞凋亡，另一方面可以促进免疫细胞的活化与增殖。若编码TFSF或TFRSF成员的基因发生突变，可引起淋巴细胞的特征性紊乱、免疫应答紊乱或免疫相关疾病。TFSF13，也称为增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand, APRIL）、CD256、TRDL-1等，是TFRSF17/BCMA受体的配体。TFRSF13B，也称为B细胞激活因子（B-cell activating factor , BAFF）、CD257、TACI、BLyS等，是TFRSF17/BCMA和TFRSF13C/BAFFR受体的配体。TFSF13/TFRSF13B均为TFSF/TFRSF成员，它们是B细胞强大的激活因子，对B细胞的发育很重要，T淋巴细胞可调节其功能，共同促进T细胞活化和存活。

TFSF13和TFRSF13B是先天免疫介质，与多种肿瘤和自身免疫性疾病相关。TFSF13是大量恶性肿瘤的潜在预后因素[PMID: 19291294]，血清TFSF13水平与系统性红斑狼疮（SLE）[PMID: 24748505]、类风湿性关节炎（RA）[PMID: 24898359]相关。TFRSF13B为B细胞提供必需的存活信号[2017, PMID: 28249164]，在调节B细胞稳态中起关键作用[2003，PMID: 12594954]，其基因的突变与人类常见的变异性免疫缺陷[PMID: 16007087]和IgA缺陷有关[PMID: 16007086]。

有研究发现，TFSF13 rs3803800与中国汉族人的IgA肾病易感性及血清TFSF13水平显著相关[PMID: 28636766]。TFSF13 rs3803800、TFSF13 rs11552708与日本人血清中免疫球蛋白IgG、IgM及IgA水平相关 [PMID: 22558069]。 TFRSF13B上的G76S突变导致免疫功能障碍并诱导巨核细胞凋亡，是功能获得性突变和遗传性免疫性血小板减少症（ITP）的易感性变异[PMID: 28834165]。在中国人中的全基因组关联研究（GWAS）表明，TFRSF13B中的rs4792800、rs12603708和rs3751987与IgG水平显著相关，而受遗传背景影响的血清IgG水平在体液免疫应答中起关键作用[PMID: 22673310]。TFRSF13B中的错义突变SP rs34562254可影响其编码的蛋白质与F-κB通路的相互作用，进而与多发性骨髓瘤相关[PMID: 27587788]。

TFSF13/TFRSF13B对宿主免疫调节具有重要作用，但是当 HCV 侵入机体后，TFSF13/TFRSF13B的基因多态性是否会影响HCV感染的结局，目前国内外尚未有人研究，目前国内外亦尚未有TFSF13或TFRSF13B的SPs与HCV感染相关性的研究报道。

在流行病学研究中，疾病的危险因素的确定和相关性研究是通过严谨的流行病学设计和研究、严格的数据分析才能得出，各种推理通常都是合乎科研假设的结果和结论，但是验证后的结果却未必符合推理，有时甚至相悖。科研结论的得出严格遵循事实和数据，不能基于假设，科研设计是为了验证科学假设，其结果可能符合假设，也可能不符合假设，这是科研的一般流程和常见的呈现方式。

人类基因大约有2万多个。每个基因含有的核苷酸数存在很大差异，因为大部分DA是双链的，所以基因的长度通常用碱基对（bp）来表示，短则几百个bps，长则数万bps。真核生物大部分基因（不含内含子）可含几千到一万多个bps。

为此，申请人课题组花费数年时间从数万个基因中筛选出了TFRSF13B基因及其中的rs34562254 SP，对TFRSF13B基因rs34562254SP的基因多态性是否会影响HCV感染的结局进行了试验和研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性的物质，所述物质包括扩增人TFRSF13B基因rs34562254在内的基因组DA片段的PCR引物和TaqManDA小沟结合物基团MGB探针。所述TFRSF13B基因来自于中国汉族人，丙型肝炎特指为中国汉族人的丙型肝炎。

世界人种基因图谱是不同的人体内含有不同人类基因的数据分析图谱。由持续数十万年的人类迁徙和对自然环境的适应演变形成。所述TFRSF13B基因来自于中国汉族人，丙型肝炎特指为中国汉族人的丙型肝炎。

进一步的，本发明还提出一种检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254单核苷酸多态性或基因型的物质在制备检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品中的应用，所述物质包括扩增人基因组中TFRSF13B基因rs34562254在内的基因组DA片段的PCR引物和TaqMan DA小沟结合物基团MGB探针；所述TFRSF13B基因来自于中国汉族人，丙型肝炎特指为中国汉族人的丙型肝炎；所述TFRSF13B基因rs34562254位点在年龄≥50岁者、女性及血者中，与HCV感染的遗传易感性相关；筛选TFSF13和/或TFRSF13B基因的区域和位点包括编码区、非编码区、基因侧翼区多态性位点、影响 mRA剪接的内含子区域的位点。

进一步的，所述PCR引物序列分别如SEQ ID O.1和SEQ ID O.2所示；所述TaqManDA小沟结合物基团MGB探针序列分别如SEQ ID O.3和SEQ ID O.4所示，并且SEQ IDO.3 和SEQ ID O.4的5’端均标记荧光报告基团，3’端均标记非荧光猝灭基团和DA小沟结合物基团MGB。

所述检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254单核苷酸多态性或基因型的物质在制备检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品中的应用，所述TFRSF13B基因rs34562254位点在年龄≥50岁者、女性及血者中，与HCV易感性相关。具体而言：

首先，与年龄≥50岁的携带rs34562254 C等位基因携带者相比，年龄≥50岁的rs34562254 T等位基因携带者，其HCV易感性风险升高23.4%。人类基因会随年龄而发生改变，2008年约翰霍普金斯医学研究院的研究人员发现，相比DA序列的固定不变，人类DA外部基因标记（化学标记），的确会随年龄发生改变，而且其改变程度在家族成员中是相近的。所以研究组提出基因健康是可遗传的，外部基因的改变也可解释为什么随年龄增长，疾病的易感性增加。而这种改变可能是由饮食和其他环境因素引起的。目前这种外部基因改变的学科已经有很多科学家在研究，称“表观遗传学”。因此，对于基因在疾病方面的检测来说，检测者不同的年龄，检测结果极有可能不同。本发明经过多次试验和筛选，本发明检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性的物质，发现：在年龄≥50岁者，rs34562254位点与HCV遗传易感性显著相关。具体而言，检测者的年龄为51岁、52岁、53岁、54岁、55岁、56岁、57岁、58岁、59岁……等以此类推，在此不在罗列。

其次，与rs34562254 C等位基因女性携带者相比，rs34562254 T等位基因的女性携带者，其HCV易感性风险升高28.5%。性别不同，基因对疾病的影响大不同。男性和女性的差别究竟有多大,以列魏茨曼科学研究所分子遗传学专家发现，男与女大约有6500个基因不同。他们利用GTEx计划收集的数据进行分析。这一数据采集自550名成年器官捐献者。在分析了2万个不同基因后，研究人员发现，其中有6500个基因的表达具有“性别差异”。本发明检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性的物质，发现：在女性中，rs34562254位点与HCV遗传易感性显著相关。

再次，与血的rs34562254 C等位基因携带者相比，血的rs34562254T等位基因携带者，其HCV易感性风险升高25.9%。本发明检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性的物质，发现：在血者中，rs34562254位点与HCV遗传易感性显著相关。

进一步的，筛选TFSF13和/或TFRSF13B基因的区域和位点包括编码区、非编码区、基因侧翼区多态性位点、影响 mRA剪接的内含子区域的位点。一般认为：由于蛋白质是执行生物体的生理、生命活动的最后一站使者，因此一般认为编码区SP与氨基酸改变和蛋白质活性直接相关，只有编码区的SP筛选才有意义。而实际上，非编码区、基因侧翼区、内含子的特定区域可能影响mRA的剪切、转录因子的结合等，进而对基因的转录调控产生影响，并最终影响基因、蛋白质的生物功能。因此，全面的筛选策略应该覆盖所有可能有功能意义的区域，并尽量避免筛选无功用区。从而实现筛选的全面、准确、经济高效。

进一步的，TFRSF13B基因rs34562254位点C/T突变，为TFRSF13B蛋白质序列251位脯氨酸（P, Pro）到亮氨酸（L, Leu）的突变，可能导致蛋白质结构的稳定性下降，推测其可能是rs34562254位点与HCV易感性相关的潜在分子机制。

进一步的，所述PCR引物包括，正向引物forward primer核苷酸序列如SEQ IDO.1所示，反向引物reverse primer核苷酸序列如SEQ ID O.2所示；所述TaqMan DA小沟结合物基团MGB探针包括，检测野生等位基因C的探针Probe-C：在SEQ ID O.3序列的5’端标记荧光报告基团6-羧基荧光素FAM，3’端标记FQ和MGB修饰基团；以及检测突变等位基因T的探针Probe-T：在SEQ ID O.4序列的5’端标记荧光报告基团六氯-6-甲基荧光素HEX，3’端标记FQ基团和MGB基团。

本发明的目的是还提供一种TFRSF13B基因SP rs34562254在制备检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品中的应用。

具体而言，本发明首先提供了以下任一用途：

（1）人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型在制备检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品中的应用。

（2）人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型在制备检测或筛查与中国汉族人丙型肝炎相关的SP的产品中的应用。

其次，本发明还提供了以下任一用途：

（1）检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质在制备检测或筛查中国汉族人丙型肝炎易感性产品中的应用。

（2）检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质在制备检测或筛查与中国汉族人丙型肝炎相关的SP的产品中的应用。

本发明中，检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质包括现有可用于检测SP的试剂或者试剂组合，也即，这些物质为本领域常规的、可用于检测TFRSF13B基因rs34562254 SP的检测方法所涉及的试剂和试剂组合。目前有多种方法可用于SP的分型和检测，如变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gelelectrophoresis，DGGE）、等位基因特异性PCR（allele specific PCR, ASPCR；包括TaqMan-PCR分型法）、酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS）、DA测序、DA芯片法等等。这些技术，有的难以实现大规模自动化检测，有的假阳性率偏高。因此，我们选择了操作便捷、价格低廉、敏感性高的TaqMan-PCR分型法。

本发明中，检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品包括上述检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质，可以为试剂或者试剂组合，还可以为试剂和仪器的组合产品，如引物、探针和核酸测序仪组合获得的产品，由TaqMan PCR试剂、核酸测序试剂和核酸测序仪组合获得的用于检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性产品。

本发明中，检测或筛查与中国汉族人丙型肝炎相关的SP的产品同样包括上述检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质，可以为试剂或者试剂组合，还可以为试剂和仪器的组合产品，如引物、探针和核酸测序仪组合获得的产品，由TaqMan PCR试剂、核酸测序试剂和核酸测序仪组合获得的检测或筛查与中国汉族人丙型肝炎相关的SP的产品。

本发明还提供了一种TaqMan PCR试剂，其含有扩增人TFRSF13B基因rs34562254位点在内的DA片段的PCR引物和TaqMan DA小沟结合物（minor groove binder, MGB）探针。

进一步，本发明所提供的TaqMan PCR试剂中，所述PCR引物序列分别如SEQ IDO.1和SEQ ID O.2所示；所述TaqMan MGB探针序列分别如SEQ ID O.3和SEQ ID O.4所示，并且SEQ ID O.3 和SEQ ID O.4的5’端均标记荧光报告基团，3’端均标记非荧光淬灭基团（non-fluorescent quencher, FQ）和MGB基团。

本发明中，rs34562254是人类染体17p11.2上的一个二等位多态性的SP位点，该变异是转换（C→T，在其互补链上则为G→A），所述rs34562254基因型是指基因型为CC、CT或TT；所述CC是rs34562254位点为C的野生基因型，所述TT是rs34562254位点为T的纯合突变基因型，所述CT是rs34562254位点为C和T的杂合突变基因型。所述检测人TFRSF13B基因rs34562254的SP/等位基因/基因型具体是指检测rs34562254的核苷酸种类。本申请说明书实施例表明：携带rs34562254纯合突变TT基因型的个体，在HCV感染者（病例组）体中的比例，高于携带纯合突变TT基因型的在未感染HCV人（对照组）中的比例，因此认为，与携带TFRSF13B基因rs34562254 CC野生基因型相比，携带TT基因型的个体对丙型肝炎遗传易感性更高。

进一步，本发明检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质包括TaqMan PCR试剂，该试剂包括扩增TFRSF13B基因rs34562254在内的DA片段的PCR引物和TaqMan MGB探针。

进一步，本发明中，所述PCR引物是指：正向引物（forward primer）核苷酸序列如SEQ ID O.1所示，反向引物（reverse primer）核苷酸序列如SEQ ID O.2所示；所述TaqMan 探针包括：检测野生等位基因C的探针（Probe-C）：在SEQ ID O.3序列的5’端标记荧光报告基团6-羧基荧光素（FAM），3’端标记FQ和MGB修饰基团；以及检测突变等位基因T的探针（Probe-T）：在SEQ ID O.4序列的5’端标记荧光报告基团六氯-6-甲基荧光素（HEX），3’端标记FQ基团和MGB基团。

本发明申请中，所述的丙型肝炎特指为中国汉族人的丙型肝炎。

本发明申请中所列的HCV感染者，即病例组，为HCV自限性清除者或HCV持续性感染者，入组标准：未经抗HCV，且HCV抗体阳性（HCV RA阴性或阳性）的研究对象。本文所列的HCV未感染者，即对照组，入组标准：HCV抗体阴性且HCV RA阴性研究对象。

排除标准为：合并感染HBV或其他嗜肝性病毒、合并感染HIV、入组前进行过抗HCV。满足以上三条中任何一条，即取消入组。

本发明采用的Taqman荧光探针5’端连接FAM或HEX，分别用于标记SP突变前后的两种等位基因，探针3'端连接FQ和MGB，后者用于提高核酸扩增时杂交链的稳定性。扩增初始，探针与互补序列靶向结合，随着核酸链的延伸，DA聚合酶逐渐移至FAM或HEX的位置时，探针被切断，彼时FQ失活，样本产生荧光信号，其强度与扩增产物的量呈正比。Taqman探针法兼具高敏感性和高特异性，常用于SP分型。

在本发明中，病例组包括1264名HCV感染者，对照组包括1513名HCV未感染者，携带TFRSF13B基因rs34562254 TT基因型者在病例组中的比例高于TT基因型在HCV未感染者（对照组）中的比例。这说明，与携带TFRSF13B基因rs34562254 CC野生基因型相比，携带TT基因型者对丙型肝炎遗传易感性更高，相对危险度为1.424倍（PBonferroni=0.005）。在显性模型和相加模型中，rs34562254 T等位基因与HCV遗传易感性的依然相关，相对危险度依次为1.233倍（PBonferroni=0.009）、1.191倍（PBonferroni=0.003）。应用于筛查时，可将检测rs34562254的多态性/等位基因/基因型物质与其他物质（如检测其它的与丙型肝炎相关的SP/等位基因/基因型物质）联用，制备筛查丙型肝炎遗传易感者的产品。

本发明的一个实施例中，ABI荧光定量PCR仪7900HT型用于扩增包括rs34562254的基因组DA片段，可直接判读384孔板上每个样本的荧光强度及基因型。

本发明根据候选SPs位点及其上下游序列，分别设计两条不同的探针和正/反向引物，探针和引物必须搭配使用，且设计策略不同，分型效果可有很大差别。进行核酸扩增时，如果一对染体SP位点的碱基相同，则只发出一种颜的荧光，然后再根据荧光的颜，进一步判定为该样本的位点是野生基因型还是纯合突变基因型：野生型（CC）或纯合突变型（TT）；当2条染体的SP位点碱基不同时，则会检测到两种颜的荧光信号，表明该样品的该位点是杂合突变基因型（CT）。检测结果如附图1所示。

本发明在一个中国汉族人的大样本（1264名HCV感染者和1513名对照者）中发现TFRSF13B基因rs34562254是与丙型肝炎遗传易感性相关的SP，可将检测rs34562254的SP/等位基因/基因型的物质与其他物质（如检测其它的与丙型肝炎相关的SP/等位基因/基因型物质）联用，制备筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感者的产品。

附图说明

图1为TaqMan MGB探针法对TFRSF13B基因rs34562254位点的基因分型图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。

本发明实施例含有下述的材料、试剂，除前述特殊说明的引物和探针外，均可从商业途径得到。

以下实施例涉及的核苷酸序列：

SEQ ID O.1（rs34562254位点正向引物序列Forward primer）：CTTCTGCTTCCCTGAGTGCA；

SEQ ID O.2（rs34562254位点反向引物序列Reverse primer）：GTCTGGGATGTGTGGGCAAG；

SEQ ID O.3（rs34562254位点Probe-C）：TGGGACCCCCGACC；

SEQ ID O.4（rs34562254位点Probe-T）：CTGGGACCCTCGAC；

SEQ ID O.5（rs3803800位点正向引物序列Forward primer）：ACCTAACCTTGACCCTCTTTCC;

SEQ ID O.6（rs3803800位点反向引物序列Reverse primer）：TGGAAGCCTCACTCTTCTGTTT；

SEQ ID O.7（rs3803800位点Probe-C）：TCTCCCCACTCTCCCAG；

SEQ ID O.8（rs3803800位点Probe-T）：TCTCCCCATTCTCCCAG；

SEQ ID O.9（rs11552708位点正向引物序列Forward primer）：TGCTGACCCAACAAACAGAG;

SEQ ID O.10（rs11552708位点反向引物序列Reverse primer）：GATACCCTTCCCCATTCTGG；

SEQ ID O.11（rs11552708位点Probe-C）：CCTGTCCCCTGCAGC；

SEQ ID O.12（rs11552708位点Probe-T）：CCTGTCCTCTGCAGCC；

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所有入组的研究对象均书面签署了知情同意书，本研究的技术方案经江苏省人民医院伦理委员会批准，符合世界医学会新修订的赫尔辛基宣言中涉及人类医学研究的伦理准则的条款 [PMID: 24141714]。

以下实施例纳入的研究对象如下：（1）768名HCV持续性感染者；（2）496名HCV自限性清除者；（3）1513名对照者。病例组/HCV感染者指：HCV持续性感染者或HCV自限性清除者。在性别、年龄和地理地区方面，上述三组无统计学差异。在所有研究对象入组后、连续一年的随访中，临床检测结果至少有三次重复的、一致的实验结果验证。临床诊断标准：中华医学会肝病学分会和感染病学分会发布的最新版《丙型肝炎防治指南》。

实施例1 制备检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质

制备用于检测或筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感性的检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254SP/等位基因/基因型物质的方法，包括如下步骤：

S1：基因组DA的提取

(1) 紫帽真空采血管收集研究对象外周静脉血，吸取全血，加入等体积的磷酸缓冲液，充分混匀；加入淋巴细胞分离液，按照一定转速离心一定时间后，吸取白细胞，以磷酸缓冲液清洗，离心弃上清，冻存；

(2) 白细胞用等体积的磷酸缓冲液重新悬浮，然后以商品化QIAGE DA提取试剂盒提取DA，制得DA溶液冻存；

(3) 取DA溶液，以紫外分光光度法测定260nm和280nm处吸光光度，OD260=l~20表明提取的DA浓度符合要求；计算OD260/OD280比值=1.8-1.9表明DA纯度符合要求；

(4) 稀释DA溶液至50-200ng/µl，混匀保存，用于SP基因分型；

S2:HCV RA提取

以QIAGE HCV RA提取试剂盒;

S3:HCV RA定量

采用COBAS HCV核酸定量试剂盒，提取、扩增并测定HCV RA载量；

S4：HCV基因分型

(1) HCV RA阳性者的基因分型

以HCV基因分型检测试剂盒，基于HCV基因组C-E1区段对 HCV RA阳性者进行病毒分型；

(2) HCV RA阴性者的基因分型

以雅培HCV Serotyping 1-6 Assay 试剂盒，基于HCV病毒型特异性抗体的ELISA法对HCV RA阴性者进行HCV基因分型；

S5： SP候选位点筛选

筛选TFSF13和TFRSF13B基因的编码区、非编码区、基因侧翼区多态性位点、影响mRA剪接的内含子区域的位点；

S6：SP位点基因分型

将DA标本稀释为10ng/μl，加样至96孔板；稀释Taqman引物和探针到指定浓度，充分混匀，然后配制PCR体系，得到检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254 SP或基因型的物质；该物质为包括扩增TFRSF13B基因rs34562254位点在内的基因组DA片段的TaqMan MGB探针和PCR引物的TaqMan PCR试剂，或检测SP基因型的试剂或试剂盒。

详细步骤如下：

1、基因组DA的提取

(1)紫帽真空采血管收集研究对象外周静脉血5ml，吸取全血，加入等体积的磷酸缓冲液，充分混匀；缓慢加入淋巴细胞分离液，1500转/min离心20min后，小心吸取白细胞，以磷酸缓冲液清洗，离心弃上清，-80℃冻存。

(2) 白细胞用等体积的磷酸缓冲液重新悬浮，然后以商品化QIAGE DA提取试剂盒提取DA，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，制得DA溶液于-80℃冻存。

(3) 取DA溶液，以紫外分光光度法测定260nm和280nm处吸光光度，OD260=l~20表明提取的DA浓度符合要求；计算OD260/OD280比值=1.8-1.9表明DA纯度符合要求。

(4) 稀释DA溶液至50-200ng/µl，混匀保存，用于SP基因分型。

2、HCV RA提取：以QIAGE HCV RA提取试剂盒，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

3、HCV RA定量：采用COBAS HCV核酸定量试剂盒，提取、扩增并测定HCV RA载量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

4、HCV基因分型

(1) HCV RA阳性者的基因分型：以立菲达安HCV基因分型检测试剂盒，基于HCV基因组C-E1区段对 HCV RA阳性者进行病毒分型，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

(2) HCV RA阴性者的基因分型

以雅培HCV Serotyping 1-6 Assay 试剂盒，根据HCV病毒型特异性抗体的酶联免疫吸附法对HCV RA阴性者进行HCV基因分型，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

5、SP候选位点筛选

筛选TFSF13和TFRSF13B基因的编码区、非编码区、基因侧翼区多态性位点、影响mRA剪接的内含子区域的位点；以HaploView软件，基于千人基因组计划 (http://www.1000genomes.org/) 中国北京人（CHB）的数据库，设置关联系数 r2 >0.8；最小等位基因频率（minor allele frequency, MAF）>0.05；结合与病毒性肝炎等其它免疫相关疾病关系密切的多态性位点进行选择与补充。根据以上原则，本实施例选择了3个候选位点：TFRSF13B rs34562254和TFSF13 rs3803800、rs11552708。

TFRSF13B基因位于人类染体17p11.2，含有5个外显子和4个内含子。rs34562254位于TFRSF13B基因的5号外显子，为错义突变，该位点突变可改变氨基酸序列，由脯氨酸（Pro）变为亮氨酸（Leu）。TFSF13基因位于人类染体17p13.1，含有6个外显子和5个内含子。rs3803800、rs11552708分别位于TFSF13基因的2号外显子和1号外显子，均为错义突变，rs3803800的突变可使氨基酸由天冬酰胺（Asn）变为丝氨酸（Ser），rs11552708的突变可使氨基酸由甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg），这两个位点的突变均改变了蛋白质的一级结构。

6、SP位点基因分型

（1） 将DA标本稀释为10ng/μl，加样至96孔板。稀释Taqman引物和探针到指定浓度，充分混匀，然后配制PCR体系如表1所示：

表1 Taqman PCR体系配制

上述表1体系即为检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质；本实施例中获得的上述物质为包括扩增TFRSF13B基因rs34562254位点在内的基因组DA片段的TaqMan MGB探针和PCR引物的TaqMan PCR试剂，在具体实施中，也可以使用其他本领域常规的检测SP基因型的试剂或试剂组合。

实施例2 TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的应用

检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254单核苷酸多态性或基因型的方法，包括如下步骤：将检测人基因组中TFRSF13B基因rs34562254 SP或基因型的物质分装至8个灭菌PCR管；取5μl/孔体系液加入384孔板中，再加入1μl/孔DA样本；每板设2个阴性对照无菌双蒸水、2个阳性对照，以控制交叉污染；以专用膜将加样的384孔板封闭，离心；置入荧光定量PCR仪，设置PCR反应条件；PCR反应结束后，读取基因分型结果。

进一步的，详细步骤如下：

1、SP分型

将实施例1获得的检测人TFRSF13B基因rs34562254 SP/等位基因/基因型的物质（即按照表1体系配制好的体系溶液）分装至8个灭菌PCR管。取5μl/孔体系液加入384孔板中，再加入1μl/孔DA样本。每板设2个阴性对照（无菌双蒸水）、2个阳性对照，以控制交叉污染。

以专用膜将加样的384孔板封闭，离心1min。置入7900HT型荧光定量PCR仪，设置PCR反应条件：50℃预变性2min，95℃始变性10min；95℃退火15秒，60℃延伸1min，45个循环。PCR反应结束后，以ABI公司的Sequence Detection System软件（版本2.3）读取基因分型结果。

3个SP的位点的基因分型成功率均高于95%。rs34562254位点的基因分型结果如附图1所示，图1中，CC表示表野生CC基因型，CT代表杂合突变CT基因型，TT代表纯合突变TT基因型。

2、问卷调查及质量控制

采用结构标准化问卷对研究对象进行流行病学调查，问卷收集了性别、年龄、地区、HCV感染史、HCV史及其他HCV风险因素暴露史。制订流行病学调查手册和实验室标准化操作规程，统一培训工作人员，以保证本研究获得的数据质量。所有数据统一编码，双人双轨用EpiData 3.1软件录入计算机，复核无误后建立数据库。所有结果以双人盲法判读，以避免主观偏倚。对或判读有疑问或检测不成功的标本，重复检测直至结果一致。每组随机抽取10%的标本复测，一致率达100%。

3、统计分析

采用SPSS软件（版本24.0）进行数据分析。年龄以平均值（mean）±标准偏差（standarddeviation, SD）表示。对照组/未感染组、自限性清除组、持续性感染组之间性别、年龄、HCV患者转氨酶、HCV基因型及感染途径的差异比较，用Welch检验、χ2 检验。Pearson's χ2 检验用于评估对照组的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。多因素的Logistic回归分析用于比较组间的SPs分布频率的差异，同时校正了混杂因素。优势比（ORs）和95%置信区间（CIs）用于衡量SPs与HCV易感性和持续性感染风险之间的关系。分层分析用于分层控制风险因素的影响。以Bonferroni法校正多重比较，此方法最保守，双侧P值< 0.0167（即0.05/3）具有统计学意义。非多重比较处，双侧P值< 0.05具有统计学意义。

4、研究对象的社会人口学及临床特征

三组人的社会人口学及临床特征如表2所示。持续性感染组包括768例患者（273名男性，495名女性，平均年龄为51.89±12.37岁）。自限性病毒清除组包括496人（194名男性，302名女性，平均年龄为51.12±13.82岁）。对照组包括1513名未感染者（603名男性，910名女性，平均年龄为52.65±13.30岁）。三组间的年龄和性别没有统计学差异（P >0.05），三组间ALT水平、AST水平和感染途径存在统计学差异（P < 0.001），且持续性感染组和自限性清除组感染的HCV基因型存在显著差异（P < 0.001）。

表2 HCV持续感染组、自限性清除组和对照组的人口学及临床特征

备注：Group A：对照组（未感染组），Group B：自限性清除组，Group C：持续性感染组，Group (B+C)：感染组（病例组）。mean: 平均值；SD：标准偏差；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天门冬氨酸氨基转移酶；a Welch检验；b χ2检验。

5、Hardy-Weinberg遗传平衡检验

本研究中，rs34562254：P =0.601；rs3803800：P =0.589； rs11552708：P=0.081。 3个SP位点分布频率符合Hardy-Weinberg遗传学平衡（P>0.05），即对照组具有人代表性。

6、TFSF13和TFRSF13B基因多态性与HCV感染易感性的关联分析

3个SP位点（rs34562254、rs3803800和rs11552708）的基因型分布频率及以三种遗传模型（显性模型、相加模型和隐性模型）分析SP与HCV感染易感性的关联见表3。

表 3 TFSF13和TFRSF13B基因中SPs位点与HCV感染易感性、慢性化的Logistic回归分析

备注：CI：置信区间，HCV：丙型肝炎病毒，OR：比值比，SP：单核苷酸多态性。

Group A：对照组（未感染组），Group B：自限性清除组，Group C：持续性感染组，Group (B+C)：感染组（病例组）。

aLogistic回归调整后的P值、OR值和95%置信区间，调整因素为性别、年龄及感染途径。

b Logistic回归调整后的P值、OR值和95%置信区间，调整因素为性别、年龄及感染途径。

采用Bonferroni法对多重比较进行校正，P<0.0167 (0.05/3)为有统计学差异。

字体加粗者为数据有统计学差异。

经逻辑回归调整混杂因素（性别、年龄和感染途径）后发现，rs34562254 TT基因型携带者感染HCV的风险升高，相对危险度为1.424倍，具有统计学意义（P=0.005）。在显性模型、相加模型中，rs34562254 T等位基因与HCV易感性的依然存在统计学相关，相对危险度依次为1.233倍（P=0.009）、1.191倍（P=0.003）。此外，未发现rs3803800和rs11552708的基因型与HCV感染易感性有统计学相关（P均>0.05，见表3）。

以性别、年龄、感染途径作为分层因素，对TFRSF13B基因中rs34562254位点与HCV感染易感性风险进一步的分层分析，如表4所示。研究人按平均年龄，被分为＜50岁和≥50岁亚组，用于进一步分析。在年龄≥50岁的亚组、女性亚组及血亚组中，rs34562254 T等位基因与HCV易感性存在统计学关联（P值均<0.05），年龄≥50岁的亚组的相对危险度为1.234倍（P=0.006），女性亚组的相对危险度为1.285倍（P=0.001），血亚组的相对危险度为1.259倍（P=0.003）。

表 4 TFRSF13B基因中的rs34562254位点与HCV感染易感性关系的分层分析

备注：HCV：丙型肝炎病毒，CI：置信区间，OR：比值比，SP：单核苷酸多态性。

Group A：对照组（未感染组），Group B：自限性清除组，Group C：持续性感染组，Group (B+C)：感染组（病例组）。

aLogistic回归调整后的P值、OR值和95%置信区间，调整因素包括性别、年龄、感染途径，视分层因素而定。

b Logistic回归调整后的P值、OR值和95%置信区间，调整因素包括性别、年龄、感染途径。

字体加粗者为数据有统计学差异，视分层因素而定。

7、TFSF13和TFRSF13B基因多态性与HCV感染慢性化的关联分析

经Logistic回归调整性别、年龄、病毒基因型和感染途径这些混杂因素后，未发现rs34562254、rs3803800和rs11552708的基因型分布频率与HCV感染慢性化有统计学相关（P均>0.05，见表3）。

8、rs34562254位点错义突变的影响

TFRSF13B基因rs34562254位点C/T突变，即TFRSF13B蛋白质序列251位脯氨酸（P,Pro）到亮氨酸（L, Leu）的突变，采用生物信息学在线工具I-Mutant（2.0版）（http://folding.uib.es/i-mutant/i-mutant2.0.html）对其进行突变效应分析，结果发现该位点的错义突变，将导致蛋白质结构的稳定性下降，推测其可能是rs34562254位点与HCV易感性相关的潜在分子机制。

综上所述，申请人认为，TFRSF13B基因rs34562254多态性与中国汉族人丙型肝炎遗传易感性相关，在具体实施中，可利用TFRSF13B基因rs34562254多态性制备筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感者的产品或检测或筛查与中国汉族人丙型肝炎相关的SP的产品，如将检测rs34562254的多态性/等位基因/基因型的物质（如表1所述Taqman PCR体系）与其他物质（如其它检测与丙型肝炎相关的SP/等位基因/基因型的物质）或仪器联用，制备筛查中国汉族人丙型肝炎遗传易感者的产品或检测或筛查与丙型肝炎相关的SP的产品，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

宜兴市人民医院

南京鼓楼医院

<120> TFRSF13B基因rs34562254 SP的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttctgcttc cctgagtgca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctgggatg tgtgggcaag 20

<210> 3

<211> 14

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggaccccc gacc 14

<210> 4

<211> 14

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgggaccct cgac 14

<210> 5

<211> 22

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctaacctt gaccctcttt cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaagcctc actcttctgt tt 22

<210> 7

<211> 17

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctccccact ctcccag 17

<210> 8

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<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctccccatt ctcccag 17

<210> 9

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<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctgaccca acaaacagag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatacccttc cccattctgg 20

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<211> 15

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctgtcccct gcagc 15

<210> 12

<211> 16

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctgtcctct gcagcc 16