一种从条纹拟海牛中提取的抑制肿瘤新生血管生成的化合物

一种从条纹拟海牛中提取的抑制肿瘤新生血管生成的化合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种从海洋动物条纹拟海牛中分离得到的抑制肿 瘤新生血管生成的化合物PhilinopsideA。

背景技术

条纹拟海牛Philinopsis lineolate Helbling et A.Adams为中国南海产的拟海牛科 动物。海牛自古作为药用，《本草原始》记载：“味咸，温，无毒，补肾益阳”(江苏新医 学院，中药大辞典P1925，上海人民出版社，上海，1977)。条纹拟海牛在我国南海有广 泛分布，资源丰富。有关条纹拟海牛的化学成分和药理活性迄今未有过报道。

发明内容

本发明的目的在于从条纹拟海牛中提取分离一种具有抑制肿瘤新生血管成的新化合 物。

本发明从条纹拟海牛中提取分离的新化合物，其化学结构式如下：

由于该化合物首次从条纹拟海牛中提取获得，故命名为PhilinopsideA。

PhilinopsideA的理化性状如下：白无定形粉末，熔点222-225(分解)，分子式 C₅₅O₂₂H₈₅SO₃a。电喷雾离子质谱1224[M+a+H]，1062[1224-glc]。红外光谱3419(OH)， 2932(CH₃，CH₃)，1747(C＝O)，1456和1375(CH₃，CH₂)，1233(酯键)，1039( C-O-C)。¹H和¹³C核磁共振数据见表1。

表1.PhilinopsideA的¹H和¹³C核磁共振数据

         δc         δH              HMBC             ¹³C     ¹H           HMBC 甙元部分1    36.2       1.42m，1.42m                糖部分xy1 1  105.7   4.80d，J＝7.0     C：3

    2    27.3       2.04m，1.87m                          2  83.8    4.11m

    3    89.3       3.34dd，J＝3，11  C：1xy1             3  76.4    4.09m

    4    39.8                                             4  75.3    5.19m(SO₃a)

    5    48.2       1.1.t，J＝7.6                         5  64.5  419m，4.86dd，J＝4，12

    6    23.5       2.05m                            Qui  1  105.3   5.14d，J＝7.6     C：2xy1

    7    120.5      5.74m                                 2  75.6    4.03m

    8    145.6                                            3  75.8    4.35m

    9    47.3       3.56br.d，J＝14.2                     4  86.1    3.69t，J＝9

    10   35.7                                             5  71.9    4.09m

    11   22.8       21.7m                                 6  18.0    1.82d，J＝6.2

    12   31.6       2.06m，2.24m                     xy1  1  105.6    4.93d，J＝7.6     C：4Gui

    13   59.5                                             2  73.9    3.80m

    14   47.6                                             3  87.2    4.27m

    15   43.9       1.86m，2.67m      C：13，21           4  69.0    4.22m

    16   75.1       6.04m                                 5  66.7    4.37m，3.75m

    17   54.9       2.7d，J＝9.3                     g1c  1  105.3   5.46d，J＝7.9      C：3xy1

    18   179.6                                            2  75.2    4.32m

    19   24.2       131s              C：9，10            3  88.1    3.78m

    20   85.2                                             4  70.7    4.11m

    21   28.5       1.67s             C：17，20，22       5  78.3    4.08m

    22   47.7       2.53m                                 6  62.1    3.83m，4.55dd，J＝2.1，1. 4，

    23   38.6       1.98m                           OCH₃ 54.7    3.88s

    24   124.4      5.19m

    25   132.1

    26   21.5       2.08s

    27   22 4       2.12s

    30   17.5       1.23s             C：3，4，5，31

    31   28.9       1.13s             C：3，4，5，30

    32   32.4       1.05s             C：8，13，14，15

    Ac169.9，21.5   1.96s xy1：木糖，Qui：喹喏糖，glc：葡萄糖，J值：Hz，HMBC：碳氢远程相关 同时，通过测定二维氢氢相关谱(DQCOSY)和碳氢相关谱(HMQC)和接力谱 (TOCSY)确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。通过测定OE 相关谱，确定了该化合物的立体构型如下： Philinopside A的立体构型和部分OE相关

本发明还提供了从条纹拟海牛中提取PhilinopsideA的方法，其步骤如下：

(1)提取：将原料条纹拟海牛(干品)浸泡于2.5-4倍重量的60-90％乙醇中，提 取30小时以上，重复提取2-4次，合并提取液，减压回收乙醇，浸膏混悬于30％乙醇 中，以乙醚萃取3-5次，乙醚萃取液弃去；下层乙醇液减压回收，得浸膏；浸膏溶于蒸 馏水中，通过大孔树脂柱，用水、50％乙醇和95％乙醇依次洗脱，95％洗脱液减压回收得 浸膏；

(2)分离：上述浸膏采用硅胶柱层析，以CH₂CL₂∶CH₃OH∶H₂O＝(6-10)∶(1.5-3)∶ 1的混合溶剂洗脱，收集含PhilinopsideA部分，再经Sephadex HL-20柱层析，以CH₂CL₂∶ CH₃OH＝(0.8-1.5)∶1混合溶剂洗脱，含PhilinopsideA部分再经C₁₈反相层析，以含水甲 醇作洗脱剂，得纯品。

本发明对PhilinopsideA进行了抑制肿瘤新生血管生成、体外抗肿瘤等实验，表明其 具有明显的抑瘤、抗瘤效果。

一、抑制肿瘤新生血管生成及受体酪氨酸激酶实验

材料和方法：DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，Y，USA)； matrigel购自Becton Dichinson，USA；抗酪氨酸磷酸化单克隆抗体PY-99，VEGFR-2多抗， PDGFR-β多抗购自Santa Cruz；羊抗鼠生物素标记IgG(H+L)，Horseradish-Peroxidase- Streptavidin聚合物购自Vector公司；多聚赖氨酸，刺激因子VEGF，PDGF-BB购自Sigma； HRP-羊抗鼠二抗购自Calbiochem；其它试剂为国产分析纯。

细胞培养：人微血管内皮细胞株(human microvascular endothelial cell line， HMEC-1)；IH-3T3购自American Type Culture Collection；VEGFR-2稳定高表达的3T3 细胞株由质粒转染得到。细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO₂孵 箱中培养。待细胞处于对数生长期时进行实验

1.内皮细胞增殖实验

HMEC-1细胞2*10³ cells/100μl/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓 度的A2，每个浓度三个复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。加药 在37℃、5％CO₂条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放 置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB (Sigma)4mg/ml溶液100μ1/孔，室温中染15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次， 空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪540nm波长下读数。

2.内皮细胞管腔形成抑制实验

Matrigel胶在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使 胶凝固。每孔加入HMEC-1细胞悬液5*10³ cells/100μl/孔。同时分别加入不同浓度A2， 使其最终浓度为5μM，1μM，0.2μM，0.04 μM。在37℃、5％CO₂、95％湿度下培养24小 时。在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(*100)，每个照片的管腔总长度用图形 处理软件Adobe Photoshop测量，并计算抑制率。

3.内皮细胞迁移抑制实验

1∶3倍稀释的Matrigel胶20μl铺于Transwell膜(8μm孔径Boyden Chamber transwell， Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥。将含不同药物浓度(5μM，1μM，0.2μM， 0.04μM)的HMEC-1细胞悬液2*10⁴ cells/100μl/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室 含相同浓度药物地DMEM培养基。37℃、5％CO₂、95％湿度下培养48小时。用棉签小心去 除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染。在相差显微镜(Olympus Japan)下观察 并拍照(*100)，随机选3个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率。

4.受体酪氨酸激酶自磷酸化抑制实验

(A)把高表达VEGFR-2的细胞约2*10⁴ cells/100μl(20％FBS/DMEM)种于96孔 用0.1％多聚赖氨酸包被的培养板中，待其长满，换无血清培养夜，饥饿24小时。加入不 同浓度的化合物，作用1h，用500ng/ml的VEGF刺激5-10分钟，倒去培液，用4％的多 聚甲醛常温下固定30分钟。然后依次用50％、75％、100％的乙醇溶液洗涤细胞脱水，常 温下干燥。用含5％BSA的T-PBS(0.2％Tween-20)封闭96孔板，依次加入抗酪氨酸磷 酸化抗体PY-99，羊抗鼠生物素标记IgG(H+L)，三抗Horseradish-Peroxidase-Streptavidin， 37℃各1小时，分别用T-PBS洗涤三次。最后加入底物ABTS，37℃孵育1小时，酶标仪 405nm读数。用150ng/ml PDGF-BB刺激IH-3T3细胞，PDGFR的受体磷酸化水平检测通 过同样方法进行。

(B)表达VEGFR-2的细胞约2*10⁴ cells/100μl(20％FBS/DMEM)种于96孔培 养中，待其长满，换无血清培养夜，饥饿24小时。加入不同浓度的化合物，作用1h，用 500ng/ml的VEGF刺激5-10分钟，加入100μl裂解液：HTG[20mM HEPES(PH 7.5)，150 mM aCl，0.2％TritonX-100，and 10％glycerol]和5mM a₃VO₄，2mM a₄P₂O₇，5mM EDTA 裂解细胞，转移到用VEGFR-2多抗包被过的酶标板中，37℃孵育2小时。0.2％的Tween-20 PBS洗涤三次。依次加入抗酪氨酸磷酸化抗体PY-99，HRP偶联的羊抗鼠二抗，分别用T- PBS洗涤三次。最后加入底物0.5mg/ml用0.1％H₂O₂，100mM柠檬酸，250mM a₂HPO₄ 配置的OPD，37℃孵育30分钟，酶标仪490nm读数。用150ng/ml PDGF-BB刺激IH-3T3 细胞，PDGFR的受体磷酸化水平检测通过同样方法进行。

上述实验结果表明，PhilinopsideA具以下显著活性：

1.能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖，其平均IC₅₀为1.60±0.48μM(n＝2)，作用效 果成明显量效关系。

2.能明显抑制内皮细胞的管腔形成，其IC₅₀为0.058±0.018μM(n＝2)，作用效果成明 显量效关系。

3.能明显抑制内皮细胞的迁移。其IC₅₀为0.046μM，作用效果成明显量效关系。

4.对两个与血管生成密切相关的酪氨酸激酶受体VEGFR-2，PDGFR-β的酪氨酸激酶活 性有明显的抑制作用，用方法A测得A2对VEGFR-2的IC₅₀为2.6+0.1μM(n＝2)；对PDGFR 的IC₅₀为4.9+0.3μM(n＝2)。

二、体外抗肿瘤实验

材料和方法：DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，Y，USA)； 磺酰罗单明B(sulforodamine B，SRB)，四氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；三氯醋酸(TCA) 和Tris base unbuffer均为国产分析纯。

细胞株：

P-388小鼠淋巴瘤  HL-60人白血病

MOL-4人白血病    A-549人肺癌

SPCA4人肺腺癌    SGC-7901人胃癌

MK-28人胃癌     HCT-116人结肠腺癌

BEL-7402人肝癌   MCF-7人乳腺癌

HO-8910人卵巢癌

1.SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96 孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐 水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，然后倾去 培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气干燥。最 后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标议520nm波长下测定OD值

2.MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90μl/孔接 种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三 个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用 生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/LHCL) 50μl/孔，于CO₂培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。

3.按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC₅₀值采用Logit法计 算。

           表2 Philinopside A对肿瘤细胞的抑制作用 浓度(μM)                           IC₅₀μM 细胞株  P-388 MOL-4 HL-60 A-549 MK-28 SPC-A4 SGC-7901 HCT-116 BEL-7402 MCF-7 HO-8910 A2      0.9±0.1 0.4+0.2 0.6±0.3 1.2+0.1 1.8±1 1.5±0.7 1.4±0.8 1.6±0.4 2.4+0.1 2.3+0.2 2.3±0.5 试验结果表明Philinopside A能明显抑制11株来源肿瘤细胞的增值，且作用效果成明显的 量效关系。

上述试验结果表明：PhilinopsideA可作为一种研制新的抗癌药物的先导化合物，可用 于制备抗癌药物。

具体实施方式：

下面通过实施例进一步描述PhilinopsideA及其制备

选择生长于中国南海海域的条纹拟海牛3400克(干品)，用10升70％乙醇浸泡72 小时，重复三次提取，合并浸出液，减压回收得浸膏约400克。浸膏混悬于2升30％乙 醇中，以2升乙醚分4次萃取，下层醇溶液减压回收，得醇浸膏240克。再溶于5升蒸 馏水中，通过大孔树脂柱，先用10升蒸馏水洗脱，再用5升50％乙醇洗脱，最后用5升 95％乙醇洗脱至无。95％乙醇洗脱液减压浓缩得浸膏14克，经胶硅反复柱层析，以 CH₂Cl₂∶CH₃OH∶H₂O-8∶2∶1混合溶剂洗脱，收集含PhilinopsideA部分，再经Sephadex LH -20柱层析，以CH₂Cl₂∶MeOH-1∶1洗脱，收集含PhilinopsideA部分，最后经C₁₈ Lobar 柱层析，以50％甲醇水溶液洗脱，得PhilinopsideA纯品140mg。

对该PhilinopsideA进行抑制肿瘤新生血管生成及受体酪氨激酶试验和体外抗肿瘤试 验，都获得较为满意的效果，具体过程和结果见前所述。