一种适应高渗透压、高铵离子、高乳酸生长环境的细胞

本发明属于细胞领域，具体涉及一种适应高渗透压、高铵离子、高乳酸生长环境的细胞。

随着基因组学，分子生物学以及现代医学的不断发展，生物医药产业也逐步展现出其特有的优势并在近十年来在国内取得了快速的发展，其中重组蛋白药物，特别是抗体类药物发展最为迅速，国内已经有一大批企业以及研究机构从事抗肿瘤，心血管，免疫疾病方向的抗体开发研究工作，多个抗体药物已经上市。

目前抗体类蛋白大都使用CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)作为生产用细胞株，因为CHO细胞相较于其它细胞具有不可比拟的优势，例如表达的抗体与其天然结构相似，其分离纯化方法便捷，也具有更好的生物安全性等等。作为抗体表达的宿主细胞，细胞的生长特性，表达量对生物药的成本和质量起到了决定性的作用，目前细胞表达抗体的水平还较低，工艺和生产成本都较高，从而导致了生物药价格居高不下。一方面是生产设备和耗材成本高，另一方面则是细胞生产水平较低。在生物发酵生产抗体类蛋白过程中，随着细胞产物和代谢物的增加，发酵液中的环境趋于极端，比如渗透压增加，铵离子、乳酸浓度增高，这都会导致细胞的死亡和活率下降，最终影响到细胞的产率降低。

目前已有的CHO细胞株一般只能在低渗透压(小于350mOsm)和(或)低氨离子浓度(小于7.5mM)和(或)低乳酸(小于2.5g/L)的培养环境中生长。培养基提供适当的生长环境供细胞生长，在此培养的过程中，使用者通过检测手段，获得细胞生长、生物质材料(蛋白，DA，细胞等)信息。细胞株的自身代谢和生物材料的分泌，导致培养基提供的适当环境被破坏，很多时候导致高渗透压(大于350mOsm)和(或)高氨离子浓度的培养环境(大于7.5mM)和(或)高乳酸(大于2.5g/L)的培养环境中。在这种培养环境中，细胞株无法正常生长，也不能生产生物材料。

本发明的目的提供一种适应高渗透压、高铵离子、高乳酸生长环境的中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL，该中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC o.18322。

鉴于目前已有的CHO细胞株一般只能在低渗透压(小于350mOsm)和(或)低氨离子浓度(小于7.5mM)和(或)低乳酸(小于2.5g/L)的培养环境中生长，本发明将运用合理的方式，驯化获得能够在高渗透压和(或)高氨离子浓度和(或)高乳酸的培养环境中生长的CHO细胞株，从而避免随着发酵过程的进行而导致细胞产量的降低，从而实现了本发明的目的。

本发明的第二个目的是提供所述的中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL作为生产菌株在生产抗体类蛋白产品中的应用。

优选，中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL作为生产菌株在高渗透压、高铵离子、高乳酸环境下生产抗体类蛋白产品中的应用。

优选，中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL作为生产菌株在≥350mOsm的渗透压、≥7.5mM的铵离子、≥2.5g/L的乳酸环境下生产抗体类蛋白产品中的应用。

本发明中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL可以在高渗透压(大于350mOsm)、高铵离子(7.5mM)和高乳酸(2.5g/L)环境中正常生长，从而避免随着发酵过程的进行渗透压增加，铵离子、乳酸浓度增高而导致CHO细胞的死亡和活率下降，最终影响到细胞产率降低的缺陷。

中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC o.18322。

图1是CHO-K1S细胞在不同渗透压的生长曲线，其中300、350、400、450、500分别代表在渗透压为300、350、400、450、500mOsm；

图2是CHO-K1S以及CHO-K1S-O-A生长曲线，其中300、350、400、450、500分别代表CHO-K1S细胞在渗透压为300、350、400、450、500mOsm的生长曲线，而400-A代表CHO-K1S-O-A细胞在渗透压为400mOsm的生长曲线；

图3是CHO-K1S以及CHO-K1S-O-AL生长曲线，其中300、350、400、450、500分别代表CHO-K1S细胞在渗透压为300、350、400、450、500mOsm，培养基为无血清培养基CD02的生长曲线，而400-A-AL代表CHO-K1S-O-AL细胞在渗透压为400mOsm、培养基为高铵离子和高乳酸筛选培养基下的生长曲线；

图4是CHO-K1S以及CHO-K1S-OAL-A生长曲线，其中300、350、400、450、500分别代表CHO-K1S细胞在渗透压为300、350、400、450、500mOsm，培养基为无血清培养基CD02的生长曲线，而400AL-A代表CHO-K1S-OAL-A细胞在渗透压为400mOsm、培养基为高铵离子和高乳酸筛选培养基下的生长曲线。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

本发明选用的细胞株为CHO-K1细胞(ECACC 85051005)。所使用的培养基为QuaCell公司的CHO细胞化学成分限定的无血清培养基CD02。

一、细胞悬浮驯化

1、实验目的

将CHO-K1(Lot:16H036)贴壁细胞驯化成悬浮细胞。

2、实验主要材料

DMEM/F12＝1:1培养基(Gibco/C1133050013T)、血清(ExCell Bio/11G355)、L-谷氨酰胺(源培生物)、CD02培养基(Quacell/36A01)、T75方瓶(BIOFIL/180624-104B)、T75方瓶(BIOFIL/180508-104)、125ml摇瓶(Corning/25818010)、500ml摇瓶(Corning/11818004)、冻存管(Corning/23618076)、5ml移液管(Corning/20118020)、25ml移液管(Corning/17218010)、50ml离心管(Corning/31518601)

3、实验流程

(1)、细胞扩增、保存

基础培养基溶液配制：DMEM/F12培养基(DMEM/F12＝1:1)+10％FBS+2mM Gln细胞复苏、扩增并保存：复苏CHO-K1(Lot:16H036)细胞，用上述基础培养基溶液传代扩增培养，当细胞总数达到一定数量后，对细胞进行冻存，总共冻存8支细胞。细胞命名为CHO-K1。

(2)、细胞悬浮驯化

a、细胞悬浮驯化培养基溶液主要成分为DMEM/F12培养基、FBS、CD02培养基、2mMGln，根据实验方案配制不同血清浓度比的细胞悬浮驯化培养基。

b、复苏上述冻存的CHO-K1细胞1支，用T75方瓶做细胞传代培养。当细胞汇合度达80％后做传代处理，弃上清、消化离心重悬，取一定的重悬细胞液加入细胞悬浮驯化培养基中进行培养(每次传代培养基血清浓度比例不同)，显微镜观察细胞长在形态，通过多次传代培养，让细胞逐渐悬浮(会有少量贴壁细胞)。

c、悬浮细胞扩增培养：将悬浮驯化后的细胞转移至125ml摇瓶中，加入新鲜CD02培养基(4mMGln)进行连续传代培养。传代细胞密度约3×105cells/ml，体积30ml。观察细胞在摇瓶中生长状态、检测细胞密度及活率等。

(3)、悬浮细胞保存

取上述扩增培养液适量，离心，弃上清，用细胞冻存液(92％CD02+8％DMSO)重悬，按细胞密度1×107cells/ml，每支1ml进行分装，共分装10支冻存管，用程序降温盒放到-80℃冰箱中，24h后转移至液氮中，由此得到悬浮驯化后的细胞。

4、实验结果：

实验结论：悬浮驯化后的细胞在摇瓶中传代两次后能正常生长，最高生长密度可达2.98×106cells/ml，活率97.67％，细胞悬浮驯化成功。

二、细胞单克隆筛选

1、实验目的

从步骤一的悬浮驯化后的细胞中挑选出一株稳定的单克隆细胞株以用于后续的驯化实验。

2、主要实验材料

单克隆培养基(SIGMA/SLBX8261)、CD02培养基(Quacell/36A01)、L-谷氨酰胺(源培生物)、125ml摇瓶(Corning/25818010)、500ml摇瓶(Corning/11818004)、冻存管(Corning/23618076)、5ml移液管(Corning/20118020)、25ml移液管(Corning/17218010)、50ml离心管(Corning/31518601)、96孔板(Corning/26018036)。

3、实验流程及结果

a、细胞复苏、传代：复苏一支步骤一的悬浮驯化后的细胞(序号为01)，用CD02培养基(4mMGln)进行培养，当细胞密度达到1×106cells/ml后进行传代培养，让细胞维持良好的生长状态(细胞活率保持在95％以上)。

b、细胞铺板(96孔板)：选择处于对数生长期的细胞100μl，经有限稀释后进行单克隆铺板，理论铺板密度为0.2cells/孔，加入单克隆培养基(4mMGln)200μl。一共铺板10个96孔板。

c、单克隆细胞孔观察：铺板完成后需要将96孔板放入培养箱中静置3h，利用solentim细胞成像仪看板，到单克隆细胞孔。单克隆细胞孔统计结果如下：

①:A02,A11,B05,C07,D10,F07,F09,H07

②:A05,B11,C03,D09,F05,G02

③:B03,B08,C11,D02,F06,G11,H02,H05,H11

④:C04,C06,D01,D04,E04,F02,F06

⑤:A02,A05,C06,C09,D06,E04,E11,H01,H11

⑥:C01,C05,C09,D05,E04,E08,F11,G04,H11

⑦:A11,A12,B09,B11,E08,F03,H07,H09

⑧:A02,B05,C08,D11,D09,E11,F08,H03,H08

⑨:B04,C08,C11,D02,D08,E04,E11,G03

⑩:A01,C02,E11,F05,F08,H03

d、挑选优质的单克隆细胞孔：当单克隆细胞长到96孔孔内1/4面积时对其进行取样，根据细胞形态和密度选择续保生长较好的单克隆细胞孔。结果如下：

①：C07,D10,F07,F09,H07

②：F05

③：F06

⑤：C06,E04

⑥：C01,C05,C09,D05,E04,E08,F11,G04,H11

e、单克隆细胞扩增：将上述选择的单克隆细胞孔内细胞进行吹散打匀后，放入96深孔板继续培养，加入1ml/孔的CD02培养基(4mMGln)；根据细胞生长形态、活率及密度挑选了其中5株单克隆细胞株6-G04、6-F11、6-E04、6-C01、6-C09进行后续培养。

f、单克隆细胞稳定传代并保存：将上述5株细胞用CD02培养基(4mMGln)以0.3×106cells/ml的传代密度进行扩增培养，传代培养3代后进行细胞冻存，每株细胞株冻存8支细胞。根据细胞生长形态、活率及密度挑选了6-G04进行后续加压驯化。

实验结论：从悬浮细胞中共挑选出5株稳定的单克隆细胞株，最终选择了6-G04这个细胞株用于后续的驯化实验，将6-G04细胞株命名为CHO-K1S细胞。

三、高渗透压驯化

在渗透压为300，350，400，450和500mOsm的CD02培养基(在CD02培养基中加入不同浓度的aCl，制备成不同渗透压的CD02培养基)中分别接种CHO-K1S细胞，接种密度为0.3×106cells/ml，共30ml，于200rpm，37摄氏度，5％二氧化碳细胞培养箱中培养，每天测定细胞密度和活率，并绘制生长曲线。

其生长曲线如表1和图1所示：

表1

从上述实验中的结果分析(表1)，将CHO-K1S细胞在第三天进行传代(细胞密度在2.0x 106cells/ml)，共计传代10次(传代培养初始密度(0.3-0.5)E+06，传代时的密度是(1.5-2.0)E+06，一般是生长2-3天。下同)，绘制第十代细胞在400mOsm CD02培养基中的生长曲线(表2和图2)，由此获得400mOsm渗透压驯化后的细胞，命名为CHO-K1S-O-A细胞(表2和图2中的400-A)。

表2

经过400mOsm渗透压驯化后的CHO-K1S-O-A细胞，其生长曲线和在正常培养基(300mOsm)中的几乎吻合，而细胞初次在400mOsm渗透压下培养时其生长曲线和在正常培养基中的差异较大。

四、高渗透压高乳酸高铵离子驯化：

以驯化成功的CHO-K1S-O-A细胞为宿主细胞，进行第二轮的适应高铵离子(7.5mM)以及高乳酸(2.5g/L)的培养环境驯化和筛选。

在无血清培养基CD02添加氯化钠、氯化铵和乳酸，使得铵离子最终浓度为7.5mM，乳酸为2.5g/L，渗透压为400mOsm，由此得到高铵离子和高乳酸筛选培养基。

首先进行的是确定CHO-K1S-O-A细胞在高铵离子和高乳酸筛选培养基中的生长情况，将CHO-K1S-O-A细胞(表3和图3中的400-A-AL)接种到高铵离子和高乳酸筛选培养基中，在渗透压为400mOsm下培养，记录其生长情况，具体见表3和图3。

表3

将CHO-K1S-O-A细胞接种到高铵离子和高乳酸筛选培养基中，在渗透压为400mOsm下培养，同样在第三天进行传代培养，共传代10次，以此稳定传代了10次的细胞作为宿主细胞，由此得到CHO-K1S-OAL-A细胞，再次将CHO-K1S-OAL-A细胞(表4和图4中的400AL-A)接种到高铵离子和高乳酸筛选培养基中，在渗透压为400mOsm下培养，记录其生长情况，具体见表4和图4。

表4

从表4和图4可以看出，经过驯化后的CHO-K1S-OAL-A细胞，其生长曲线和正常培养基(300mOsm，未添加氯化铵和乳酸)中的类似，细胞密度在不加补料的情况下达到6.3x106cells/ml，且在D8,D9时，细胞密度都要高于正常培养基(300mOsm)中的细胞，将此细胞命名为中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL。

由此可见，本发明在已有的CHO-K1细胞体中进行筛选，获得了可以在高渗透压(大于350mOsm)、高铵离子(7.5mM)和高乳酸(2.5g/L)环境中正常生长的的中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL。该中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1-OAL于2019年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC o.18322。