Octet BLI 小分子结合动力学检测实验设计Small Molecule Kinetics

Small Molecule Kinetics Assay:

概述：

Octet RED系列可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。该SOP的目的在于为小分子动力学检测提

供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。此外，该SOP假定所有使用者

已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。

考量及建议：

1. 采用RED系列检测小分子时，应当使用SSA nsor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该nsor是ForteBio公司目前唯

一具备检测小分子灵敏度的传感器。

2. 用于与小分子结合的蛋白或抗体必须生物素化。请参阅ForteBio技术说明书。

3. 建议assay buffer为PBS+5%DMSO；

4. 设置protocol时，须设置两组SSA nsor，运行中第1组为实际检测用nsor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭

后、用作阴性对照的nsor。

5. 至关重要的是，检测nsor与对照nsor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致-任何偏差将导致所得数据无法

于Octet RED软件上分析。

6. 用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。如蛋白

较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的

shift）。

7. 稀释样品，DMSO最终浓度为5%（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为

1mM，DMSO为5%）。

8. 建议对样品进行两轮筛选。例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精

细筛选：30,10,3.3,1.1uM，获取高度可信的Kd。（注意：所用浓度仅用于发挥导向性作用，实际浓度取决于初筛所

获得Kd）。实际实验中，在筛选前可采用1个相对高浓度样品或阳性对照，先测定相互作用有无，然后执行如上

筛选。

9. 注意：两组SSA nsor必须为同一批次。

1. 实验目的：

采用Octet RED检测小分子与蛋白间相互作用。

2. 实验材料：

2.1 仪器：

Octet RED；

2.2 传感器：

SSA传感器；

2.3 样品：

蛋白：MW（kDa），浓度，buffer（不可为Tris或其他含氨基的buffer），总量；小分子：MW（Da），浓

度，总量；

2.4 缓冲液：

Assay buffer=AB（一般为PBS）；

2.5 其他试剂与耗材：

biotin-LCLC-NHS，5mg/ml biocytin、 Greiner 96孔板，BSA，Tween-20， EP管，PD-10 Desalting

Columns（或Zeba™ Spin Desalting Columns），移液器1套。

3. 实验方法：

3.1 蛋白生物素化：

参阅ForteBio公司技术说明书。

3.2 样品配制：

4. 实验步骤：

4.1 按照操作须知打开电脑，开机；点开数据采集软件，初始化结束后仪器显示为Ready状态。选择Basic Kinetics，点

击右向图标进入protocol设置界面。

最大化，可看见流程化设置窗口，分别为Plate Definition，Assay Definition，Sensor Assignment，ReView Experiment和

Run Experiment ：

4.2 Plate Definition:在该窗口定义如何加样，对于小分子检测，可排列如下:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A AB Biotin-P BCT AB AB AB AB AB S1 S2 S3 S4

B AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

C AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

D AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

E AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

F AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

G AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB Sa Sb Sc Sd

H AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB AB AB AB AB

AB=Assay buffer, Biotin-P=biotin-protein, BCT=biocytin, S=sample;1,2,3,4 and a,b,c,d are different concentrations from low to

high.

左键点击左上方微孔板列标数字1，随即点击右键弹出如下样品类型菜单，根据如上样品排列，选择类型依次为

Buffer，Loading，Quench，Buffer，Buffer，Buffer，Buffer，Buffer，Sample，Sample，Sample，Sample。H行9-12列设

为buffer。

依此类推，将样品及所用试剂信息尽量填写完整：

在该窗口右上侧将样品浓度单位调整合适，输入样品浓度；按照样品板排列加样，注意：微孔板须

采用ForteBio推荐厂家与货号。

如样品浓度为倍比稀释，可按照如下操作，填写最高（或最低）浓度，除以（或乘以）稀释因子即可：

左键选中填写框后右键弹出上图所示菜单，选择Set Well Data，

本例中最高浓度为100uM，从低到高检测，因此起始值为100，除以2，选择Up，点击OK即可：

4.3 Assay Definition:在该窗口定义操作类型及运行步骤；

在Step Data List下点击Add，添加所需检测步骤：

运行第1步，nsor从nsor tray到样品板第1列buffer中检测基线，然后loading，因此添加步骤选择Loading，时间

设置为300s（loading时间可根据预实验确定；在完全未知时，可以根据需要设置为120s，180s或300s，不要太短或太

长即可），点击OK确定。

添加Quenching步骤，时间60s，